低咖啡堿茶樹育種研究進(jìn)展

梁少茹，王曉，黨永超，付群英，趙豐華

（1.信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.河南省豫南茶樹資源綜合開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000）

咖啡堿（caffeine）是茶葉的特征物質(zhì)之一，同時(shí)也是重要的滋味物質(zhì)。茶葉咖啡堿含量通常在3%～5%之間，也常被看作是影響茶葉質(zhì)量的一個(gè)重要因素?？Х葔A具有升高血壓、增加血液中的兒茶酚胺含量、增強(qiáng)血液中高血壓蛋白原酶的活力、提高血清中游離脂肪酸水平、利尿和增加胃酸的分泌等作用［1］。一般來(lái)講，正常人日常飲茶所攝入的咖啡堿含量，即使按茶葉含量最高值計(jì)算也在安全范圍之內(nèi)。然而，由于咖啡堿的藥理功能，攝入過(guò)量會(huì)引起焦燥不安、失眠、血壓升高等癥狀，對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響。經(jīng)研究，攝入過(guò)多咖啡堿，易誘發(fā)兒童多動(dòng)癥［2］，誘發(fā)孕婦妊娠中毒癥并導(dǎo)致新生兒殘疾、使胃潰瘍患者潰瘍難于愈合、更年期婦女月經(jīng)紊亂、中老年人缺鈣甚至骨質(zhì)疏松［3］，誘發(fā)腦血栓或心肌梗塞［4］，引起高血壓和心率不齊［5-7］等不良反應(yīng)。因此，部分人群如兒童、孕婦、更年期婦女、中老年人、胃潰瘍、心腦血管、神經(jīng)衰弱及高血壓等疾病患者不適宜攝入。

目前日本、美國(guó)等一些國(guó)家對(duì)茶制品中咖啡堿含量已作出限量規(guī)定，但對(duì)低咖啡堿茶中咖啡堿含量沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，歐美等一般要求咖啡堿含量低于0.5%，中國(guó)、日本將咖啡堿含量低于1%的茶葉稱為低咖啡堿茶［8，9］。為了滿足特殊人群的需求，近年來(lái)各類低咖啡堿茶的研究也越來(lái)越引起研究者的興趣。降低茶葉中的咖啡堿含量目前主要從兩個(gè)方面來(lái)進(jìn)行：一是通過(guò)一定的加工工藝，利用物理化學(xué)等手段脫除茶葉中的咖啡堿；另一條途徑是進(jìn)行茶樹育種研究，培育出低咖啡堿含量的茶樹新品種。

國(guó)內(nèi)外運(yùn)用物理化學(xué)等方法脫除茶葉咖啡堿的研究一直不斷，如：用熱水浸提法脫除茶鮮葉中的咖啡堿［10-12］，利用工業(yè)乙醇［13］、三氯甲烷［14］等有機(jī)溶劑萃取茶葉或茶提取液中的咖啡堿，或運(yùn)用超臨界CO2萃?。?5-17］、大孔樹脂吸附法［18］提取咖啡堿，此外還有減壓升華法［19］、茶多酚水溶液浸提法［20］、微生物降解法［21，22］等手段降低茶葉咖啡堿含量。國(guó)內(nèi)外目前也有一些咖啡堿脫除工藝和裝備的專利面世［23］。然而一直以來(lái)，關(guān)于脫除茶葉咖啡堿的加工工藝研究并不深入，目前為止尚未研究出既保持茶葉原有風(fēng)味又安全高效的方法。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，加強(qiáng)茶樹育種研究，培育咖啡堿含量低的茶樹品種是最為有效且經(jīng)濟(jì)安全的方法。

低咖啡堿茶樹育種的途徑主要有常規(guī)育種和利用生物技術(shù)尤其是基因工程開(kāi)發(fā)茶樹新品種。

1 常規(guī)育種選育低咖啡堿茶樹

通過(guò)常規(guī)雜交育種選育低咖啡堿茶樹新品種是降低茶葉咖啡堿含量經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。

1.1 低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源的鑒定及評(píng)價(jià)

我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定低咖啡堿茶樹特異種質(zhì)資源咖啡堿含量不超過(guò)1.5%［24］。選育低咖啡堿茶樹品種，天然低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源的篩選、鑒定及評(píng)價(jià)尤為重要。

