吉林省大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀與遺傳特性及致病性分析

范惠冬 林巖 耿偉 劉燕妮 毛芙蓉 鄭建超 鄭士金 惠云芝

摘要：茄子黃萎病發(fā)生在門茄坐果后，是危害茄子生產(chǎn)的重要病害。茄子黃萎病由大麗輪枝菌引起，為深入研究吉林省大麗輪枝菌的群體遺傳變異，對分離自吉林省的36株大麗輪枝菌進行培養(yǎng)性狀觀察、遺傳特性分析和致病性鑒定。大麗輪枝菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后形成菌核型、中間型2種菌落形態(tài)，其中83.3%的為菌核型，16.7%為中間型，未分離得到菌絲型菌株。利用PCR技術檢測大麗輪枝菌的Ave1無毒基因、致病類型、交配型。結果表明，36株大麗輪枝菌均不含Ave1無毒基因，致病類型均為非落葉型，交配型均為MAT1-2。選取6株大麗輪枝菌進行致病性鑒定，結果表明，6株大麗輪枝菌均可不同程度引起茄子黃萎病，其中2號大麗輪枝菌菌株致病力最強，4號菌株致病力最弱。研究結果可為茄子抗黃萎病育種和針對性制定茄子黃萎病防控方法提供技術支持。

關鍵詞：大麗輪枝菌;培養(yǎng)性狀;致病類型;致病性鑒定;遺傳特性

中圖分類號：S436.411?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0125-07

收稿日期：2021-03-11

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃技術攻關項目（編號：20190301053NY）。

作者簡介：范惠冬（1990—），女，吉林長春人，碩士，研究實習員，研究方向為蔬菜病蟲害及蔬菜育種。E-mail：fanhuidong1812@163.com。

通信作者：惠云芝，碩士，研究員，主要從事茄子育種研究。E-mail：110555166@qq.com。

大麗輪枝菌屬輪枝菌屬 （Verticillium） 真菌，由大麗輪枝菌引起的茄子黃萎病是危害茄子生產(chǎn)最重要的土傳病害，黃萎病發(fā)病輕時造成茄子減產(chǎn)20%，發(fā)病嚴重時造成茄子減產(chǎn)60%甚至絕產(chǎn)。由于大麗輪枝菌致病機制復雜，茄子抗病育種工作滯后同時生產(chǎn)中缺少對茄子黃萎病科學有效的防治方法，導致茄子黃萎病每年在茄子產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生，造成巨大經(jīng)濟損失。研究引起茄子黃萎病的病原菌群體遺傳變異及致病類型對茄子黃萎病防治及抗黃萎病育種有重要意義。

目前研究普遍認為，茄子對大麗輪枝菌無小種特異性抗性，無法將大麗輪枝菌劃分race1和race2，但可通過Ave1無毒基因檢測研究潛在的生理小種類型[1]。通過現(xiàn)代分子生物學技術、培養(yǎng)性狀觀察等方法可對大麗輪枝菌進行生理型劃分。通過培養(yǎng)性狀觀察將大麗輪枝菌分為菌核型、中間型、菌絲型[2];利用特異性引物檢測可將大麗輪枝菌的致病類型劃分為非落葉型、落葉型[3]，落葉型菌株可以引起發(fā)病植株落葉，非落葉型植株不易引起發(fā)病植株落葉。交配型基因座是控制子囊真菌有性繁殖和交配親和性的遺傳基礎，交配型基因座含有交配型基因（ mating-type，簡稱MAT）。按大麗輪枝菌所含的交配型基因將菌株分為交配型1和交配型2，同宗配合的子囊真菌可由單個含有MAT1-1和MAT1-2交配型的菌株完成有性生殖過程為交配型1，異宗配合的子囊真菌因2種交配型基因分別存在2種不同類型的菌株中，有性生殖需由分別含有MAT1-1 和 MAT1-2的2種交配型基因座的交配型菌株共同完成為交配型2。盡管大麗輪枝菌目前仍以無性生殖方式繁殖，但關于大麗輪枝菌有性生殖的研究正逐步深入。

