動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑LC-MS/MS檢測(cè)方法概論

摘 ? ?要：β-受體激動(dòng)劑作為食品源動(dòng)物中的禁用藥，需要被嚴(yán)格監(jiān)督與管控。時(shí)隔十年，今年的“315”晚會(huì)又爆出“瘦肉精”事件，說明瘦肉精監(jiān)管形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻。因此，尋求一種易于采集的瘦肉精生物樣本和高效、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)方法顯得十分緊迫。動(dòng)物毛發(fā)易于采集，且其中的藥物殘留量高、不易消除、監(jiān)測(cè)窗久，而LC-MS/MS檢測(cè)方法提取過程相對(duì)簡(jiǎn)單，且具有高靈敏度和準(zhǔn)確度?；诖?，本文對(duì)近幾年國內(nèi)研究的具有代表性的利用LC-MS/MS檢測(cè)動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑的方法進(jìn)行了比較和分析，在靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度方面，LC-MS/MS法都已經(jīng)達(dá)到一定程度的成熟，可以滿足一定的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：β-受體激動(dòng)劑;獸藥殘留;LC-MS/MS;動(dòng)物毛發(fā)

中圖分類號(hào)：S859.84 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.008

Introduction to LC-MS/MS Methods for the Detection of β-Receptor Agonists in Animal Hair

YI Shuping

（Center of Agricultural Products Quality Inspection and Monitoring，Cangzhou Agricultural and Rural Bureau in Hebei Province， Cangzhou， Hebei 061000， China）

Abstract： As the banned drugs in food-derived animals， the β-receptor agonists need to be strictly monitored and controlled. After a lapse of ten years， the 2021 World Consumer Right Day broke out the incident of illegal use of β-receptor agonists， indicating that the supervision situation of β-receptor agonists is still very severe. Therefore， it is urgent to find an efficient， accurate and convenient detection method for β-receptor agonists from an easy-to-collect biological sample. The animal hair is easy to collect， and the monitoring window of drug residue is long because of the high level of drug residue in the hair. Moreover， the extraction process of LC-MS/MS detection method is relatively simple， highly sensitive and accurate. The manuscript compared and analyzed the representative LC-MS/MS methods for the detection of the β-receptor agonists in animal hair in recent years， and the results indicated that LC-MS/MS methods have reached a certain degree of maturity in terms of sensitivity， precision and accuracy， which could meet certain testing requirements.

Key words： β-receptor agonists; residue of veterinary drugs; LC-MS/MS; animal hair

β-受體激動(dòng)劑，俗稱“瘦肉精”，可用于防治人和動(dòng)物的支氣管哮喘和痙攣，因能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、營養(yǎng)重分配，提高胴體瘦肉率，而被用作食品動(dòng)物生產(chǎn)環(huán)節(jié)的促生長(zhǎng)添加劑[1]。但過量使用此類藥物會(huì)在動(dòng)物可食性組織中造成獸藥殘留和蓄積，人在大量或長(zhǎng)期食用該獸藥殘留的動(dòng)物組織后，可能會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、頭疼、嘔吐等不良反應(yīng)，對(duì)高血壓、心臟病和甲亢等疾病患者的危害極大，嚴(yán)重者可致死亡[2]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)明確將β-興奮劑（β-agonists）類及其鹽、酯列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其它化合物清單[3]。

然而，在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)節(jié)，瘦肉精的使用仍屢禁不止。繼2011年“315”晚會(huì)上曝光的“健美豬”事件，2021年的“315”晚會(huì)又曝光了違禁使用瘦肉精的現(xiàn)象，瘦肉精監(jiān)管工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

近年來，針對(duì)β-受體激動(dòng)劑開展的檢測(cè)項(xiàng)目和方法很多，但監(jiān)管的靶標(biāo)主要以動(dòng)物可食性組織和尿液為主。但實(shí)際上，動(dòng)物可食性組織的采集需在屠宰之后，具有很大的局限性;且由于檢測(cè)的時(shí)滯性，即便檢出不合格，對(duì)于已流入市場(chǎng)的不合格樣品也難以做到及時(shí)有效的管控[4]。尿液的采集非常復(fù)雜且對(duì)采樣人員要求較高，在收集過程中易對(duì)動(dòng)物造成創(chuàng)傷，嚴(yán)重會(huì)致動(dòng)物憋悶死亡。此外，有研究表明，無論是尿液、血液還是可食性組織，在動(dòng)物停藥一段時(shí)間后，由于新陳代謝，獸藥殘留量會(huì)低于許多檢測(cè)方法的檢出限，致使無法檢出，成為了不法養(yǎng)殖逃避監(jiān)管的漏洞[5]。

