思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

羅曼 熊忠平 熊智 李選文 李雕益 包書軍

摘要：采用純培養(yǎng)法對(duì)采集自云南地區(qū)的思茅松毛蟲（Dendrolimu kikuchii）3齡幼蟲進(jìn)行腸道細(xì)菌多樣性的研究，這些研究資料與菌種數(shù)據(jù)為后研究思茅松毛蟲發(fā)育奠定基礎(chǔ)。對(duì)采自安寧市的150頭思茅松毛蟲3齡幼蟲的腸道細(xì)菌進(jìn)行分離與純化，并且對(duì)所培養(yǎng)菌株的進(jìn)行形態(tài)特征觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定，通過這種方法對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定，再結(jié)合16S rDNA分子鑒定技術(shù)進(jìn)行分析，判定細(xì)菌多樣性。結(jié)果顯示，從3齡幼蟲腸道中共分離到152株細(xì)菌，初步鑒定隸屬于6個(gè)屬9個(gè)類群，分別為62株芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）（3個(gè)類群）、35株微球菌屬（Micrococcus sp.）（2個(gè)類群）、23株葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）（1個(gè)類群）、11株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）（1個(gè)類群）、12株不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）（1個(gè)類群）、9株泛菌屬（Pantoea sp.）（1個(gè)類群）。其中，芽孢桿菌屬具有最高的相對(duì)分離率為40.78%，為優(yōu)勢(shì)菌群。思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌的多樣性豐富，通過分析細(xì)菌種類及各水平之間的相關(guān)性，為更深入研究細(xì)菌與思茅松毛蟲的關(guān)系和為思茅松毛蟲的防治奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：思茅松毛蟲;腸道細(xì)菌;多樣性;16S rDNA;分離

中圖分類號(hào)： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）21-0128-06

收稿日期：2021-03-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31660029）。

作者簡(jiǎn)介：羅 曼（1997—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事腸道微生物研究。E-mail：819683586@qq.com。

通信作者：熊忠平，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事森林病蟲害研究。E-mail：76250630@qq.com。

思茅松毛蟲（Dendrolimu kikuchii）又名褚色松毛蟲，屬于鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasiocampidae）松毛蟲屬（Dendrolimus）[1]。其以松針為食，體形大，幼蟲齡期長(zhǎng)，且取食量較大，是我國(guó)南方松樹的重要害蟲之一，主要分布在云南、廣西、四川、湖南等?。▍^(qū)）[2]。在云南滇中地區(qū)，思茅松毛蟲1年發(fā)生1～2代，幼蟲共7齡，其4齡幼蟲開始越冬，主要危害思茅松等針葉樹，且存在明顯的寄生?；訹2]。

昆蟲與微生物的關(guān)系十分復(fù)雜，微生物參與到昆蟲生活的很多方面，而腸道微生物與宿主共生，相互合作[3]。體內(nèi)的共生微生物對(duì)昆蟲具有重要的生理功能，可通過消化代謝和營(yíng)養(yǎng)與昆蟲建立共生關(guān)系[4-7]。因此，研究思茅松毛蟲與其腸道微生物之間的關(guān)系，可進(jìn)一步研究共生菌種類與宿主的關(guān)系，最終篩選出培育防治思茅松毛蟲的有效方法[8-9]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)昆蟲腸道微生物多樣性的研究已經(jīng)發(fā)展到一定階段。其中，劉小改通過高通測(cè)序技術(shù)研究稻縱卷葉螟幼蟲腸道細(xì)菌微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)稻縱卷葉螟幼蟲期腸道微生物的物種豐富度較高，而卵期微生物的多樣性較高[10]。陳金華等利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法研究桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)桑粒肩天牛腸道微生物在豐富度和頻度2個(gè)方面都顯示出復(fù)雜的多樣性[11]。而王嬌莉采用DGGE及高通量測(cè)序檢測(cè)核桃舉肢蛾和桃蛀螟幼蟲腸道細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)類群及豐度，發(fā)現(xiàn)核桃舉肢蛾幼蟲腸道多樣性稍高于桃蛀螟幼蟲腸道多樣性，但差異不顯著[12]。除此之外，前人研究的昆蟲腸道微生物多樣性還有豆天蛾[13]、日本龜蠟蚧[14]、華山松大小蠹[15]等。