經(jīng)過(guò)一系列的研究與選擇，目前已篩選出部分低（無(wú)）咖啡堿茶樹種質(zhì)資源。早在20世紀(jì)80年代日本就已開(kāi)始低咖啡堿茶樹新品系選育，并選出8份咖啡堿含量低于2%的茶樹品系［25］。目前，日本等國(guó)已鑒定出咖啡堿低于0.5%的茶樹育種材料［26］。我國(guó)低咖啡堿茶樹資源非常豐富，科研工作者不斷加大對(duì)特異種質(zhì)資源的篩選力度，獲得一些低咖啡堿育種材料，尤其是近年來(lái)獲得了多個(gè)咖啡堿含量低于1.5%的茶樹育種新材料［27］，低咖啡堿育種已經(jīng)取得良好進(jìn)展。

20世紀(jì)80年代，張宏達(dá)等［28］在廣東龍門發(fā)現(xiàn)一種天然無(wú)咖啡堿的茶樹品種資源即可可茶（毛葉茶），分析表明可可茶含有4.7%可可堿而不含咖啡堿；陳盛相等［29］從四川聯(lián)江良種場(chǎng)、蒙頂山70份資源中篩選出2份咖啡堿含量春季低于2%的資源；唐一春等［9］通過(guò)對(duì)勐海國(guó)家茶樹種質(zhì)分圃100份茶樹資源農(nóng)藝性狀、生化成分及加工品質(zhì)的鑒定評(píng)價(jià)，篩選出2份（即金廠大樹茶、大壩大樹茶）咖啡堿含量分別為0.06%、0.07%的野生型特異茶樹種質(zhì)資源，但經(jīng)分析這兩種資源與國(guó)家級(jí)良種云抗10號(hào)相比經(jīng)濟(jì)性狀、生化成分含量均較差；張凱等［30］對(duì)川渝地區(qū)野生大茶樹資源進(jìn)行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)1份低咖啡堿茶樹資源黃山苦茶，咖啡堿含量只有0.323%；劉聲傳等［31］對(duì)貴州省25個(gè)縣（市）境內(nèi)53份樹齡約100年以上的野生茶樹資源的主要生化成分進(jìn)行測(cè)定評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析，篩選出1份咖啡堿含量為1.8%的資源，接近低咖啡堿資源含量；蘇會(huì)等［32］對(duì)豫南地區(qū)115份茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳變異分析，其咖啡堿變異系數(shù)為28.57%，并篩選出咖啡堿含量為0.13%的種質(zhì)資源1份；段志芬等［33］對(duì)云南景洪市49株野生古茶樹進(jìn)行低咖啡堿資源篩選，結(jié)果為低咖啡堿含量（≤1.50%）特異資源有 14 份，咖啡堿含量極低的（≤0.70%）有4份，即曼加坡坎3號(hào)大茶樹、光明水庫(kù)2號(hào)大茶樹、大寨5號(hào)大茶樹和曼加坡坎6號(hào)大茶樹，占總資源數(shù)的8.16%。這些低咖啡堿特異種質(zhì)資源的篩選與發(fā)現(xiàn)，可為選育低咖啡堿茶樹品種奠定基礎(chǔ)。