針對(duì)監(jiān)管中的難點(diǎn)、痛點(diǎn)，檢測(cè)手段也在不斷與時(shí)俱進(jìn)。有研究表明，β-受體激動(dòng)劑在被動(dòng)物攝入后，主要經(jīng)由尿液排出體外，除了血液，在多種組織器官，如肌肉、內(nèi)臟、毛發(fā)、眼等均有殘留[6]。其中，毛發(fā)與其它生物樣本相比，生物結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)規(guī)律獨(dú)特，β-受體激動(dòng)劑與黑色素存在較高親和力，在毛發(fā)形成過程中，β-受體激動(dòng)劑可能通過與黑色素結(jié)合，參與毛纖維的形成，從而與毛纖維緊密結(jié)合，不易從毛發(fā)中消除，殘留量高，監(jiān)測(cè)窗久[7-9]。且毛發(fā)易于采集，對(duì)動(dòng)物無創(chuàng)傷，這些特點(diǎn)使得毛發(fā)可以成為一種很好的檢測(cè)靶標(biāo)。

目前，已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、生物傳感器法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）等[7]。其中，LC-MS/MS法相比于ELISA法、生物傳感器法，其準(zhǔn)確度（定性）和靈敏度（定量）都更高。GC-MS法中，由于氣相色譜對(duì)目標(biāo)化合物有低沸點(diǎn)的要求，往往需要在樣品前處理過程中進(jìn)行復(fù)雜的衍生化操作，而LC-MS/MS法相對(duì)簡(jiǎn)單。因此，本文主要對(duì)近幾年國內(nèi)報(bào)道的動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑的LC-MS/MS檢測(cè)方法進(jìn)行了比較、分析和總結(jié)，旨在為動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑在實(shí)際檢測(cè)分析中提供更多有意義的參考和借鑒，也會(huì)在接下來的實(shí)際工作中探索進(jìn)一步優(yōu)化和簡(jiǎn)化檢測(cè)方法的可能性。

1 樣品制備方法

因?yàn)閯?dòng)物毛發(fā)長(zhǎng)時(shí)間暴露在外部環(huán)境中，會(huì)接觸到各種各樣的環(huán)境污染，因此即使在相對(duì)干凈區(qū)域采集的樣本，在樣品制備時(shí)也要先實(shí)施清洗，以盡可能去除外源干擾物[5]。

目前LC-MS/MS檢測(cè)法中常用到的洗滌劑有1% SDS（十二烷基磺酸鈉）、1%吐溫-80溶液、甲醇等，最后用水將洗滌劑洗凈，可以配合超聲清洗。洗凈后可以選擇自然風(fēng)干，或者40～50 °C烘干[10-13]。干燥后剪成適宜長(zhǎng)度的小段備用。市面上也有毛發(fā)研磨器在售賣，但是對(duì)于含油脂成分比較多的毛發(fā)，如羊毛等，在實(shí)際中研磨效果不是很理想，常常需要配合液氮使用，成本昂貴，操作復(fù)雜，不太容易實(shí)現(xiàn)大范圍推廣使用。

2 提取方法

因?yàn)槊l(fā)獨(dú)特的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，β-受體激動(dòng)劑在被攝入后進(jìn)入體液，或和血漿蛋白結(jié)合，或呈離子狀態(tài)，和細(xì)胞中的其它組分，如黑色素、蛋白質(zhì)等相互作用，保留在角質(zhì)纖維中[14]。若想將藥物從毛發(fā)緊湊、堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)中釋放出來，需要通過水解破壞毛發(fā)結(jié)構(gòu)。

目前LC-MS/MS檢測(cè)方法中用到的水解手段主要有酸水解法、堿水解法以及酶水解法。

2.1 酸水解法

酸水解法條件相對(duì)溫和，適用范圍較廣，釋放效率較高。目前用到的水解物有0.1～0.6 mol·L-1鹽酸、0.2 mol·L-1三氟乙酸等，水解條件為47～70 °C消化[15-19]。有研究表明，用酸和甲醇/二硫蘇糖醇的混合溶液，能減少水解時(shí)間，提高效率[20]。

蘇曉鷗和沈建忠[10]在其研究中用的0.1 mol·L-1的鹽酸溶液水解。60 °C下溫育過夜，水解時(shí)間較長(zhǎng)，但酸水解后無需再用其它試劑進(jìn)行提取或者置換，直接進(jìn)行凈化處理。

2.2 堿水解法

堿水解法可使毛發(fā)完全溶解，藥物釋放完全，但水解條件較激烈，不適合對(duì)含不穩(wěn)定化合物的樣品進(jìn)行處理。目前使用的水解物主要有0.1～5 mol·L-1氫氧化鈉（在45～100 °C消化10 min～過夜）[21-22]，0.2 mol·L-1氨水或者0.5 mol·L-1氫氧化鉀（60 °C消化）[23-26]。

吳澤君等[11]、張罡等[12]在其研究中皆使用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液水解，80 °C水浴保溫1 h，水解時(shí)間較短，但在后續(xù)提取中，需要調(diào)節(jié)pH值，還需用到有機(jī)試劑分多次萃取，氮吹后置換溶劑，無論是提取還是凈化，步驟都相對(duì)比較繁瑣。

