基于正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化朱日亨滴丸提取工藝

張 謙，李 君，王躍武

朱日亨滴丸原處方是蒙醫(yī)臨床驗(yàn)方，是在我國(guó)《部頒標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊(cè)）》中贊旦-3（方藥組成：廣棗、肉豆蔻、檀香）的基礎(chǔ)上演變而來(lái)的［1］，由廣棗、紅花、梔子、肉豆蔻、檀香、沉香、草果、牛黃、冰片共9味藥材組成.該處方在臨床作為醫(yī)院院內(nèi)制劑已使用多年，主治心熱、心赫依、心刺痛和心慌氣短等（即冠心病、心絞痛、心律不齊等）心血管疾?。?-4］.目前，該處方劑型為散劑，在臨床應(yīng)用存在服用劑量不均一、揮發(fā)性成分易散失、患者順應(yīng)性差、易吸潮變質(zhì)等缺點(diǎn)；但其滴丸溶出速度快、起效迅速、生物利用度高，更宜于患者臨床用藥.為此，本文根據(jù)該處方中各味藥材活性成分的性質(zhì)進(jìn)行了提取純化，將原劑型改制成滴丸，具體制備工藝為：以乙醇提取廣棗、紅花、梔子3味藥中有效成分，以CO2超臨界萃取法收集肉豆蔻、檀香、草果、沉香4味藥中的揮發(fā)油，牛黃、冰片2味藥直接粉碎入藥，再以聚乙二醇為基質(zhì)，滴制而成［5-6］.

有研究報(bào)道［7］，提取工藝與中藥制劑質(zhì)量密切相關(guān)，提取工藝是否合理，提取技術(shù)運(yùn)用是否精良，均可直接影響到藥材中有效成分提取的收率.因此，優(yōu)化提取工藝是生產(chǎn)中藥制劑至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)［8］.為了最大程度提取藥材中的有效成分，有必要以一種或者更多種藥效成分為考察指標(biāo)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選最佳的提取工藝，以確保工業(yè)化生產(chǎn)的藥物達(dá)到最佳質(zhì)量和臨床療效.正交試驗(yàn)是從多因素多水平角度出發(fā)篩選、優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝的常用方法，通過(guò)從全面試驗(yàn)中挑選代表性強(qiáng)的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，利用正交表均衡分散、整齊可比的特點(diǎn)，對(duì)各因素和各水平的優(yōu)劣作出分析，最后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳提取方案［9-10］.

在前期工作中，筆者對(duì)朱日亨滴丸的4種組分及2種配比進(jìn)行了指標(biāo)成分和藥效活性相結(jié)合的正交篩選，以最佳組方制備成朱日亨滴丸［4］，但對(duì)其提取工藝未進(jìn)行篩選和優(yōu)化.因該復(fù)方制劑組方成分較多，具有成分多、靶點(diǎn)多、協(xié)同作用的特點(diǎn)，以多成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)價(jià)復(fù)方的提取工藝，可更合理地體現(xiàn)復(fù)方的整體性、復(fù)雜性和有效性.鑒于此，本研究采用正交試驗(yàn)篩選和優(yōu)化朱日亨滴丸的最佳提取工藝，以期為該制劑工業(yè)化生產(chǎn)及臨床用藥的安全性、有效性提供科學(xué)依據(jù).

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA224S型萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；DZTW型電子調(diào)溫電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）.

1.2 試藥

所用試劑均為分析純；水為蒸餾水；廣棗（批號(hào)：20022403），梔子（批號(hào)：19122703），紅花（批號(hào)：200101131），均購(gòu)自內(nèi)蒙古北域健康藥房連鎖有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室渠弼教授鑒定.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：InertSustain?C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，3.0μm），柱溫為35℃，流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0~0.3 min，5%A；0.31~2.00 min，5%→15%A；2.01~5.00 min，15%→45%A；5.01~6.00 min，45%→95%A；6.01~7.50 min，95%A；7.50~7.51 min，95%→5%A；7.51~9.00 min，5%→5%A），流 速為0.25 mL·min-1，進(jìn)樣量為3μL.

質(zhì)譜條件：ESI離子源負(fù)離子模式，定量分析采用多重反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），加熱模塊溫度400℃，DL溫度250℃，霧化氣流速3.0 L·min-1，干燥氣流速15 L·min-1，離子源電壓4.0 kV.

2.2 供試品的制備

按處方比例稱(chēng)取朱日亨各味藥材，置于圓底燒瓶中，加入60%乙醇溶液680 mL，于磁力加熱攪拌電熱套加熱提取1 h，冷卻至室溫，取濾液用60%乙醇溶液定容至500 mL容量瓶中，取提取液10μL，于70%甲醇水溶液990μL中，渦旋混勻30 s，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品.

2.3 正交優(yōu)化提取工藝

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)［11-12］，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn).選取料液比（A）、乙醇濃度（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，如表1所示；朱日亨組方中廣棗、梔子、紅花分別占比56.25%、18.75%、25.00%，故綜合評(píng)分=廣棗中成分含量×56.25%+梔子中成分含量×18.75%+紅花中成分含量×25.00%，以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)評(píng)價(jià)提取工藝，評(píng)分越高表明提取效果越好.