由于種植模式及管理方式不合理等原因，茄子黃萎病呈爆發(fā)式增長，但相關研究仍然很少，且研究深入性不夠。此外，生產(chǎn)中缺少對黃萎病高抗的茄子品種也是導致茄子大面積發(fā)生黃萎病的原因。對茄子品種進行抗病性鑒定淘汰感病品種，種植高抗、中抗品種是解決茄子黃萎病最理想的方法。本研究以分離自吉林省的大麗輪枝菌為研究材料，對菌株是否有Ave1無毒基因[4]、培養(yǎng)特性、致病力分化、交配型及菌株致病性等方面進行研究，以期為茄子黃萎病育種及防治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

2017年至2020年分別在吉林省長春市雙陽區(qū)、公主嶺市、德惠市等地采集茄子黃萎病發(fā)病植株樣品，在實驗室分離純化后共得到60株引起茄子黃萎病的大麗輪枝菌菌株，經(jīng)顯微鏡觀察鑒定后，低溫保存[5-7]。

1.2 PDA培養(yǎng)性狀觀察

選取36株初期菌落培養(yǎng)表型不同的大麗輪枝菌菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上活化，在溫度為25 ℃條件下培養(yǎng)5 d后，取菌落邊緣菌絲再次活化，14 d后觀察菌落形態(tài)，每個菌株重復培養(yǎng)3次。

1.3 PCR檢測

1.3.1 提取菌株基因組DNA 取活化好的菌絲接種到鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，在溫度為 25 ℃ 條件下培養(yǎng)7 d后，在菌株未形成過多菌核之前，用鑷子刮取玻璃紙上的菌絲和微菌核于2 mL離心管中，液氮預冷后用研缽研磨呈細粉狀，采用真菌基因組提取試劑盒[購自生工生物工程（上海）股份有限公司]，提取36株菌株的基因組DNA，低溫保存[8-9]。

1.3.2 引物設計 大麗輪枝菌檢測采用引物：ITS1（5′-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-CCTCCGCTTATTAATATGC-3′）確定菌株是否為大麗輪枝菌，擴增目的條帶大小為503 bp;生理小種檢測采用引物：Ave1-F（5′-AAGGGGTCTTGCTAGGATGG-3′）、Ave1-R（5′-TGAAACACTTGTCCTCTTGCT-3′）擴增目的片段大小為900 bp，檢測分離菌株是否含有無毒基因;致病類型中落葉型檢測引物采用：D-F（5′-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3′）、D-R（5′-GACACGGTATCTTTGCTGAA-3′）擴增目的條帶大小為550 bp，致病類型中非落葉型檢測引物采用：ND-F（5′-CAGGGGATACTGGTACGAGACG-3′）、ND-R（5′-ATGAGTATTGCCGATAAGAACA-3′）擴增目的條帶大小為1 500 bp;交配型1檢測引物采用：MAT1-F（5′-CCACTCGAAACCCCACCGTC-3′）、MAT1-R（5′-GGCCTCCATGTTGTAAGCGT-3′）擴增目的條帶大小為997 bp;交配型2檢測引物采用：MAT2-F（5′-CAGGCCCATGGTCGTGAT-3′）、MAT2-R（5′-CTAGCTGTGCTGCCACTTGTTC-3′）擴增目的條帶大小為669 bp，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 PCR反應和擴增 檢測所提取的菌株基因組DNA質量并10倍稀釋后作為PCR程序模板，PCR擴增所用酶采用購自生工生物工程（上海）股份有限公司的Taq PCR Master Mix （2X，with Blue Dye），所有PCR擴增均采用總量為25.0 μL的體系進行，DNA模板2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq PCR Master Mix （2X，with Blue Dye） 12.50 μL，補超純水至 25.0 μL。PCR程序為94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，循環(huán)30次;2 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，紫外凝膠成像儀觀察結果。

1.4 致病性鑒定

隨機選取36株大麗輪枝菌中的6株重新編號進行致病性鑒定，將帶有活化好大麗輪枝菌的PDA菌餅接種到液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，每300 mL液體培養(yǎng)基放4～5個菌餅，25 ℃搖培14 d后，用血球計數(shù)板計數(shù)，當大麗輪枝菌孢子濃度達到 1×107個/mL 后，用4層紗布過濾孢子懸浮液備用。大麗輪枝菌接種采用傷根接種法，供試茄子品種為同一品種，由吉林省蔬菜花卉科學研究院提供。待生長在無菌土上的茄子幼苗長到3葉1心時，將幼苗從穴盤中拔出，減掉1 cm須根，浸泡在濃度為 1×107個/mL孢子懸浮液中15 min，對照組用清水浸泡15 min，再將所有幼苗重新移至穴盤中，黑暗保溫保濕培養(yǎng)48 h后進行正常培養(yǎng)，適時澆水。每個試驗組樣本量至少為20株茄子幼苗，茄子幼苗接種30 d后調查幼苗發(fā)病情況。

