李彩聯(lián) 郭艷麗 張鐵鷹 王麗華 高愛琴
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室,北京 100193;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,呼和浩特 010018)
能量飼料資源短缺限制了我國養(yǎng)殖業(yè)平穩(wěn)發(fā)展[1-2]。秸稈等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物和麩皮等糧食加工副產(chǎn)品中均含有豐富的纖維素和半纖維素,具有較強供能潛質(zhì)。若能將其高效水解利用,對緩解能量飼料供需矛盾具有重要意義。不僅纖維素本身結(jié)晶結(jié)構(gòu)影響了纖維水解酶的水解效率,同時木質(zhì)素對纖維素的包埋作用阻礙了纖維水解酶與之結(jié)合,進一步增加了高纖維飼料利用難度[3-4]。因此,消除纖維類飼料中木質(zhì)素是高效利用纖維的主要環(huán)節(jié)之一。與此同時,木質(zhì)素也是玉米、大豆等籽實植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的成分,降解其中的木質(zhì)素成分、破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、快速釋放胞內(nèi)養(yǎng)分,可以提高能量和營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。
木腐真菌通過菌絲或菌絲體在木材內(nèi)蔓延,菌絲頂端可分泌漆酶等氧化酶來氧化破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu),導(dǎo)致木材腐朽[5]。漆酶是一種含銅多酚氧化酶[6-7],廣泛分布于高等植物[8]、真菌[9-10]和細(xì)菌中[11-12],通過攻擊木質(zhì)素中酚類化合物來實現(xiàn)對木質(zhì)素的降解[13-15]。漆酶對破壞植物性飼料中木質(zhì)素結(jié)構(gòu),提高飼料利用率具有重要意義[16-18]。目前,產(chǎn)漆酶木腐真菌主要包括白腐菌、褐腐菌和軟腐菌[19]。其中,白腐菌降解木質(zhì)素的能力最強[20-22],常見白腐菌主要包括雜色云芝、血紅密孔菌、變色栓菌、黃孢原毛平革菌等[23]。這些真菌在自然環(huán)境條件下通常生長速度慢,產(chǎn)漆酶活性也普遍較低[24-25],無法滿足實際生產(chǎn)需求。因此,本研究擬通過對多株木腐菌進行平板顯色篩選,獲得高產(chǎn)漆酶菌株,并采用單因素試驗和正交試驗對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶條件進行優(yōu)化,提高其產(chǎn)酶活性,以期達到可用于改善飼料利用率的目的。
1.1.1 供試菌株
試驗共選擇33株白腐菌和褐腐菌,均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。
1.1.2 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):200 g馬鈴薯,20 g葡萄糖,20 g瓊脂,1 L去離子水。
愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基:在PDA培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積比為0.04%的愈創(chuàng)木酚。
種子培養(yǎng)基:麩皮1%,磷酸二氫鉀0.3%。
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮10 g,磷酸二氫鉀0.5%,初始含水量50%。
1.2.1 菌株活化及傳代
將33株白腐菌和褐腐菌菌株先接種至平面PDA培養(yǎng)基上,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d。
1.2.2 菌株初篩
將純化后的33株白腐菌和褐腐菌菌株再次接種至愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上,30 ℃倒置培養(yǎng)72 h。愈創(chuàng)木酚是漆酶的特征底物,菌株生長過程中產(chǎn)生的漆酶會將愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色,菌株生長越快,變色圈越大,漆酶活性越高,變色圈越深。因此,根據(jù)紅棕色變色圈大小及顏色深淺確定初篩菌株。
1.2.3 菌株復(fù)篩
1.2.3.1 種子液制備
選取平面PDA培養(yǎng)基上干凈菌絲塊,放入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)96 h。
1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)
在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,種子液接種量為10%,30 ℃恒溫培養(yǎng)不同時間,測定漆酶活性進行復(fù)篩。不同菌株發(fā)酵時間根據(jù)菌種生長狀態(tài)和菌絲密集程度確定。每個菌株6個平行。
1.2.3.3 漆酶活性測定
準(zhǔn)確稱取0.50 g均質(zhì)固態(tài)發(fā)酵樣品于50 mL離心管中,加入20 mL pH 4.5琥珀酸-氫氧化鈉緩沖液,30 ℃、120 r/min浸提30 min,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,取上清液測定漆酶活性[26-27]。
1.2.4 菌株平板生長特性
將高活性菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基中,30 ℃倒置培養(yǎng),待菌落長出后,觀察其菌落生長狀態(tài)。
1.2.5 18S rDNA菌種鑒定
根據(jù)Omega-D3390 Fungal DNA Mini Kit試劑盒說明書操作步驟提取復(fù)篩菌株基因組DNA,通過PCR擴增,合成引物,獲得18S rDNA部分序列,進行BLAST序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
分別對培養(yǎng)基接種量、含水量、通氧量、發(fā)酵時間4個因素進行單因素試驗,確定適宜發(fā)酵條件,每個處理6個平行。
1.3.1 接種量對漆酶活性的影響
在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,將種子液接種量分別設(shè)置為1%、5%、10%和20%,30 ℃培養(yǎng)150 h,測定漆酶活性。
1.3.2 含水量對漆酶活性的影響
