小兒七星茶顆粒中甘草酸含量測(cè)定的不確定度研究

駱海春,陸雪芳,朱飛如,馮俊富（.北海市食品藥品檢驗(yàn)所,廣西 北海 536007;.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 5300）

小兒七星茶顆粒的主要成分為薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹葉、鉤藤、蟬蛻、甘草。七藥合用，主治小兒開(kāi)胃消滯，清熱定驚。用于小兒積滯化熱，消化不良，不思飲食，煩躁易驚，夜寐不安，大便不暢，小便短赤[1]。其中甘草的活性成分為甘草酸，具有顯著改善患兒免疫功能的效果。甘草酸含量測(cè)定中受測(cè)定工具的影響較大，常規(guī)測(cè)定方法無(wú)法收到滿意的效果，而UPLCMS/MS法的實(shí)施，配合不確定度影響，也更能提升藥物的含量[2]。本研究為分析小兒七星茶顆粒中甘草酸含量測(cè)定的不確定度，特就小兒七星茶顆粒進(jìn)行受試分析，相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)告如下。

1 一般材料與方法

1.1 一般研究材料 采用醫(yī)學(xué)研究驗(yàn)證法，選擇化學(xué)室接受小兒七星茶顆粒中甘草酸含量測(cè)定的40例樣本進(jìn)行研究，按照UPLCMS/MS法應(yīng)用與否，就受試樣本的不確定度進(jìn)行分析。

1.2 方法 對(duì)照組為常規(guī)檢測(cè)組，研究組為UPLC-MS/MS法測(cè)定組，臨床觀察二者含量檢測(cè)不確定度符合情況并建立不確定度計(jì)算方法。

對(duì)照組：應(yīng)用甘草浸膏粉—甘草酸的測(cè)定—毛細(xì)管區(qū)帶電泳法對(duì)受試樣本進(jìn)行測(cè)定，甘草酸與甘草酸轉(zhuǎn)化器和甘草酸酶混合物反應(yīng)形成中間體，中間體與高度特異的探針?lè)磻?yīng)產(chǎn)生顏色，在OD=450nm時(shí)可被檢測(cè)到。

該產(chǎn)品可以檢測(cè)到低于20μm的甘草酸。

甘草酸測(cè)定方案概述：①在井中添加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品；②加入甘草酸轉(zhuǎn)換器，孵育1小時(shí)；③加入反應(yīng)混合物，孵育1小時(shí)；④分析與孔板。

研究組：使用KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸（20∶80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)276nm，柱溫為室溫；甘草酸流動(dòng)相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1），檢測(cè)波長(zhǎng)252nm，柱溫為室溫。二者流速均為1.0ml·min-1，采用外標(biāo)法定量測(cè)定；采用UPLCMS/MS法測(cè)定薯蕷皂苷元和齊墩果酸在不同濃度(0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1mmol/L)甘草酸水溶液中的溶解度，并繪制溶解度曲線；在甘草酸濃度為0-1mmol/L范圍內(nèi)，薯蕷皂苷元和齊墩果酸的溶解度均隨甘草酸濃度的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)甘草酸溶液的濃度達(dá)到1mmol/L時(shí)，薯蕷皂苷元的溶解度增加約60倍(6.15→360.59ng/mL)；齊墩果酸的溶解度增加約60倍(20.09→1155.36ng/mL)。

對(duì)同一量，進(jìn)行多次計(jì)量，然后算出平均值。對(duì)于偏離平均值的正負(fù)差值，就是其不確定度。其差值越大，則計(jì)量的不確定度就越大。

在數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)上，一般用方差（S）來(lái)表示：S2＝｛(x1－X)2+(x2-X)2+(x3-X)2……＋(xn-X)2｝/(n-1)。注：X為平均值，n為測(cè)量的次數(shù)。

方差越大，其不確定度則越大；方差越小，其不確定度就越小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用DAS 2.0.1版對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料和計(jì)量資料分別用（%）、（±s）表示，用χ2、t檢驗(yàn)，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組檢測(cè)不確定度符合率情況 研究組檢測(cè)不確定度符合率為95.00%（19/20），對(duì)照組檢測(cè)不確定度符合率情況為80.00%（16/20），統(tǒng)計(jì)學(xué)意義特征對(duì)比明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組檢測(cè)不確定度符合率情況比較（n/%）

