基于液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜血液代謝組學(xué)的黃芪桂枝五物湯干預(yù)血瘀證大鼠的研究Δ

蔡蕭君，王 磊，江柏華，頡彥鵬，李浩經(jīng)，王 雪，王 濤，王旭玲

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院內(nèi)分泌科，黑龍江 哈爾濱 150036； 2.襄陽市中醫(yī)醫(yī)院消化科，湖北 襄陽 441000)

血瘀證是中醫(yī)臨床上常見的證候之一，是婦科疾病的基本證型[1-6]。近年來的研究結(jié)果顯示，血瘀證的病理機制與血液流變學(xué)指標(biāo)異常、凝血指標(biāo)異常等血液系統(tǒng)疾病有關(guān)。據(jù)報道，活血化瘀可以消除血瘀，改善相關(guān)的血液流變學(xué)狀況。黃芪桂枝五物湯是活血化瘀的經(jīng)典名方，出自《金匱要略》，由黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗組成，被廣泛用于治療血瘀證相關(guān)的婦科疾病，如痛經(jīng)、閉經(jīng)或月經(jīng)不調(diào)，能顯著改善患者的凝血功能，調(diào)節(jié)血常規(guī)指標(biāo)，增加抗氧化和抗炎活性。代謝組學(xué)是一種高通量的生物分析方法，用于檢測和量化小分子代謝物。利用代謝組學(xué)技術(shù)可以通過識別生物標(biāo)志物、分析代謝途徑和確定藥物-靶點相互作用，評估疾病的變化。代謝譜分析已被用于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物并評估許多中醫(yī)療法的整體效果。將代謝組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究，可能為篩選生物活性成分和生物標(biāo)志物、揭示中藥復(fù)方的作用機制和獲取基于復(fù)雜生物系統(tǒng)的科學(xué)依據(jù)提供一種新的方法[7-13]。因此，本研究采用高通量代謝組學(xué)技術(shù)研究黃芪桂枝五物湯對血瘀大鼠模型的作用機制，為黃芪桂枝五物湯治療血瘀證提供理論及數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供30只雄性SD大鼠，體重為(200±10)g。溫度和濕度分別調(diào)節(jié)在(24±1)℃和50%±5%。給予大鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)的實驗室飼料和干凈的飲水。動物實驗程序按照《實驗動物護理和使用指南》(中國科學(xué)技術(shù)部，2006年)執(zhí)行。

1.2 儀器

Agilent 1290型液相色譜儀器(美國安捷倫科技公司)；Agilent 6530型四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測器(美國安捷倫科技公司)；Agilent ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm，粒徑1.8 μm，內(nèi)徑100 μm)(美國安捷倫科技公司)。

1.3 藥品與試劑

大鼠凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和纖維蛋白原(FIB)凝血功能的商用試劑盒(北京世迪科技儀器有限公司)；黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗購自于哈爾濱世一堂有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院蔡蕭君教授鑒定為正品。腎上腺素購自福州海王星福耀制藥有限公司。

1.4 黃芪桂枝五物湯灌胃溶液的配制

按原方配比取黃芪9 g、桂枝9 g、芍藥9 g、生姜18 g和大棗4枚，加入10倍量水煎煮1 h，共2次，合并濾液，于60 ℃真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)冷凝至所需體積(生藥量1 g/ml)。大鼠灌胃體積為1 ml/100 g，將藥物儲存在4 ℃以供進一步使用。

1.5 模型復(fù)制及樣本制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為空白組、模型組和給藥組，每組10只。模型組、給藥組大鼠于實驗第7日皮下注射腎上腺素(0.8 mg/kg)2次，時間間隔4 h；在第1次皮下注射腎上腺素2 h后，將大鼠置于0～4 ℃的冰水浴中游泳4 min，以誘發(fā)急性血瘀[14]。給藥組大鼠灌胃給予黃芪桂枝五物湯8 g/kg(臨床劑量的1.5倍)，空白組和模型組大鼠灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液。所有大鼠每日灌胃1次，連續(xù)7 d。

實驗第15日，用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，取腹主動脈血樣。部分血樣(2 ml)被收集至枸櫞酸鈉抗凝管中，用于檢測凝血指標(biāo)水平(TT、PT、APTT和FIB)：首先，全血樣本立即以3 000 r/min離心(離心半徑為8 cm)10 min，然后使用血漿樣本上清液800 μl測定凝血指標(biāo)水平。其他血樣用于代謝組學(xué)分析。

血漿代謝組學(xué)樣品在室溫(25 ℃)下解凍。于血漿樣品100 μl中加入甲醇300 μl沉淀蛋白質(zhì)。隨后，將混合物旋渦30 s，并在13 000 r/min下離心(離心半徑為16 cm)10 min。將血漿樣品的上清液(200 μl)轉(zhuǎn)移至新的試管中，真空下蒸發(fā)至干燥。殘渣溶于70%甲醇溶液200 μl中?；旌弦盒郎u1 min，13 000 r/min離心(離心半徑為16 cm)15 min，最后注入上清液進行代謝組學(xué)分析。