2.4 最優(yōu)提取條件放大驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱(chēng)取朱日亨各味藥材約680.00 g，共3份，置于圓底燒瓶中，按最佳提取工藝，分別加入60%乙醇溶液5 440 mL，于磁力加熱攪拌電熱套分別加熱提取110 min，提取2次，冷卻至室溫，所得濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至500 mL，取提取液10μL于990μL的70%甲醇水溶液中，渦旋混勻30 s，過(guò)0.22μm微孔濾膜，進(jìn)樣測(cè)定.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 正交優(yōu)化提取工藝

由表2、表3可知，根據(jù)極差（R）大小，確定D因素對(duì)提取工藝影響最大，各因素對(duì)綜合評(píng)分影響的主次順序：D（提取次數(shù)）＞B（乙醇濃度）＞A（料液比）＞C（提取時(shí)間），通過(guò)4因素3水平K值分析比較可知，料液比A2＞A1＞A3，乙 醇 濃 度B3＞B2＞B1，提 取 時(shí) 間C3＞C2＞C1，提 取 次 數(shù)D3＞D2＞D1；根 據(jù) 方 差分析表4可知，A、B、C、D四個(gè)因素對(duì)其均無(wú)顯著性影響（P＞0.05），可以確定最優(yōu)提取工藝為A2B3C3D3，即 料 液 比1∶8 g·mL-1、乙 醇 濃 度60%、提取時(shí)間110 min、提取次數(shù)3次.方差分析見(jiàn)表4.

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)中7種指標(biāo)成分含量（n=3） 單位：mg·g-1

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.2 最優(yōu)提取條件放大驗(yàn)證試驗(yàn)

由表5可知，沒(méi)食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山奈酚、梔子苷7種成分的含量分別為0.90 mg·g-1、17.04 mg·g-1、0.02 mg·g-1、0.70 mg·g-1、6.01 mg·g-1、0.03 mg·g-1、39.14 mg·g-1，RSD為3.32%~7.20%，綜合評(píng)分為13.64.

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

蒙古族國(guó)醫(yī)大師蘇榮扎布在心血管疾病治療方面成果顯著，其提出以“三根為核心”的心腦血管病整體觀和“給血管活血化瘀”的臨床治療方法，治療缺血性心肌病心血管疾病具有獨(dú)特的療效［13］.朱日亨滴丸是在蘇榮扎布老師治療冠心病、心絞痛的經(jīng)典方劑贊旦-3味湯散（廣棗、檀香和肉豆蔻）基礎(chǔ)上，配伍若干鎮(zhèn)赫依藥味和清熱藥后，經(jīng)CO2超臨界萃取工藝制成的滴丸制劑.

廣棗作為蒙醫(yī)特色藥材，性味甘、酸而平，內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)中含廣棗的方劑約占10%，其富含黃酮類(lèi)成分，適宜以乙醇進(jìn)行藥效成分的提?。粭d子為常用清熱類(lèi)藥材，梔子苷是其主要藥效成分，亦屬于醇溶性成分；紅花為活血化瘀類(lèi)藥材，含有查耳酮類(lèi)黃酮類(lèi)成分-紅花黃色素，溶于稀乙醇和水［6］.鑒于上述各味藥藥效成分的理化性質(zhì)，本文進(jìn)行了醇提工藝研究，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)方法，以沒(méi)食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山奈酚、梔子苷7種成分為控制指標(biāo)，確定了最佳提取工藝：料液比1∶8 g·mL-1、乙醇濃度60%、提取時(shí)間110 min、提取次數(shù)3次.然而，由于后期中試及生產(chǎn)過(guò)程完全遵循本研究的醇提工藝參數(shù)，考慮到生產(chǎn)成本問(wèn)題，同時(shí)，根據(jù)上述方差分析結(jié)果，從提取次數(shù)無(wú)顯著性影響的角度出發(fā)，考察第3次提取過(guò)程中沒(méi)食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素等各藥效成分增長(zhǎng)百分比.結(jié)果表明，各種藥效成分含量均不同程度地增加，即沒(méi)食子酸（5.31%）、羥基紅花黃色素A（3.33%）、槲皮素（6.52%）、鞣花酸（5.55%）、西紅花苷Ⅰ（5.90%）、山奈酚（4.43%）、梔子苷（6.24%），故將最優(yōu)工藝中提取次數(shù)確定為2次.上述工藝優(yōu)化過(guò)程既考慮了廣棗和梔子中有效成分的提取也避免了多次提取的高成本缺點(diǎn).

表4 方差分析結(jié)果

表5 放大驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

4.2 結(jié)論

本研究探討了與醇提取法作用相關(guān)的料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)朱日亨滴丸中沒(méi)食子酸等7種成分含量的影響，采用正交試驗(yàn)篩選出該制劑的最佳提取工藝條件：料液比1∶8 g·mL-1、乙醇濃度60%、提取時(shí)間110 min、提取次數(shù)2次，該提取工藝穩(wěn)定、可靠，可為朱日亨滴丸工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù).