溶菌酶對熱應激肉雞腸道炎癥和氧化應激的影響

■梅 迪 王金龍 張大偉 張宗國 高媛媛 孫同毅 王 政*

（1.濰坊醫(yī)學院生命科學與技術學院，山東省蛋白質與多肽藥物工程實驗室，山東濰坊 261053；2.青島根源生物技術集團有限公司，國家企業(yè)技術中心，山東青島 266000；3.濰坊醫(yī)學院藥學院，山東濰坊 261053）

熱應激是影響肉雞生產(chǎn)的一個重要因素，研究表明，當飼養(yǎng)環(huán)境為30～35℃時，肉雞的攝食量會減少，影響肉雞的肉品質和生長速度[1]，當肉雞處于熱應激狀態(tài)時，有少部分的腸腔內毒素、共生菌和致病菌可以穿過上皮緊密連接進入血液循環(huán)，刺激局部腸道上皮細胞，影響肉雞的正常生長[2]。因此，在高溫的飼養(yǎng)條件下對肉雞進行抗菌干預十分必要。傳統(tǒng)抗生素濫用導致的耐藥菌出現(xiàn)，同時藥物殘留問題一直限制了抗生素的使用，因此，尋找安全性高、無殘留的抗生素替代品顯得十分迫切[3]。

溶菌酶是生物體內具有殺菌和免疫調節(jié)等功能的非特異性免疫分子。是機體對抗微生物入侵的天然防御分子[4]，研究表明，飼料中添加溶菌酶還能提高肉雞免疫力以及促進增重等效果[5]，目前溶菌酶添加飼料相關研究尚處于起步階段，在飼料中添加溶菌酶對肉雞腸道健康的影響研究較少。本研究旨在研究飼料中添加溶菌酶對肉雞腸道健康的影響，為溶菌酶在肉雞飼養(yǎng)中的推廣和應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和試驗動物

溶菌酶（2.0×105IU/g）由青島根源生物技術集團有限公司（中國青島）提供，肉雞（ROSS 308）購自當?shù)剞r(nóng)場（中國青島）。RNA提取試劑盒提?。═akara Bio，Shiga，Japan），反轉錄試劑盒（TaKaRa Bio），血清超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）試劑盒購買自上海紀寧生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

800只1日齡的肉雞（400只雌性，400只雄性）被隨機分成4組（TN、HS、HS-AB和HS-L），每組10個重復，每個重復20只，TN組（熱中性組），HS組（熱刺激組），HS-AB組（抗生素添加熱刺激組），HS-L組（溶菌酶添加熱刺激組）。試驗動物被飼養(yǎng)在1.5 m×1.5 m的雞籠中，雞籠中有新鮮的木屑和稻殼（1∶1），試驗動物可以自由獲得顆粒飼料和水。第1 d的飼養(yǎng)條件溫度為（35±1.1）℃，相對濕度為（65±5）%，隨后飼養(yǎng)環(huán)境的溫度每周降低2.8℃，直到第21 d時達到26.7℃，將26.7℃和（65±5）%的相對濕度定義為TN區(qū)域，從21 d開始，TN組的肉雞飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在26.7℃，另外3組（HS-AB、HS和HS-L）受到每天8 h 35℃和75%相對濕度的循環(huán)熱刺激，時間從第22 d持續(xù)到試驗結束的第42 d。TN組和HS組肉雞飼喂正常的玉米-豆粕型飼糧，HS-AB組和HS-L組分別喂養(yǎng)添加金霉素（300 g/t）和溶菌酶（625 g/t）的飼料。飼料中的抗生素或溶菌酶在飼料成粒以前加入，本研究使用的飼料不含抗生素或抗球蟲藥物，標準都滿足或超過1994年國家研究委員會的要求，配方飼料如表1所示。在試驗的第42 d測定各組肉雞的生長性能，每組隨機選取6只肉雞屠宰。動物試驗處理與使用規(guī)程獲得青島農(nóng)業(yè)大學動物倫理與使用委員會批準。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 樣品收集

取出十二指腸和梅克爾憩室之間的空腸樣本，用冰生理鹽水輕輕沖洗。試驗需要的腸黏膜標本，使用無菌玻片輕輕刮拭黏膜表面，分析腸黏膜炎癥因子mRNA表達水平的變化。使用冰生理鹽水沖洗空腸樣本，分析緊密連接mRNA表達水平的變化。將所有腸道樣本快速在液氮中冷凍，并保存在-80℃以進一步分析。采集的血液樣本，2 000×g，4 ℃、離心20 min，收集血清，保存在-20℃，待進一步分析。