1.6 代謝組學(xué)分析條件

Agilent 1290液相色譜系統(tǒng)，Agilent 6530 Q-TOF/MS質(zhì)譜系統(tǒng)。柱溫為40 ℃，流動相流速為0.35 ml/min，流動相A為0.1%甲酸，流動相B為0.1%甲酸和乙腈。流動相梯度條件為：0～1 min，流動相A 95%；1～4 min，流動相A 95%～75%；4～6 min，流動相A 75%～40%；6～9 min，流動相A 40%～15%；9～9.5 min，流動相A 15%～5%。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Mass Profiler Professional專業(yè)軟件處理血漿樣本中的液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)。液質(zhì)聯(lián)用原始數(shù)據(jù)文件被轉(zhuǎn)換為通用格式，由XCMS-Online(https://metlin.scripps.edu/XCMS/)實現(xiàn)。XCMS-online提供了一個完整的組學(xué)工作流，包括特征檢測、保留時間校正、對齊、注釋和統(tǒng)計分析。結(jié)合保留時間和m/z數(shù)據(jù)對檢測峰的各離子強度進行識別。通過過濾80%缺失值的峰和每組同位素離子的峰，獲得一致的變量(離子強度信息)。

使用MetaboAnalyst 4.0平臺(https://www.MetaboAnalyst.ca)進一步分析得到的數(shù)據(jù)集。采用非參數(shù)單變量法(Student’st檢驗)和多元統(tǒng)計分析(PCA、PLS-DA和OPLS-DA)選擇空白組和模型組之間的差異代謝物。PCA被用來驗證分析系統(tǒng)性能的質(zhì)量，并觀察可能的異常值?！癝tudent’st檢驗在標(biāo)準(zhǔn)化峰面積上的P<0.05。

在線數(shù)據(jù)庫HMDB(https://www.HMDB.ca/)、METLIN(https://METLIN.scripps.edu/)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/KEGG/)通過搜索特定代謝物的m/z峰的精確分子質(zhì)量數(shù)據(jù)來注釋潛在代謝物。當(dāng)觀察到的質(zhì)量和理論質(zhì)量之間的差異<10 ppm時，對其進行過濾。通過在線數(shù)據(jù)庫MetPA(https://www.metaboanalyst.ca)來確定代謝途徑和評估代謝物的潛在生物學(xué)作用。

2 結(jié)果

2.1 黃芪桂枝五物湯對血瘀證大鼠凝血功能的影響

凝血功能指標(biāo)是評價血瘀狀態(tài)的重要指標(biāo)。與空白組比較，模型組大鼠的TT、PT和APTT顯著縮短，F(xiàn)IB含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，給藥組大鼠的TT、PT和APTT明顯延長，F(xiàn)IB含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組血瘀證大鼠凝血功能指標(biāo)比較Tab 1 Comparison of coagulation index in rats with blood stasis syndrome among three groups

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

PCA評分圖顯示，空白組和模型組表現(xiàn)出不同的代謝特征，與空白組、給藥組比較，模型組呈現(xiàn)相反方向的聚集，出現(xiàn)明顯的分離趨勢；給藥組傾向于恢復(fù)正常水平，與空白組比較接近，見圖1。采用OPLS-DA分析得到10種代謝物，通過搜索KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/KEGG/)列出每種代謝物的相關(guān)途徑，上述10種代謝物大多參與脂質(zhì)和氨基酸代謝，見表2、圖2。采用MetPA(https://www.metaboanalyst.ca)測定10個潛在的生物標(biāo)志物并進行富集分析，結(jié)果見圖3。給予黃芪桂枝五物湯后上述代謝物恢復(fù)至正常水平，提示上述代謝物在血漿中的變化可能表明其作為生物標(biāo)志物的潛力，可以用來區(qū)分血瘀證和正常狀態(tài)，對上述潛在生物標(biāo)志物的有效調(diào)控可能是黃芪桂枝五物湯對血瘀大鼠模型起作用的關(guān)鍵。

圖3 血瘀證大鼠血液代謝KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway in blood metabolism of rats with blood stasis syndrome

表2 血瘀證大鼠血液生物標(biāo)志物Tab 2 Blood biomarkers in rats with blood stasis syndrome

A.正離子主成分分析圖；B.負離子主成分分析圖A. principal component analysis diagram of positive ions; B. principal component analysis diagram of negative ions圖1 血瘀證大鼠血液的PCA得分圖Fig 1 PCA score of rats with blood stasis syndrome