2.3 酶水解法

相較于酸堿水解，酶水解在中性pH下進(jìn)行，水解條件溫和，對(duì)不穩(wěn)定的化合物適用，專屬性強(qiáng)，適用范圍廣，提取效率高，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴。目前已知的水解酶有β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶、蛋白酶K和鏈蛋白酶等[27]。

閔佳玲等[13]在其研究中使用了β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進(jìn)行水解。加入乙酸銨緩沖溶液和β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶于37 °C水浴振蕩12 h，水解時(shí)間長(zhǎng)，但后續(xù)提取和凈化步驟較簡(jiǎn)單。該方法研究了畜禽毛發(fā)樣品中8種β-受體激動(dòng)劑的痕量分析檢測(cè)。

3 定量方法

在色譜分析中，常用的定量方法有校正因子定量、歸一化法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法等[28]。在已發(fā)表的關(guān)于動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑LC-MS/MS檢測(cè)方法的文章中，最常用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

3.1 外標(biāo)法

用待測(cè)組分的純品作為對(duì)照物，通過對(duì)待測(cè)組分與對(duì)照物的信號(hào)響應(yīng)值相比較進(jìn)行定量的方法，稱為外標(biāo)法，又稱直接比較法[28]。相較于內(nèi)標(biāo)法，外標(biāo)法操作簡(jiǎn)單，無需校正因子，適合大批量樣品檢測(cè)分析，但結(jié)果準(zhǔn)確性易受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響，易出現(xiàn)分析誤差，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)操作、儀器性能等要求較高[29]。

3.2 內(nèi)標(biāo)法

選擇樣品中不含的某一種或幾種純物質(zhì)作為對(duì)照物加入待測(cè)樣品中，通過對(duì)待測(cè)組分與對(duì)照物的信號(hào)響應(yīng)值進(jìn)行比較，測(cè)定待測(cè)組分含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法[28]。與外標(biāo)法最大的不同就是會(huì)把對(duì)照物，又稱內(nèi)標(biāo)物，加到待測(cè)樣品中一同前處理，因而內(nèi)標(biāo)法能夠在一定程度上消除操作條件的變化而引起的誤差，保證了精密度和準(zhǔn)確度[29]。當(dāng)對(duì)樣品情況不了解、樣品的基質(zhì)很復(fù)雜或者不需要測(cè)定出樣品中所有組分時(shí)，可以采用此方法，但內(nèi)標(biāo)物不易找，操作繁瑣，不適合大批量操作。

4 方法比較

β-受體激動(dòng)劑為食品源動(dòng)物的禁用藥，因此在實(shí)際檢測(cè)過程中，方法的靈敏度至關(guān)重要。對(duì)上述提到的近年來發(fā)表的動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑LC-MS/MS檢測(cè)方法進(jìn)行歸納比較。結(jié)果（表1）可見，不同水解方法，由于提取過程的復(fù)雜程度和各種干擾因素，如基質(zhì)干擾，皆會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和精確度;但隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，方法在更新，從酸水解、堿水解到酶水解，水解物種類越來越多，涉及的β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)參數(shù)也在不斷增多;同時(shí)內(nèi)標(biāo)物的合理使用，使得部分參數(shù)的回收率也有所改善和提高。

5 結(jié)論與建議

毛發(fā)作為監(jiān)管生產(chǎn)環(huán)節(jié)違法使用β-受體激動(dòng)劑的一種靶標(biāo)，具有眾多優(yōu)勢(shì)：無創(chuàng)傷，易于采集、運(yùn)輸、貯存，監(jiān)測(cè)窗久等[7-9]。LC-MS/MS檢測(cè)方法以其高靈敏度和準(zhǔn)確度在眾多檢測(cè)方法中脫穎而出。

本文通過對(duì)近幾年發(fā)表的關(guān)于動(dòng)物毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑LC-MS/MS檢測(cè)方法進(jìn)行分析，對(duì)于毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)，多年來的研究探討表明，LC-MS/MS檢測(cè)方法，無論是酸水解、堿水解亦或是酶水解法，在靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度方面，都已經(jīng)達(dá)到一定程度的成熟，可以滿足一定的檢測(cè)要求。

但是也不能忽視，我國目前尚未出臺(tái)有關(guān)毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)毛發(fā)也還不能像尿液、血液一樣實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)，對(duì)檢測(cè)條件要求較高，不能進(jìn)行大范圍的普及應(yīng)用。所以接下來，除了不斷明確和完善有關(guān)毛發(fā)中藥物進(jìn)入、蓄積以及內(nèi)外源干擾因素等理論機(jī)制研究，還需要在簡(jiǎn)化提取方法、優(yōu)化檢測(cè)方法方面努力，這樣毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)作為一種對(duì)現(xiàn)有其它生物樣本檢測(cè)方法的補(bǔ)充，提供更多的用藥信息，對(duì)監(jiān)管生產(chǎn)環(huán)節(jié)禁用藥的使用、杜絕非法添加具有更加重要的意義。

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收稿日期：2021-07-06

作者簡(jiǎn)介：伊淑平（1993—），女，河北滄州人，助理農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)方面研究。