1.4 血清抗氧化狀態(tài)分析

血清超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）含量使用上海紀寧生物科技有限公司的試劑盒進行檢測。

1.5 實時定量PCR

總RNA使用RNA提取試劑盒提取。使用Nano-Drop-1 000超微量分光光度計260/280 nm吸光度比值來檢測RNA的濃度和純度。根據(jù)試劑盒廠家提供的試驗流程采用7 500 Fast Dx實時熒光定量PCR儀進行實時聚合酶鏈反應。目的基因和管家基因引物序列如表2所示?？偡磻w系體積為20 μL，包括2 μL濃度為1 200 ng/μL的cDNA、0.8 μL濃度為10 μmol/L的引物、10 μL的2×SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ以及6.4 μL無RNA酶水。PCR儀循環(huán)條件為95℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)44次。

表2 用于PCR反應設計的引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0用于數(shù)據(jù)分析。在4組間進行方差分析，進行Duncan’s檢驗確定治療間的顯著性。統(tǒng)計顯著性的是基于P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 空腸黏膜炎癥因子mRNA水平的變化（見表3）

由表3可知，經(jīng)熱應激處理后，肉雞空腸黏膜中相關炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS mRNA水平明顯提高（P＜0.05）。與熱應激組相比，HS-AB組IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），TNF-αmRNA的表達水平顯著提高（P＜0.05）；HS-L組IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），TNF-αmRNA的表達水平無明顯改變（P＞0.05）。

表3 對空腸黏膜炎癥因子mRNA表達水平的影響

2.2 空腸標本緊密連接mRNA表達水平（見表4）

由表4可知，經(jīng)環(huán)境高溫處理后，空腸黏膜緊密連接相關蛋白 Claudin-1、Claudin-5、Occludin以及ZO-1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。與熱應激組相比，HS-AB組Claudin-1、Claudin-5以及ZO-1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），Occludin mRNA表達水平無顯著變化（P＞0.05）；HS-L組Claudin-1、Claudin-5以及ZO-1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），Occludin mRNA表達水平無顯著變化（P＞0.05）。

表4 空腸標本緊密連接mRNA表達水平

2.3 溶菌酶對熱應激肉雞回腸絨毛高度和隱窩深度的影響（見表5）

由表5可知，經(jīng)環(huán)境高溫處理后，肉雞回腸絨毛高度顯著變短（P＜0.05），隱窩深度顯著變深（P＜0.05），腸絨毛高度/隱窩深度比率顯著變小。與熱應激組相比，HS-AB組肉雞回腸絨毛高度顯著變高（P＜0.05），隱窩深度顯著變淺（P＜0.05），腸絨毛高度/隱窩深度比率顯著變大（P＜0.05）；HS-L組肉雞回腸腸絨毛高度顯著變高（P＜0.05），隱窩深度顯著顯著變淺（P＜0.05），腸絨毛高度/隱窩深度比率顯著變大（P＜0.05），基本恢復到正常水平。

表5 溶菌酶對熱應激肉雞回腸絨毛和隱窩深度的影響

2.4 溶菌酶對熱應激肉雞狀態(tài)抗氧化水平的影響（見表6）

由表6可知，經(jīng)環(huán)境高溫處理后，肉雞血清中MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px和TAOC含量無顯著變化（P＞0.05）。與熱應激組相比，HS-AB組肉雞血清中MDA水平顯著降低（P＜0.05），GSH-Px和TAOC含量顯著升高（P＜0.05）；HS-L組肉雞血清中MDA水平顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px和TAOC含量顯著升高（P＜0.05）。

表6 溶菌酶對熱應激肉雞血清抗氧化指標的影響

3 討論

3.1 溶菌酶對熱應激肉雞空腸黏膜炎癥因子mRNA表達水平的影響

當動物處于應激狀態(tài)或腸道發(fā)生炎癥時，有少部分的腸腔內毒素、共生菌和致病菌可以穿過上皮緊密連接進入血液循環(huán)，刺激局部腸道上皮細胞和免疫組織分泌炎癥因子。而溶菌酶能夠下調致炎因子的表達緩解腸道炎癥的發(fā)生，效果達到抗生素相似水平[6]。熱應激導致肉雞生產(chǎn)性能下降與炎癥因子升高存在著相關關系，腸道炎癥因子釋放之后，會繼發(fā)急性期應答反應，肝細胞會轉向生成急性期蛋白，肌肉組織分解代謝加強，并且宿主的食欲喪失，從而使動物的生產(chǎn)性能下降[7]?？股仡惿L促進劑的作用機制之一就是可以抑制腸道炎癥細胞的分泌并降低致炎因子的表達，同時抑制趨化作用，減少活性氧的產(chǎn)生，因此肉雞飼料中添加溶菌酶有利于提高動物的生產(chǎn)性能。

