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    新城疫、禽流感血凝抑制試驗(yàn)解析

    2021-12-09 05:33:36楊麗仙孫艷平肖桂萍周顯珍王喬平董昱廷
    中國畜禽種業(yè) 2021年11期
    關(guān)鍵詞:血凝滴度懸液

    楊麗仙 孫艷平* 肖桂萍 周顯珍 王喬平 董昱廷

    (1,云南省曲靖市動物疫病預(yù)防控制中心 655000;2,云南省曲靖市獸藥飼料監(jiān)察所 655000)

    血凝與血凝抑制試驗(yàn)(HA-HI 試驗(yàn)) 具有經(jīng)濟(jì)、快速、可靠、操作簡便的特點(diǎn),可在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品報(bào)告禽類血樣的抗體水平,是我國各地防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)和養(yǎng)殖場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、疾病診斷及免疫效果監(jiān)測的主要方法之一。實(shí)踐中,HA-HI 試驗(yàn)的操作易受樣品、試劑、器材、人員、環(huán)境等因素影響,使其敏感度、準(zhǔn)確度降低,造成試驗(yàn)結(jié)果偏差,甚至誤判,只有充分理解試驗(yàn)的各方面實(shí)質(zhì)和要領(lǐng),才能熟悉應(yīng)用好本試驗(yàn)原理。

    1 原理

    細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面覆蓋、吸附抗原的顆粒性物質(zhì),與相應(yīng)抗體(免疫血清、疫病恢復(fù)期血清)結(jié)合后,在電解質(zhì)參與下,經(jīng)過一定的時(shí)間,顆??乖荒纬扇庋劭梢姷膱F(tuán)塊,這類試驗(yàn)統(tǒng)稱為凝集試驗(yàn),新城疫、禽流感許多病毒的包膜中含有按病毒密碼合成的蛋白質(zhì),這種蛋白質(zhì)(血凝素)有凝集某些動物紅細(xì)胞的能力,稱為紅細(xì)胞凝集,簡稱血凝(HA) 試驗(yàn)。血凝試驗(yàn)?zāi)鼙幌鄳?yīng)的特異性抗體抑制,阻斷病毒顆粒表面的抗原與紅細(xì)胞凝集,先使抗體與病毒結(jié)合,血凝素不能吸附于紅細(xì)胞表面的受體上,紅細(xì)胞將進(jìn)行自然下落,沉降到V 形孔底部,這種紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)簡稱血凝抑制(HI) 試驗(yàn)。

    2 材料與方法

    2.1 材料

    微量移液器、96 孔微型血凝反應(yīng)板、微量振蕩器、加樣槽、微量移液器槍、新城疫(禽流感)標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽性血清、陰性血清與待檢血清、1%雞紅細(xì)胞懸液、PBS 液。

    2.2 方法步驟

    2.2.1 1%雞紅細(xì)胞懸液配制

    (1)為避紅細(xì)胞自凝現(xiàn)象,配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)采集3只SPF 雞或未免疫的成年公雞血液(抗凝劑與血液比例為1:4,每只雞的紅細(xì)胞分別抗凝保存)。

    (2)將抗凝紅細(xì)胞加入10ml 離心管中,加入3~4 倍體積生理鹽水,以2000~3000r/min,離心5~10min,棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜,再加入10 倍以上血量的生理鹽水,上下緩慢顛倒或用吸管輕輕吹打數(shù)次(切忌用力過大使紅細(xì)胞破裂),使其充分混勻,再離心棄去上清液,反復(fù)離心、洗滌3~5 次(如果不能確保供采紅細(xì)胞公雞是否免疫過,可多洗1~2 次)直至上清液清亮透明為止。用吸管輕輕吸走上層上清液和白細(xì)胞、血小板備用。