現(xiàn)階段針對(duì)腸道微生物的研究主要集中在白蟻[16-18]、蜜蜂[19-20]等與生活關(guān)聯(lián)更大的昆蟲中，而針對(duì)林業(yè)危害嚴(yán)重的昆蟲腸道研究則較少見。試驗(yàn)采用純培養(yǎng)技術(shù)和形態(tài)學(xué)對(duì)3齡幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行初步的分離鑒定，再利用16S rDNA序列測(cè)定幼蟲腸道的細(xì)菌種類，鑒定出幼蟲腸道細(xì)菌的關(guān)鍵種群。在了解思茅松蟲幼蟲腸道細(xì)菌多樣性及群落組成的基礎(chǔ)上，弄清其中的關(guān)鍵共生菌種類，為進(jìn)一步研究這些共生菌對(duì)宿主昆蟲的生理功能，調(diào)節(jié)關(guān)鍵性的共生菌控制思毛松毛蟲提供理論基礎(chǔ)[21]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

2018年10月至2019年5月在云南省安寧市草鋪鎮(zhèn)森林（24°31′～25°6′ N，102°8′～102°37′ E）進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)材料的采集和處理

試驗(yàn)材料選用思茅松毛蟲3齡幼蟲，根據(jù)試驗(yàn)地點(diǎn)具體情況，在方圓2 km范圍內(nèi)隨機(jī)挑選30個(gè)樣品點(diǎn)，每個(gè)樣品點(diǎn)采集6頭健康的3齡思茅松毛蟲幼蟲及樹枝并帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。具體操作時(shí)再選取150頭健康幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 分離培養(yǎng)基與試劑、儀器

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至 1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min[22]。

培養(yǎng)基及生理生化鑒定所用分析純、化學(xué)試劑，均購(gòu)自西隴化工股份有限公司;Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;PCR擴(kuò)增體系試劑，購(gòu)自碩擎生物科技有限公司。

1.3 腸道細(xì)菌的分離純化

選取150頭健康的3齡幼蟲，在恒溫22～24 ℃、恒濕80%～85%條件下，用無菌水喂養(yǎng)幼蟲，40 h 后待其排空體內(nèi)食物殘?jiān)筮M(jìn)行試驗(yàn)[23]。將思茅松毛蟲幼蟲置于冰上3～5 min，待其昏迷;采用70%乙醇擦拭蟲體表面30 s，0.25%次氯酸鈉沖泡 1 min，無菌水沖洗3次;將體表消毒好的蟲子固定于無菌蠟盤上，在無菌環(huán)境下操作，使用滅菌后的細(xì)尖鉗將昆蟲腹部剖開，取出整個(gè)腸道，并立即用0.9%無菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出后置于無菌離心管中，向離心管中加入1 mL PBS緩沖液研磨成勻漿，備用[22]。

將上述腸道勻漿吸取1 mL置于9 mL PBS緩沖液中，稀釋成10-1，按照10的倍數(shù)梯度稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液，吸取每個(gè)濃度稀釋液100 μL分別涂布于NA培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度涂3個(gè)平板，作為試驗(yàn)組。取最后一次清洗的無菌水100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，作為空白對(duì)照。涂板均勻后將培養(yǎng)平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后觀察空白對(duì)照是否有菌落形成，若無菌落長(zhǎng)出，則選擇單菌落數(shù)在30～300個(gè)的培養(yǎng)皿，根據(jù)涂有腸道內(nèi)容物懸液培養(yǎng)皿上的單菌落的不同特征，挑取單菌落至新的NA培養(yǎng)基平板上，采用分區(qū)劃線法進(jìn)行純化，直至菌株形態(tài)基本一致，得到純菌株。將得到的菌種保藏于NA斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆肹22]。

1.4 3齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的形態(tài)觀察

將經(jīng)分離純化得到的純菌株用平板劃線法接種于新的NA平板上，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，待菌落長(zhǎng)成后，參考文獻(xiàn)[23]對(duì)菌落進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)，依據(jù)文獻(xiàn)[24]對(duì)其特征進(jìn)行描述鑒定。

1.5 3齡幼蟲腸道可培養(yǎng)菌株的生理生化鑒定

按照朱旭芬等的微生物生理生化鑒定方法[25-26]，對(duì)3齡幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.6 3齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA分子鑒定