病害分級按照肖蘊華等分級方法[10]進行，1 級：只有第1真葉變黃或卷曲;2 級：第3真葉以下部分表現(xiàn)黃萎，葉片有脫落;3 級：只有1片新生的展開真葉表現(xiàn)健康，植株落葉明顯;4級：所有展開的真葉全部脫落，植株只剩1片旗葉;5 級：植株死亡;分別調查茄子幼苗發(fā)病率，統(tǒng)計病情指數(shù)，試驗數(shù)據(jù)用 SPSS 統(tǒng)計軟件進行方差分析。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%;

病情指數(shù)=[∑（各級病株數(shù)×相對應的病級值）/（總株數(shù)×5）]×100。

2 結果與分析

2.1 分離鑒定及培養(yǎng)性狀觀察

大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后觀察，菌落培養(yǎng)性狀差異明顯，依據(jù)3種菌落類型進行統(tǒng)計。菌核型菌落（H）：菌絲生長一段時間后形成大量布滿基質的微菌核，菌落呈黑色;菌絲型菌落（S）：菌株培養(yǎng)14 d后菌落仍以菌絲存在，無微菌核形成，菌落呈白色;中間型菌落（M）：菌株培養(yǎng)14 d后一部分菌絲形成黑色微菌核，一部分仍以菌絲形態(tài)存在，菌落既有白色菌絲也有黑色菌核;中間型菌落介于菌核型和菌絲型菌落之間，3種培養(yǎng)性狀的大麗輪枝菌菌落均具有明顯輻射狀紋路。供試36株菌株中，6株為中間型菌落，占16.7%，30株為菌核型菌落，占83.3%，菌核型大麗輪枝菌占絕對優(yōu)勢，本研究未分離到菌絲型大麗輪枝菌，菌落培養(yǎng)形態(tài)結果見圖1，每個菌株均展示了菌落正面和反面的形態(tài)，菌株類型統(tǒng)計結果見表1。

采用引物ITS1/ITS4分別檢測36株菌株，菌株經(jīng)PCR擴增及凝膠電泳均能檢測到大小為503 bp的目的條帶，表明供試36株菌株均為大麗輪枝菌，電泳結果見圖2。

2.2 遺傳變異

采用引物Ave1-F/Ave1-R檢測36株大麗輪枝菌是否含有Ave1無毒基因，PCR擴增產(chǎn)物電泳供試36株大麗輪枝菌均未擴增到大小為900 bp的目的條帶，表明供試菌株均不具有Ave1無毒基因，電泳結果見圖3。

采用引物D-F/D-R、ND-F/ND-R進行PCR擴增，檢測大麗輪枝菌致病類型，以D-F/D-R為引物的PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結果（圖4-A），所有菌株均未得到大小為550 bp的目的條帶，以 ND-F/ND-R 為引物進行PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳（圖4-B），所有菌株都得到大小為1 500 bp的目的條帶，說明36株大麗輪枝菌致病類型均為非落葉型，電泳結果見圖4。

采用引物MAT1-F/MAT1-R、MAT2-F/MAT2-R檢測菌株交配類型，PCR產(chǎn)物電泳結果表明，以MAT1-F/MAT1-R為引物進行PCR擴增電泳（圖5-A），所有菌株均未得到大小為 997 bp 的目的條帶;以MAT2-F/MAT2-R為引物進行PCR擴增產(chǎn)物電泳（圖5-B），所有菌株均得到大小為669 bp的目的條帶，說明分離自吉林省的36株大麗輪枝菌均為交配型2，無交配型1，電泳結果見圖5。