    圖1 全血離心后實(shí)物圖

    (3)用生理鹽水配制1%的紅細(xì)胞工作液(為保證不取到雜質(zhì)和破壞紅細(xì)胞,吸取紅細(xì)胞時(shí),吸取過程中吸口保持在液面下,接近離心管底處慢吸慢出)。

    2.2.2 血凝試驗(yàn)(4 單位抗原的制備)

    (1)用滅菌的生理鹽水按說明稀釋、混勻新城疫、禽流感病毒。

    (2)取96 孔V 形微量反應(yīng)板,加生理鹽水或PBS 作稀釋液。

    (3)吸取0.025ml 新城疫(禽流感)病毒均勻懸液分別加入第1 孔,移液器吹打3~5 次充分混勻,從第一孔中吸取0.025ml 混勻后的病毒液加到第二孔,混勻后吸取0.025ml 加入第三孔,依次進(jìn)行倍比稀釋到第十一孔,從第十一孔吸取0.025ml 棄之,換吸頭。

    (4)加0.025ml 稀釋液(可以理解為補(bǔ)液,使每孔的總反應(yīng)體積和后面的HI 試驗(yàn)統(tǒng)一成75ml,確保不讓肉眼和液體表面張力等因素差異而影響結(jié)果的判定)。

    (5)加0.025ml 1%雞紅細(xì)胞懸液(輕緩、充分混勻紅細(xì)胞液,搖動容器時(shí)不能用力過猛而使紅細(xì)胞破裂)振蕩混勻,室溫20~25℃下靜置40min 后觀察結(jié)果,也可4℃靜置60min,生理鹽水對照孔的紅細(xì)胞成明顯的紐扣狀沉淀到孔底時(shí)判定結(jié)果。

    (6)在生理鹽水對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下,將反應(yīng)板45°角傾斜,看紅細(xì)胞的凝集程度(可從反應(yīng)板的背面觀察)。完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位(HAU),1個血凝單位稀釋倍數(shù)除以4 即為含4HAU 的抗原的稀釋倍數(shù)。

    2.2.3 血凝抑制試驗(yàn)

    血凝抑制試驗(yàn)方法是將受檢血清與標(biāo)定好的抗原發(fā)生充分反應(yīng),從而達(dá)到抑制病原和紅細(xì)胞凝集。

    (1)在微量反應(yīng)板中加入0.25ml 生理鹽水。

    (2)分別吸取0.25ml 血清樣本、陰性、陽性對照樣品加入各自設(shè)定排的第1 孔,依次倍比稀釋至設(shè)定的最后孔。從最后孔吸取0.025ml 棄之,換吸頭。

    (3)除空白對照外,其他各孔加入4HAU 混勻的病毒抗原液0.25ml,室溫(約20℃)靜置至少30min。

    (4)每孔加入0.25ml 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻,輕輕混勻,靜置40min(約20℃)。

    (5)結(jié)果判定:對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)紐扣狀完全沉淀于孔底(周邊液體透明清亮)時(shí)判定結(jié)果。

    以完全抑制4 個HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI 滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于2 log2,陽性對照孔血清誤差不超過1 個滴度的試驗(yàn)結(jié)果才有效。

    3 討論

    3.1 本試驗(yàn)采用4 單位的抗原

    一方面跟人們認(rèn)識事物的習(xí)慣有關(guān),人們目測實(shí)物時(shí)通常會把整件物品意向地分成4 等份,同樣把血凝反應(yīng)程度分成相等的4 份:出現(xiàn)大的凝集片或小的顆粒狀物,液體完全透明,為全部凝集,記作++++;有明顯的凝塊,液體幾乎透明,也可以理解成有3/4 凝集,1/4 不凝集,記作+++;有可見的凝集塊,液體半透明,可以看有2/4(一半)凝集,一半的不凝集,記作++;液體渾濁,僅可見少數(shù)顆粒狀物,可理解成有1/4 凝集,3/4 不凝集,記作+;液體均勻渾濁,無任何凝集物,記作—。