1.6.1 腸道細(xì)菌基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

將1 mL過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液按照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取3齡幼蟲腸道細(xì)菌基因組DNA。提取出的細(xì)菌基因組DNA用1.0% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)，得到的片段符合細(xì)菌基因組DNA大小后，將檢測(cè)合格的DNA產(chǎn)物作為16S rDNA序列擴(kuò)增模板。選擇的擴(kuò)增引物為：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[12]。PCR擴(kuò)增體系為：25.0 μL的2×Taq PCR MasterMix;3.0 μL的模板DNA;10.0 μmol/L 正向引物27 F和反向引物1 492 R各1.0 μL;雙蒸水補(bǔ)充至50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min，-20 ℃保存。取4.0 μL PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6.2 3齡幼蟲腸道細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測(cè)得的序列通過DNA MAN 6.0軟件進(jìn)行矯正及拼接，拼接完成后的16S rDNA序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選出與菌株相似度最高的序列，運(yùn)用軟件MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，判定其分類學(xué)關(guān)系[22]。

多樣性指數(shù)[28]的計(jì)算公式如下：

Shannon指數(shù)：H′=∑ki=1 （piln pi）;

Simpson優(yōu)勢(shì)度指：DJ=-∑ki=1p2i;

Margalef豐富度指數(shù)：Ma=（S-1）/lnN。

式中：S表示某個(gè)3齡幼蟲腸道細(xì)菌的種類數(shù);N表示某個(gè)3齡幼蟲腸道細(xì)菌的總量;pi表示某種3齡幼蟲腸道細(xì)菌的相對(duì)分離率。

2 結(jié)果與分析

2.1 3齡幼蟲腸道細(xì)菌的分離結(jié)果

從150頭3齡幼蟲腸道中共分離得到152株細(xì)菌，根據(jù)菌落的形態(tài)特征共有9個(gè)類群，整理編號(hào)為N301～N309。對(duì)分離得到的9株細(xì)菌的菌落特征進(jìn)行分析，由表1可知，9株菌株中多數(shù)菌株的革蘭氏染色結(jié)果呈陽性，僅有3株呈陰性。其菌株的形狀多樣化，有球狀、桿狀、橢圓狀等，其中球狀居多，而N305、N307、N308為橢圓狀，N306、N309為桿狀;顏色多樣化，有灰白色、黃色、紫色等，其中灰白色和黃色占大部分，只有N309顏色為灰白色;大部分菌株邊緣整齊，但N305、N307、N308邊緣不整齊，呈鋸齒狀;所有菌株都是不透明或者半透明的。

從思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌的相對(duì)分離比率（表1）可知，152株3齡幼蟲腸道細(xì)菌中，思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為、Margalef豐富度指數(shù)分別為2.1 486、0.8 785、1.5 924，說明思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌具有豐富的多樣性。而N305、N307和N308的菌群相對(duì)分離率為40.78%，是思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2 3 齡幼蟲腸道細(xì)菌生理生化鑒定及多樣性分析

采用細(xì)菌生化試驗(yàn)對(duì)9種細(xì)菌群落進(jìn)行淀粉水解等18種反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有明顯差異（表2）。

經(jīng)過對(duì)生理生化指標(biāo)的聚類分析可知，9個(gè)細(xì)菌類群可劃分為2個(gè)遺傳聚類組，N301自成一遺傳聚類組，其他8個(gè)細(xì)菌類群為一聚類組，其中N302、N307屬于一類，N309、N306分別各屬于一類，N303、N308、N304、N305屬于一類（圖1）。

結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征（表1）、生理生化特征（表2）、生理生化聚類（圖1），查詢細(xì)菌鑒定手冊(cè)后，將分離到的9種細(xì)菌形態(tài)分析對(duì)比，初步鑒定結(jié)果：N305、N307、N308屬于芽孢桿菌屬的Bacillus sp.1、Bacillus sp.2、Bacillus sp.3，N301為葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.），N309為鏈霉菌屬（streptomyces sp.），N302、N304為微球菌屬（Micrococcus sp.1、Micrococcus sp.2），N303為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），N306為泛菌屬（Pantoea sp.）。其中N305、N307和N308的芽孢桿菌屬相對(duì)分離率為40.78%，是思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。部分菌株因菌種形態(tài)過于相似，需進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)鑒定。