3 討論

本研究成功建立了大鼠血瘀證模型，模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血指標(biāo)發(fā)生顯著變化?；诟咄看x組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血瘀證大鼠存在明顯的代謝異常，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝，花生四烯酸代謝，苯丙氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。給予黃芪桂枝五物湯后，各項指標(biāo)和生物標(biāo)志物含量均有改善趨勢，證明黃芪桂枝五物湯對血瘀證有很好的治療作用。

谷胺酸是蛋白質(zhì)合成、代謝能量或糖異生的重要底物，也是神經(jīng)介質(zhì)的底物[15]。谷氨酸被大腦用來合成γ-氨基丁酸(GABA)，GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)整個神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元興奮性方面發(fā)揮作用，直接負責(zé)調(diào)節(jié)人類的肌張力[16]。血瘀證形成后，血液循環(huán)功能障礙導(dǎo)致主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)化為主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA。本研究中，模型組大鼠的L-谷氨酸含量顯著低于空白組，給藥組大鼠的L-谷氨酸含量升高。結(jié)果表明，L-谷氨酸可引起能量代謝失衡和血液循環(huán)功能障礙。

苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑以及苯丙氨酸代謝與L-苯丙氨酸有關(guān)[17]。苯丙氨酸在組織中可以轉(zhuǎn)化為酪氨酸。值得注意的是，苯丙氨酸代謝的穩(wěn)定性可以保持身體生長和正常功能。本研究建立的血瘀證模型顯示，在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑中，代謝物苯丙氨酸的代謝異常。L-苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，改變了苯丙氨酸與酪氨酸的比例，導(dǎo)致L-苯丙氨酸大量蓄積。與模型組相比，給藥組大鼠的L-苯丙氨酸濃度降低。這可能是由于給藥后，大鼠體內(nèi)的L-苯丙氨酸可以生物轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，表明黃芪桂枝五物湯能恢復(fù)正常的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，使L-苯丙氨酸濃度降低。

A.花生四烯酸；B.溶血磷脂酸[18：1(9Z)/0：0]；C.溶血磷脂酸(16：0/0：0)；D.溶血磷脂膽堿(P-18：0)；E.L-谷氨酸；F.肌酸；G.L-精氨酸；H.L-亮氨酸；I.L-色氨酸；J.L-苯丙氨酸A. arachidonic acid; B. lysophosphatidic acid[18：1(9Z)/0：0]; C. lysophosphatidic acid (16：0/0：0); D. lysophosphatidylcholine (P-18：0); E. L-glutamic acid; F. creatine; G. L-arginine; H. L-leucine; I. L-tryptophan; J. L-phenylalanine圖2 血瘀證大鼠模型血液生物標(biāo)志物相對含量圖Fig 2 Relative content of blood biomarkers in rats with blood stasis syndrome

酪氨酸是L-色氨酸的代謝物，是炎癥和惡性腫瘤研究領(lǐng)域中一種重要的色氨酸代謝物，具有免疫抑制作用。蓄積的犬尿氨酸可促進活化Th細胞凋亡，誘導(dǎo)免疫抑制Treg細胞分化，從而抑制免疫反應(yīng)[18-20]。酪氨酸是犬尿氨酸的下游產(chǎn)物，其含量的高低會直接影響酪氨酸的含量，進而影響色氨酸含量。除酪氨酸外，色氨酸的另一個重要分解途徑為5-羥色胺途徑。腸嗜鉻細胞分泌的5-羥色胺進入血液，被血小板主動吸收，當(dāng)血小板與血塊結(jié)合時，會釋放血清素，血清素起到血管收縮作用，有助于調(diào)節(jié)止血和凝血。本研究中，與空白組大鼠相比，模型組大鼠體內(nèi)L-色氨酸含量差異顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。急性血瘀證模型建立后，L-色氨酸濃度顯著升高，色氨酸代謝發(fā)生改變。L-亮氨酸參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，調(diào)節(jié)血糖，為身體提供能量。亮氨酸是一種支鏈氨基酸，也是重要的生酮氨基酸。支鏈氨基酸可促進蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)和葡萄糖的整體代謝。模型組大鼠的L-亮氨酸濃度明顯低于空白組，亮氨酸的減少可能是亮氨酸生物合成減少所致。

黃芪桂枝五物湯的臨床應(yīng)用廣泛、效果明顯，是治療血瘀證相關(guān)疾病的常用中藥方劑。本研究首次采用高通量的代謝組學(xué)研究技術(shù)對黃芪桂枝五物湯治療血瘀證大鼠進行研究，通過非靶向研究策略結(jié)合高分辨質(zhì)譜檢測手段成功獲取黃芪桂枝五物湯治療血瘀證過程中的關(guān)鍵節(jié)點和關(guān)鍵代謝物，為闡明血瘀證的深層機制提供了數(shù)據(jù)依托。但本研究以動物實驗為切入點，實驗結(jié)果與臨床樣本的擬合程度還有待研究，生物標(biāo)志物在人體的代謝機制和網(wǎng)絡(luò)互做關(guān)系還需進一步詳細研究。