    另一方面是試驗(yàn)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)的必然,我們知道抗原與抗體或紅細(xì)胞是按一定比例結(jié)合的,當(dāng)比例合適時(shí)結(jié)合最充分,復(fù)合物最多,反應(yīng)最明顯,結(jié)果出現(xiàn)最快,我們稱之為等帶;如果比例不當(dāng),抗原或抗體過剩時(shí),未被結(jié)合的抗原或抗體會游離在液體中,出現(xiàn)前帶現(xiàn)象,呈現(xiàn)微凝集和不凝集。實(shí)踐證明,免疫血清抗體的量是絕對充裕,充裕到從1:2~1:4096 甚至更高后恰好適合和4 倍抗原相結(jié)合。

    3.2 測定抗原效價(jià)

    在測定抗原效價(jià)時(shí),如果遇到所做的幾排平行血凝試驗(yàn)出現(xiàn)在相鄰滴度之間無法確定的情況,可取中間值或中間偏前或后的1/4 值,測定情況見圖2,第一、二排的第9 孔剛好完全凝集,滴度為1:512;第三、四排在的8 孔剛好完全凝集,滴度為1:256??梢园磧蓚€滴度的中間值1:384 來配抗原,4 倍血凝單位抗原所對應(yīng)的稀釋比例就為1:96。注:256+(512-256) ÷2=384,384÷4=96。

    圖2 抗原效價(jià)測定情況圖

    3.3 4HAU 抗原液反測

    在測定抗原效價(jià)時(shí)很容易引起較大誤差,可以從反方向來測看所配制的抗原是否最接近真正意義的4 倍抗原:在稀釋板上生理鹽水0.025ml,把已經(jīng)配好的抗原工作液按倍比稀釋,后依次每孔加0.025ml 生理鹽水和1%的雞紅細(xì)胞懸液,輕輕混勻,靜置40min(約20℃),實(shí)時(shí)觀測結(jié)果,如果這時(shí)1:4(理論值應(yīng)該為1HAU)稀釋的孔剛好完全凝集,說明我們所配抗原就是4 倍抗原;如果是1:2 稀釋的孔剛好完全凝集,所配的抗原不是4 倍而是2 倍抗原,就需要按要求加抗原原液來使其達(dá)到4 倍抗原;如果是1:8 稀釋的孔剛好完全凝集,所配的抗原不是4 倍而是8 倍抗原,那么就可以在已配抗原液中添加生理鹽水使其稀釋為4 倍抗原液。

    3.4 影響試驗(yàn)的因素

    3.4.1 溫度

    本試驗(yàn)反應(yīng)與溫度密切相關(guān),一定溫度可以增強(qiáng)抗原與抗體、紅細(xì)胞的結(jié)合機(jī)會,加快反應(yīng)速度,本試驗(yàn)室溫(20~25℃)或4℃溫度過高或過低會致反應(yīng)不充分。

    3.4.2 電解質(zhì)

    適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)能降低抗原抗體結(jié)合物表面的負(fù)電荷,使之失去相互排斥的能力,呈現(xiàn)沉淀或凝集,常用0.85%~0.90%的生理鹽水或pH 為7.2 的PBS 液。

    3.4.3 時(shí)間

    抗原、抗體要結(jié)合30min;抗原和紅細(xì)胞凝集反應(yīng)40min。如果時(shí)間不夠則反應(yīng)不充分,時(shí)間過長、水分蒸發(fā)或凝集塊解體而紅細(xì)胞重新下沉。

    3.4.4 酸堿度

    本試驗(yàn)適宜的pH 為6~8,過高或過低的pH 均可使抗原抗體復(fù)合物重新離解,或紅細(xì)胞破裂。當(dāng)pH 降至3 左右可引起非特異性酸性凝集。

    3.4.5 雜質(zhì)異物

    無關(guān)蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、多糖等非特異性物質(zhì)和雜質(zhì)會抑制正常反應(yīng),引起非特異性反應(yīng)。

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