1.2 低咖啡堿茶樹品種常規(guī)選育研究進(jìn)展

利用已篩選出的低咖啡堿種質(zhì)資源，并通過(guò)一定的育種技術(shù)研究與試驗(yàn)，目前低咖啡堿茶樹育種已取得一些進(jìn)展。

日本用篩選出的咖啡堿含量低的品種與藪北種雜交獲得8個(gè)咖啡堿含量低于1.7%的單株后代，最低的為1.42%，且通過(guò)對(duì)茶樹和茶樹近緣種進(jìn)行種間雜交試驗(yàn)，選育出多個(gè)咖啡堿含量在1.5%以下的單株［25］。葉創(chuàng)興等［34］對(duì)毛葉茶進(jìn)行育種研究，現(xiàn)已選出純種的可可茶，為進(jìn)行優(yōu)良無(wú)性系品種選育打下基礎(chǔ)。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶研究所和中山大學(xué)合作，以野生南昆山白毛茶為親本雜交選育出一批可可茶新品系，其中“可可茶l號(hào)”和“可可茶2號(hào)”的咖啡堿含量幾乎為零［35］。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)運(yùn)用多項(xiàng)現(xiàn)代技術(shù)，雜交選育出一種低咖啡堿茶樹品種“蘇安特”，使茶葉中咖啡堿含量從4%左右降低為0.79%，而茶葉中原來(lái)的其它一些營(yíng)養(yǎng)成分保持不變［36］。Ogino等［26］在“Cha Chuukanbohon Nou 6”（雜交組合Camellia taliensis×C.sinensis的后代）天然雜種中鑒定出咖啡堿含量很低但可可堿含量很高的單株2個(gè)。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)在茶樹與油茶嫁接選育低咖啡堿茶樹品種研究中發(fā)現(xiàn)，采用地上部根頸嫁接法，以多抗香品種茶樹作接穗，嫁接后的苗木中咖啡堿含量由3.08%降低到2.01%，因此可以認(rèn)為茶樹與油茶嫁接是降低茶樹咖啡堿含量的有效方法之一［37］。

1.3 常規(guī)育種的缺點(diǎn)與面臨的困難

常規(guī)育種選育低咖啡堿茶樹品種有一些缺點(diǎn)與困難，使得選育新品種進(jìn)展緩慢。面臨的困難主要有：一是茶樹屬木本植物，生育周期長(zhǎng)，常規(guī)育種需要20年左右時(shí)間，年限較長(zhǎng)，耗費(fèi)人力、物力、財(cái)力較大；二是缺乏天然可利用的優(yōu)質(zhì)低咖啡堿育種材料，現(xiàn)階段篩選的低咖啡堿種質(zhì)資源一般品質(zhì)性狀較差，產(chǎn)量較低；三是篩選的有些低咖啡堿野生種質(zhì)資源與栽培茶樹雜交易發(fā)生不孕或胚發(fā)育不完全現(xiàn)象，難以獲得雜種后代，即使獲得低咖啡堿雜交種，也大多品質(zhì)不佳，難以大范圍推廣應(yīng)用；四是咖啡堿含量屬于數(shù)量性狀，易受栽培條件、外界環(huán)境條件的變化而不穩(wěn)定，需多次重復(fù)鑒定，效率較低。鑒于此，近年來(lái)，利用傳統(tǒng)育種方法選育低咖啡堿茶樹雖取得一些進(jìn)展，但無(wú)論是可可茶，還是選育的其它低咖啡堿茶樹資源均未獲得大規(guī)模的開(kāi)發(fā)利用。目前為止，還未通過(guò)常規(guī)育種選育出適應(yīng)市場(chǎng)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種。

2 應(yīng)用基因工程降低茶樹咖啡堿研究

基因工程育種是指有目的地將外源基因?qū)胫参锊⑹怪?、表達(dá)和遺傳，修飾原有植物遺傳物質(zhì)、改造不良的園藝性狀而進(jìn)行的新品種育種方法?；蛴N可以快速實(shí)現(xiàn)定向選擇育種目標(biāo)，大大縮短育種周期，利用基因工程可以在較短時(shí)間內(nèi)培育低咖啡堿茶樹，而且不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株的其它生化成分，因此利用基因工程來(lái)培育低咖啡堿茶樹品種是一條新途徑。

2.1 茶樹體內(nèi)咖啡堿合成途徑中相關(guān)酶的基因分離與克隆

關(guān)于咖啡堿的合成途徑大多是通過(guò)對(duì)咖啡果和茶樹的研究得來(lái)的，經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證明，咖啡堿在各種含咖啡堿植物中合成的基本路徑基本一致［38］。研究者在大量研究基礎(chǔ)上，將咖啡堿的合成途徑分成兩個(gè)部分：核心途徑和供體途徑［39］。

2.1.1 核心途徑 咖啡堿合成的核心途徑主要分為四個(gè)步驟，包括甲基化轉(zhuǎn)移酶催化的三次甲基化作用和核糖核苷水解酶催化的一次脫核苷作用［40］，具體途徑為：黃嘌呤核苷（xanthosine）→7-甲基黃嘌呤核苷（7-methylxanthosine）→7-甲基黃嘌呤（7-methylxanthine）→可可堿（theobromine）→咖啡堿［41］。N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NMT）是咖啡堿合成過(guò)程中的重要酶。