3.2 溶菌酶對熱應激肉雞腸緊密連接mRNA表達水平的影響

腸道緊密連接相關蛋白是腸道屏障功能的重要結構基礎，在保持肉雞腸道健康方面發(fā)揮了重要的功能。研究表明，肉雞養(yǎng)殖中許多疾病的發(fā)生發(fā)展與腸道屏障功能的異常密切相關。Chang等[8]研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌感染使肉雞腸道中Occludin和Claudin基因表達下調。腸道在熱應激條件下肉雞腸道的血流量減少，血液從內臟中分流至皮膚表面加快熱量的散失，但這會使腸道缺血，引發(fā)ATP耗竭，導致酸中毒并改變離子泵的活性，從而造成腸細胞死亡，并使細胞旁通透性增加[9-10]，同時血流量減少容易導致氧化應激和亞硝化應激，這將使上皮細胞膜和緊密連接的完整性被破壞[11]。添加溶菌酶上調了腸道緊密連接蛋白的mRNA表達水平（Occludin除外），改善了腸道屏障的完整性。

3.3 溶菌酶對熱應激肉雞腸道形態(tài)的影響

腸絨毛是小腸黏膜表面上皮和固有層向腸腔內伸出的細小突起，這種腸道形態(tài)結構增加了動物機體對營養(yǎng)成分吸收的吸收面積[12]，隱窩深度反映了隱窩細胞的增值率和成熟度，隱窩細胞生長速度變慢會導致腸絨毛萎縮，從而影響腸道對營養(yǎng)物質的吸收效率[11]。高溫等應激會引起肉雞腸道形態(tài)變化，尤其是會引起腸黏膜的損傷和絨毛形態(tài)的變化，破壞了腸道形態(tài)結構（絨毛高度縮小，而隱窩深度升高）。溶菌酶在動物飼料中添加具有良好的應用效果，王壇等[13]在羅非魚飼料中添加溶菌酶能夠提高羅非魚的生長性能，同時能夠促進羅非魚腸道的發(fā)育和健康。Oliver[14]研究表明飼料中添加溶菌酶可以顯著增加幼豬空腸絨毛高度。May等[15]研究發(fā)現(xiàn)在幼豬飼料中添加溶菌酶可以顯著增加幼豬空腸長絨毛高度和隱窩深度，這有利于幼豬對營養(yǎng)物質的吸收。本研究中溶菌酶顯著提高了絨毛高度與隱窩深度比值，增強了肉雞對營養(yǎng)物質吸收的能力。

3.4 溶菌酶對熱應激肉雞抗氧化水平的影響

熱應激會誘導動物機體產(chǎn)生大量的活性氧ROS，造成脂質、蛋白質和核酸的氧化損傷[16]。熱應激可能使線粒體呼吸鏈復合物的功能出現(xiàn)缺陷，從而造成線粒體損傷，或者下調家禽解偶聯(lián)蛋白的表達水平，從而促使動物發(fā)生氧化應激[13-14，17]。溶菌酶顯著升高了SOD、GSH-Px和TAOC的水平，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，因此可以作為檢測細胞受到氧化損傷嚴重程度的指標之一[18]。Abdel-Latif等[19]的研究表明肉雞飼糧中添加外源溶菌酶，特別是在基礎飼糧中添加90 g/t溶菌酶時，可改善肉雞的生長性能、腸道抗氧化狀態(tài)和非特異性免疫功能。熱應激使MDA水平顯著升高，而溶菌酶顯著降低了MDA水平，避免了肉雞因高溫應激產(chǎn)生氧化損傷。

4 結論

本研究結果表明，飼料添加溶菌酶能夠提高熱應激肉雞的生長性能，緩解腸道炎癥的發(fā)生，提高營養(yǎng)物質的吸收效率并改善腸道形態(tài)。