2.3 3齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增及16S rDNA分析結(jié)果

由圖2可知，安寧市3齡幼蟲分離純化的腸道細(xì)菌基因組DNA，檢測(cè)合格后，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過觀察凝膠成像后，PCR擴(kuò)增條帶均在1 500 bp左右，條帶清晰。

將所獲9種細(xì)菌形態(tài)3齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA序列在NCBI中比對(duì)，分離到的3齡幼蟲腸道細(xì)菌與相應(yīng)菌株的16S rDNA序列相似度在95%～100%之間。其中，N301、N302、N304、N306、N308序列相似度為99%; N303、 N305序列相似度為98%;N309序列相似度為97%;N307序列相似度為96%。這152株細(xì)菌隸屬于6個(gè)屬9個(gè)類群。

初步鑒定結(jié)果顯示，N301為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus capitis），N302為南極微球菌（Micrococcus antarcticus），N303為約翰遜不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii），N304為黃褐微球菌（M. luteus），N305為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），N306為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans），N307為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），N308為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），N309為淡紫色鏈霉菌（Streptomyces lividans）。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹

將3齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可知，思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌歸屬于3個(gè)大類：第一大類為放線菌門，包括微球菌屬（Micrococcus sp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）;第二大類為變形菌門，包括不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、泛菌屬（Pantoea sp.）;第三大類為厚壁菌門，包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）。

3 結(jié)論與討論

昆蟲腸道微生物與宿主互惠共生，相互依存[5]。本研究以思茅松毛蟲3齡幼蟲為材料，通過對(duì)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行一系列的菌落觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA同源性分析，共分離得到152 株腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，經(jīng)測(cè)定隸屬于6個(gè)屬9個(gè)類群。進(jìn)一步對(duì)其多樣性做深入的分析，可知思茅松毛蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌具有豐富的多樣性。

筆者所在課題組之前研究過3齡思茅松毛蟲腸道好氧細(xì)菌的多樣性，得到好氧細(xì)菌11株，經(jīng)ARDRA聚類分析，在70%遺傳相似度水平上歸屬4個(gè)類群，說明3齡松毛蟲腸道內(nèi)好氧細(xì)菌的多樣性水平偏低[27]。而采自安寧地區(qū)的3齡幼蟲分離得到152株腸道細(xì)菌，隸屬于6個(gè)屬、9個(gè)類群。2個(gè)試驗(yàn)有相似的結(jié)果，說明3齡思茅蟲毛蟲腸道微生物多樣性確實(shí)偏低?？赡苁且?yàn)樗济┧擅x的草食性生活習(xí)性建立了腸道特定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，腸道微生物也通過復(fù)雜的調(diào)控過程。

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，可在動(dòng)物腸道或環(huán)境中分泌消化酶、維生素或抗菌物質(zhì)，形成具有一定穩(wěn)定性的微生物群系，影響動(dòng)物腸道的微生物平衡[29-30]。本試驗(yàn)對(duì)3齡思茅松毛蟲腸道微生物的多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌含量豐富。而解淀粉芽胞桿菌是一種與枯草芽胞桿菌親緣關(guān)系很近的革蘭陽性細(xì)菌，能生產(chǎn)纖溶酶等重要的專一性蛋白酶，因此推測(cè)解淀粉芽胞桿菌與思茅松毛蟲腸道纖維素的消化相關(guān)[31-32]，該特性在研究解淀粉芽孢桿菌與食纖維素類昆蟲消化的關(guān)系方面具有重要意義?？莶菅挎邨U菌和解淀粉芽胞桿菌都屬于芽孢桿菌屬，本研究中芽孢桿菌屬的相對(duì)分離率最高，為40.78%，是3齡幼蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬。經(jīng)分析，芽孢桿菌屬對(duì)思茅松毛蟲生長(zhǎng)發(fā)育都有很大影響，對(duì)研究芽孢桿菌屬其他菌種與微生物腸道多樣性的關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

思茅松毛蟲是林業(yè)重要的害蟲，對(duì)其腸道微生物的研究，可以補(bǔ)充昆蟲腸道微生物資源庫(kù)，也為其他相近種昆蟲腸道微生物多樣性研究提供參考。并進(jìn)一步分析得出影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的腸道細(xì)菌種類，為思茅松毛蟲的生物防治提供依據(jù)。

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