2.2 UPLC-MS/MS法測(cè)定甘草酸含量不確定度分析 根色譜柱為Eurospher 100-5 C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：室溫；流動(dòng)相為乙腈∶0.05mol·L-1磷酸(二乙胺調(diào)pH=5)=70∶30；流速為1.0ml·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：264nm。結(jié)果：在該條件下，甘草酸主峰和雜質(zhì)得到很好的分離，甘草酸濃度在10-200μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性，r=0.9999；平均回收率為98.1%，RSD=0.73%；甘草酸溶液在室溫避光條件下放置5h內(nèi)保持穩(wěn)定。

3 討論

小兒七星茶顆粒中甘草酸含量測(cè)定中，通過(guò)建立UPLC-MS/MS法甘草酸模型，分析影響含量不確定度的因素，更能提升標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度[3-4]。

王彥帥[5]等人的研究成果進(jìn)一步表明，建立經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法，為物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)；采用ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)色譜柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為0.2ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫為30℃；甘草酸3.51-35.10μg·ml-1(r=0.9998)，平均回收率為94.78%(RSD=1.72%)、96.84%(RSD=1.85%)(n=6)；桑皮苷對(duì)照組、甘草苷、甘草酸銨含量測(cè)定方法的平均加樣回收率分別為97.82%、97.40%、105.81%，RSD分別為4.41%、2.51%、1.19%，均滿足《中國(guó)藥典》2015年版要求，3種成分分別在25.25-2525、25-2500、8.5-850ng線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。對(duì)10批次瀉白散物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行含量測(cè)定，其中甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果分別為0.1-1.6mg/g。高效液相色譜法測(cè)定小兒七星茶顆粒中甘草酸含量的不確定度；以Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7μm，2.1mm×50mm）分離，乙腈和水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.5mL·min-1[6]。用液相色譜法測(cè)定，生藥分析方法：將甘草制成粉末，取該粉末約0.5g，精密稱定，置入容量為50ml的離心管內(nèi)，加流動(dòng)相25ml，裝上流冷凝管后，在85℃的水浴上加熱15分鐘，冷卻后進(jìn)行離心分離，將上清液移置50ml的容量瓶中。殘?jiān)偌恿鲃?dòng)相提取兩次，每次加10ml振搖5分鐘，離心分離，將其上清液并入上述容量瓶中，最后加流動(dòng)相至刻度，作為樣品溶液。此外，取甘草酸單銨鹽對(duì)照品約0.06克，精密稱定，置入50ml的容量瓶中，加流動(dòng)相溶解后調(diào)至刻度。準(zhǔn)確量取該液25ml置入50ml容量瓶中，加流動(dòng)相調(diào)至刻度，作為對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確取樣品溶液和對(duì)照品溶液各10ml注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定各溶液中甘草酸的峰面積，并由此計(jì)算樣品中甘草酸含量，甘草酸單銨鹽換算成甘草酸的換算系數(shù)為0.9797。對(duì)三個(gè)不同產(chǎn)地的甘草樣品進(jìn)行分析，測(cè)得甘草酸的含量[7]。建立不確定度計(jì)算方法，在HPLC法測(cè)定該藥物中芍藥苷和甘草酸的合成不確定度、擴(kuò)展不確定度。芍藥苷和甘草酸含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比分別為0.032mg·g-1VS 0.030mg·g-1、0.064mg·g-1VS 0.060mg·g-1、(3.514±0.064)mg·g-1VS (2.987±0.060)mg·g-1[8]。成功建立炙甘草UPLCMS/MS指紋圖譜分析方法，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)，選擇對(duì)照組CQUITY UPLC 研究組EH C18色譜柱(1.7μm，100mm×2.1mm)，以乙腈-0.2%甲酸水作為流動(dòng)相，梯度洗脫80min，分別獲得不同批次炙甘草及葛根芩連湯不同配伍組的色譜圖；建立了炙甘草UPLC-MS/MS指紋圖譜，確定了12個(gè)共有峰，指認(rèn)12號(hào)峰為甘草酸銨[9]。

綜上所述，UPLC-MS/MS法的實(shí)施，對(duì)提升小兒七星茶顆粒中甘草酸含量測(cè)定確定度具有顯著的效果，值得在化學(xué)室的研究中加以推廣實(shí)施。