在咖啡堿合成的核心途徑中，第一步甲基化反應(yīng)是由7位N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。Negishi等［42］從茶樹葉片中獲得7-NMT（黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶），并證明它是催化第一步反應(yīng)的酶。Mizuno等［43］從咖啡樹中克隆出該酶全長(zhǎng)編碼基因cDNA CmXRS1（AB034699），其在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白顯示N-甲基轉(zhuǎn)移活性。第二步和第三步甲基化反應(yīng)分別由3位和1位N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。Suzuki等［44］從茶葉提取物中分離出這兩種酶，分別催化可可堿、咖啡堿的反應(yīng)生成，并證明這兩種酶具有相似性質(zhì)。Kato等［45，46］從茶葉嫩葉中分離出咖啡堿合成酶（CS），利用RACE技術(shù)克隆出該酶編碼cDNA，TCS1（AB031280），并通過(guò)體外表達(dá)和功能驗(yàn)證證實(shí)TCS1為編碼茶樹咖啡堿合成酶的基因。

由7-甲基黃嘌呤核苷合成7-甲基黃嘌呤由核糖核苷水解酶催化完成。Negishi等［47］曾從茶樹粗酶液中檢測(cè)出核糖核苷水解酶的活性并純化出部分該酶，但關(guān)于該酶的基因克隆及相關(guān)的蛋白表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。

2.1.2 供體途徑 在供體途徑中，有多種來(lái)源可以最終合成黃嘌呤核苷，從而為核心途徑提供起始甲基受體。目前至少發(fā)現(xiàn)存在四條不同的合成途徑，分別是：嘌呤環(huán)從頭合成途徑、腺嘌呤核苷酸（AMP）降解途徑、鳥嘌呤核苷酸（GMP）降解途徑以及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循環(huán)途徑［39，48］。

茶樹黃嘌呤核苷主要來(lái)源于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM合成酶是咖啡堿合成過(guò)程中的重要酶之一。馮艷飛等［49］首次從茶樹葉片中克隆茶樹S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶基因cDNA，sAMS（Gen Bank登錄號(hào)：AJ277206，DDBJ登錄號(hào)：AB041534），所得基因序列長(zhǎng)1 303 bp，編碼394個(gè)氨基酸，該基因的克隆為今后咖啡堿代謝的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。IMPDH（次黃嘌呤核苷酸脫氫酶）是催化次黃嘌呤核苷酸（IMP）轉(zhuǎn)化為黃嘌呤核苷酸（XMP）的關(guān)鍵酶。Keya等［50］首次克隆得到IMPDH基因編碼cDNA，TIDH（EU106658），并證明其在咖啡堿合成途徑中起關(guān)鍵作用。AMP脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸（AMP）→次黃嘌呤核苷酸（IMP）反應(yīng)。魏艷麗等［51］首次通過(guò)從茶樹全器官轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中獲得的AMP脫氨酶的部分EST序列成功克隆出茶樹AMP脫氨酶cDNA的全長(zhǎng)（GenBank登錄號(hào)：AGJ84350.1），通過(guò)對(duì)不同物種的AMP脫氨酶氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，茶樹的AMP脫氨酶與其它植物克隆出的AMP脫氨酶基因有較高的同源性，并含有相似的蛋白質(zhì)保守活性位點(diǎn)。

目前，催化黃嘌呤核苷酸（XMP）→xanthosine（黃嘌呤核苷）的核苷酸酶、鳥嘌呤脫氨酶（guanine deaminase，GDA）在茶樹葉片中也已被檢測(cè)到［52，53］，但是關(guān)于它們完整的基因序列還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