2.3 致病性鑒定

大麗輪枝菌接種茄子幼苗30 d后，6株大麗輪枝菌均可不同程度地引起茄子幼苗發(fā)生黃萎病，而接種清水的對照組植株均未發(fā)生黃萎病。按照肖蘊華病害分級調查病情指數(shù)并統(tǒng)計發(fā)病率，結果見表2。其中接種2號菌株的茄子幼苗發(fā)病率為50%，病情指數(shù)為41.6，接種2號菌株的茄子幼苗發(fā)病率和病情指數(shù)在6株菌株中均最高，說明在6株大麗輪枝菌中2號菌株致病性最強;接種4號菌株的茄子幼苗發(fā)病率為20.8%，病情指數(shù)為17.5，接種4號菌株的茄子幼苗發(fā)病率最低，病情指數(shù)最低，說明4號大麗輪枝菌在6株菌株中致病性最弱，其他菌株致病性均在2號菌株和4號菌株之間，致病性鑒定結果見圖6。

3 討論與結論

我國對大麗輪枝菌的研究多針對引起棉花黃萎病的菌株，針對引起茄子黃萎病的大麗輪枝菌研究較少。近幾年北方茄子黃萎病發(fā)生面積急劇擴大，由于對病害的了解較少，導致病害未得到及時防控，發(fā)生越來越重[11]。由于不斷引進新品種，大麗輪枝菌的致病分化逐漸復雜，充分了解大麗輪枝菌致病力分化，是科學防治茄子黃萎病和抗病育種的基礎[12]。本研究以分離自吉林省的大麗輪枝菌為材料，對菌株進行培養(yǎng)性狀、群體遺傳變異和致病性分化研究。

病原菌形態(tài)變異分析多采用簡單直觀的培養(yǎng)性狀觀察法完成，雷玉明等于1997年提出大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀存在菌絲型，隨后將大麗輪枝菌培養(yǎng)類型劃分為3種，即菌核型、菌絲型、中間型[13]。本研究共分離得到60株大麗輪枝菌，選取培養(yǎng)性狀不同的36株大麗輪枝菌進行研究，發(fā)現(xiàn)吉林省大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)分為2種類型，即菌核型和中間型，且菌核型大麗輪枝菌占絕對優(yōu)勢。采用分子生物學方法利用大麗輪枝菌特異性引物鑒定病原菌種類[14]，凝膠電泳結果表明，36株菌株均能得到特異性擴增目的條帶，說明分離到的病原菌均為大麗輪枝菌，可進行后續(xù)研究。

采用分子生物學技術對大麗輪枝菌的致病類型進行研究[15]，根據(jù)引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌對棉花致病嚴重程度的不同，趙曉軍將大麗輪枝菌菌株分為落葉型（植株葉片脫落）和非落葉型（植株葉片不脫落）[16]。利用劉晶晶等設計的落葉型和非落葉型特異性引物D-F/D-R、ND-F/ND-R，鑒定分離到的大麗輪枝菌致病類型[17]，PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳結果表明，36株大麗輪枝菌均為非落葉型菌株，無落葉型菌株，該結果與喻秀秀等研究引起茄子黃萎病的大麗輪枝菌致病類型均為非落葉型的結果[18]一致。 大麗輪枝菌是否存在有性生

殖及有性生殖的方式是病原菌病理學方向研究的熱點，同時也是病蟲害科學合理防治的基礎?；蚪M學中發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌存在MAT1-1、MAT1-2這2種交配型，但二者中以MAT1-2交配型占絕對優(yōu)勢，而本研究的PCR擴增產(chǎn)物檢測結果也表明36株大麗輪枝菌交配型均為MAT1-2，無MAT1-1型，與前人相關研究結果一致。

選取6株分離到的大麗輪枝菌進行致病性鑒定，結果表明6株大麗輪枝菌均具有致病力，能夠引

起苗期茄子黃萎病，但每個菌株致病力存在差異，其中2號大麗輪枝菌致病力最強，4號菌株致病力最弱，試驗篩選出的吉林省茄子黃萎病的高致病力菌株，可用于茄子抗病性檢測，輔助抗病育種。

本試驗充實了關于引起茄子黃萎病大麗輪枝菌的相關研究。明確了大麗輪枝菌的致病類型、群體遺傳變異，篩選出高致病性菌株可以為抗黃萎病育種提供理論及技術依據(jù)。

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