2.2 茶樹體內(nèi)咖啡堿合成途徑中相關(guān)酶及基因研究利用

根據(jù)已獲得的咖啡堿合成途徑中相關(guān)酶的基因序列信息，不同地區(qū)研究者已展開(kāi)一系列研究與探討。

余有本［54］從龍井43中克隆了茶樹咖啡堿合成酶的cDNA編碼區(qū)序列及cDNA全長(zhǎng)序列；李遠(yuǎn)華等［55］采用原位雜交技術(shù)研究，結(jié)果表明茶樹咖啡堿合成酶基因（TCS1）mRNA表達(dá)主要存在于含葉綠體多的柵欄組織。陳麗萍等［56］在紅山茶、油茶和可可茶基因組中PCR擴(kuò)增TCS1部分片斷，結(jié)果僅在可可茶中獲得目的片斷，并推測(cè)其核苷酸序列的差異可能是導(dǎo)致南昆山毛葉茶NMT基因活性改變、影響茶樹體內(nèi)咖啡堿代謝的原因之一；許煜華等［57］在英紅9號(hào)中分離出12條核苷酸序列高度相似的NMTs；金基強(qiáng)等［58］利用長(zhǎng)片段PCR法和側(cè)翼序列克隆技術(shù)分離了白葉一號(hào)多個(gè)NMTs的基因組DNA（gDNA）全長(zhǎng)并初步明確了它們的基因結(jié)構(gòu)和序列差異。這些研究表明茶樹存在著一個(gè)與嘌呤堿合成相關(guān)的NMT基因家族。李金等［59］研究10個(gè)茶樹品種咖啡堿合成途徑中3個(gè)關(guān)鍵酶基因（TCS1、TIDH、SAMS）秋季的表達(dá)量，并與咖啡堿含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，與TIDH、SAMS相比，TCS1對(duì)茶樹咖啡堿的合成起到更為重要的作用。周晨陽(yáng)等［60］對(duì)茶樹TIDH DNA序列進(jìn)行了克隆，在檢測(cè)95份茶樹核心種質(zhì)資源的TIDH核苷酸多態(tài)性及咖啡堿含量后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，找到2個(gè)與咖啡堿含量顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)；魏艷麗［61］用檢測(cè)48個(gè)茶樹品種得到的TCS1序列進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性與對(duì)應(yīng)的咖啡堿含量關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)995位點(diǎn)AA與CC基因型對(duì)應(yīng)的咖啡堿含量存在顯著差異（P＜0.05），該位點(diǎn)的CC基因型為低咖啡堿茶樹品種的優(yōu)勢(shì)基因。劉玉飛等［62］對(duì)673份茶樹資源的TCS1等位變異進(jìn)行鑒定，克隆了一個(gè)新的TCS1稀有等位變異TCS1g，其在“龍陵17”中具有一定的表達(dá)水平且其表達(dá)蛋白僅具有可可堿合成酶活性，推測(cè)決定TCS1g僅具有可可堿合成酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)是第221位氨基酸殘基。這些研究可為今后從基因組水平揭示不同資源間咖啡堿合成代謝差異的機(jī)理、利用特定基因選擇低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源、分子標(biāo)記輔助育種等奠定基礎(chǔ)。

2.3 基因工程在低咖啡堿茶樹育種中的探索應(yīng)用

目前，咖啡堿合成過(guò)程中重要相關(guān)酶如咖啡堿合成酶、SAM合成酶、次黃嘌呤核苷酸脫氫酶等基因的全長(zhǎng)cDNA序列已被克隆，不同地區(qū)研究者試圖通過(guò)基因工程來(lái)培育低咖啡堿茶樹并進(jìn)行一些探究。

反義RNA技術(shù)和RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)在植物基因工程育種中得到廣泛應(yīng)用，利用反義RNA技術(shù)和RNAi技術(shù)可以通過(guò)定向抑制咖啡堿合成過(guò)程關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)培育低咖啡堿茶樹品種。目前，其它植物已有通過(guò)該技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株來(lái)降低咖啡堿含量的報(bào)道。Ogita等［63］利用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了咖啡的轉(zhuǎn)基因植株，并證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株咖啡中可可堿合成酶CaXMT1和咖啡堿合成酶CaDXMT1基因的表達(dá)均受到抑制，從而使可可堿和咖啡堿合成量有所下降。張廣輝等［64］成功構(gòu)建了茶樹咖啡因合成酶基因RNA干涉表達(dá)載體。余有本［54］構(gòu)建了茶樹咖啡堿合成酶基因反義RNA的表達(dá)載體和RNAi表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到了茶樹愈傷組織，經(jīng)鑒定TCS反義基因已整合到抗性愈傷組織的基因組中并得到正常表達(dá)。石冠華［65］構(gòu)建了咖啡堿合成酶基因干涉表達(dá)載體，以龍井-43組培苗葉片為轉(zhuǎn)化受體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌將其導(dǎo)入植物組織中，并優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化茶樹葉片組織的條件。Mohanpuria等［66，67］將含咖啡堿合成酶基因（CS）片段的RNAi載體分別導(dǎo)入茶樹子葉的胚性愈傷組織和種子萌發(fā)一個(gè)月的茶樹幼苗根系，成功獲得含該載體的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的咖啡堿和可可堿含量分別比對(duì)照低44%～61%和46%～67%。這證實(shí)了利用基因工程技術(shù)降低茶樹咖啡堿的可能性及基因沉默的穩(wěn)定性。

2.4 基因工程在茶樹育種中所面臨的難題

基因工程為低咖啡堿茶樹育種開(kāi)辟了新途徑，但距離獲得理想的茶樹新品種還有大量的工作要做。

目前，茶樹遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域技術(shù)并不成熟。農(nóng)桿菌、基因槍等方法單獨(dú)或聯(lián)合介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化均有不少研究，但獲得轉(zhuǎn)基因茶樹卻依然非常困難。由于茶樹是多年生植物，茶樹中多酚類物質(zhì)含量高，造成培養(yǎng)時(shí)愈傷組織易褐化、難以分化，轉(zhuǎn)基因低咖啡堿茶樹研究長(zhǎng)期以來(lái)停留在載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選的階段?？偟膩?lái)說(shuō)，迄今為止還未建立起完善的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系，這也是基因工程在茶樹育種中的瓶頸問(wèn)題。

此外，利用反義RNA技術(shù)和RNA干擾技術(shù)通過(guò)目前已知的咖啡堿合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行探索與研究，雖然有些試驗(yàn)基因的表達(dá)得到抑制，轉(zhuǎn)基因植株中咖啡堿含量也有所降低，但效果不夠理想?，F(xiàn)階段茶樹體內(nèi)咖啡堿合成過(guò)程相關(guān)酶類的編碼基因并未完全獲得，每種酶類所起到的作用也并為研究透徹，咖啡堿在茶樹體內(nèi)的合成與分解、運(yùn)輸機(jī)制并未完全了解，因此獲得其余關(guān)鍵酶的編碼基因?qū)Φ涂Х葔A茶樹育種有重要影響。

3 低咖啡堿茶樹育種展望

我國(guó)茶樹種質(zhì)資源豐富多樣，近年來(lái)各地研究者對(duì)低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源考察收集、保存、保護(hù)和鑒定取得一定進(jìn)展，但距離培育出理想的低咖啡堿茶樹品種還有很長(zhǎng)的路要走。在今后工作中，繼續(xù)加強(qiáng)優(yōu)異低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源的收集與優(yōu)良基因的鑒定，并利用現(xiàn)代手段從中發(fā)掘咖啡堿合成酶稀有等位基因資源，探析其遺傳機(jī)制，能夠?yàn)椴铇湫缕贩N選育、茶樹遺傳改良提供物質(zhì)基礎(chǔ)與理論依據(jù)；同時(shí)應(yīng)把現(xiàn)代分子育種與常規(guī)育種相結(jié)合，縮短育種年限，提高育種效率。

目前，與咖啡堿合成相關(guān)酶的基因克隆取得很大進(jìn)展，但仍有酶類基因編碼并未獲得，因此有必要開(kāi)展研究掌握更多的基因信息，進(jìn)而更加深入研究咖啡堿代謝機(jī)制與遺傳機(jī)制；可運(yùn)用關(guān)聯(lián)分析研究，尋找與咖啡堿含量具有緊密遺傳連鎖的分子標(biāo)記探究茶樹咖啡堿含量的影響因素；用現(xiàn)代技術(shù)手段明確其咖啡堿合成過(guò)程中酶的基因結(jié)構(gòu)和核苷酸變異，從基因組水平剖析茶樹咖啡堿的遺傳機(jī)制，為茶樹低咖啡堿育種奠定基礎(chǔ)。此外，積極開(kāi)展茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，建立能夠穩(wěn)定遺傳親本優(yōu)良特性的高效的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化體系，也是開(kāi)展利用基因工程培育低咖啡堿茶樹必須解決的難題。

除此之外，采用人工誘導(dǎo)突變創(chuàng)造低咖啡堿突變體，結(jié)合生化標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行輔助育種，也是低咖啡堿茶樹育種的重要思路與方法。