在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基的含水量分別設(shè)置為50%、55%、60%和65%,30 ℃培養(yǎng)150 h,測定漆酶活性。
1.3.3 通氧量對產(chǎn)漆酶的影響
在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基的通氧量分別設(shè)置為0、10%、20%和30%,不同比例通氧量用含有不同數(shù)量5 mm透氣孔的封瓶膜封住瓶口,1個5 mm透氣孔代表10%通氧量,30 ℃培養(yǎng)150 h,測定漆酶活性。
1.3.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)漆酶的影響
在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基的發(fā)酵時間分別設(shè)置為90、102、114、126、138、150 h,30 ℃培養(yǎng),測定漆酶活性。
1.3.5 正交試驗
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以培養(yǎng)基接種量、含水量、通氧量和發(fā)酵時間4個因素為試驗因子,設(shè)計4因素3水平L9(34)正交試驗,選出最優(yōu)條件,每個處理6個平行。
運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,進行單因素差異顯著性方差分析,采用Duncan氏法進行組間多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著。
通過愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基對33株菌株進行培養(yǎng),各菌株產(chǎn)紅棕色氧化圈情況見圖1。由圖可知,21、24、27、29、30、31號這6株菌株無漆酶活性,2、3、4、6、7、8、9、10、11、14、15、18、19、25、26、32、33號這17株菌株的紅棕色氧化圈大且顏色深,故對這17株菌進行固態(tài)發(fā)酵與酶活性測定復(fù)篩。
圖1 高產(chǎn)漆酶菌株初篩Fig.1 Preliminary screening of high-yield laccase strains
在復(fù)篩過程中,32號菌株發(fā)酵全程無菌絲,可能未生長,無漆酶活性。由表1可知,17個復(fù)篩菌株中14號菌株漆酶活性最高,達2 029.49 U/g;25號菌株次之,漆酶活性達1 865.95 U/g,二者酶活性無顯著差異(P>0.05);但相比25號菌株,14號菌株發(fā)酵時間較長,故選擇25號菌株對其固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化。
表1 高產(chǎn)漆酶菌株復(fù)篩Table 1 Re-screening of high-yield laccase strains
25號菌株平板生長情況如圖2所示,25號菌株在PDA平板上生長較快,5 d可長滿整個平板,菌絲潔白,邊緣呈放射狀,菌落具有明顯的同心圓特征(圖2-A)。菌株經(jīng)愈創(chuàng)木酚-PDA顯色,菌落周圍及底部有紅棕色變色圈產(chǎn)生(圖2-B)。
圖2 25號菌株形態(tài)特征(A)、篩選平板變色圈(B)Fig.2 Morphological characteristic (A)and screening plate color zone (B)of strain 25
通過BLAST比對,發(fā)現(xiàn)25號菌株與靈芝屬GI-16(GanodermalucidumGI-16)序列的相似性高達99.59%。根據(jù)BLAST比對結(jié)果,取相似度較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。對系統(tǒng)進化樹分析可知,25號菌株與靈芝屬菌株最為相似,故確定25號菌株為靈芝屬。
圖3 基于18S rDNA基因序列對25號構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 25 based on 18S rDNA gene sequence
2.5.1 接種量對漆酶活性的影響
由表2可知,接種量為5%時漆酶活性最高,為3 111.53 U/g,繼續(xù)增加接種量,漆酶活性逐漸下降,接種量為20%時漆酶活性顯著低于接種量為5%和10%時(P<0.05)。這說明過高的接種量不利于該菌分泌漆酶,接種量5%較為適宜。
表2 接種量對漆酶活性的影響Table 2 Effects of inoculation amount on laccase activity U/g
2.5.2 含水量對漆酶活性的影響
由表3可知,培養(yǎng)基中漆酶活性隨著含水量增加先升高后降低,含水量為60%時,漆酶活性最高,為3 111.53 U/g,顯著高于含水量為50%、55%和65%時(P<0.05)。這說明含水量對漆酶活性影響較大,含水量過高可影響菌體通氧量,導(dǎo)致漆酶活性降低。
表3 含水量對漆酶活性的影響Table 3 Effects of water content on laccase activity U/g
2.5.3 通氧量對漆酶活性的影響
由表4可見,當(dāng)用無孔封瓶膜將瓶口封住(即通氧量為0)時,菌株生長受限,漆酶活性受到嚴(yán)重抑制。隨著通氧量增加,漆酶活性呈先升高后降低的變化趨勢,且通氧量為10%時的漆酶活性顯著高于其他通氧量(P<0.05)。這說明通氧量是影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素,通氧量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶有較大影響,過低和過高的通氧量均不利于漆酶分泌。
表4 通氧量對漆酶活性的影響Table 4 Effects of oxygen content on laccase yield U/g
2.5.4 發(fā)酵時間對漆酶活性的影響
由表5可見,隨著發(fā)酵時間延長,漆酶活性快速提高,并于發(fā)酵時間為114 h時達到最高,隨后漆酶活性呈逐漸下降趨勢。這可能是隨著發(fā)酵時間的延長,漆酶代謝產(chǎn)物積累,反饋抑制了漆酶的分泌,同時漆酶在此固態(tài)培養(yǎng)基條件下的穩(wěn)定性較差也是導(dǎo)致漆酶活性降低的原因。發(fā)酵時間為102和114 h時漆酶活性無顯著差異(P>0.05),且顯著高于其他發(fā)酵時間(P<0.05)。故以發(fā)酵時間114 h為宜。
表5 發(fā)酵時間對漆酶活性的影響Table 5 Effects of fermentation time on laccase activity U/g
對培養(yǎng)基適宜接種量、含水量、通氧量、發(fā)酵時間4個因素,進行4因素3水平的正交試驗,結(jié)果見表6。通過正交試驗極差(R)分析,培養(yǎng)基含水量對漆酶活性起決定性作用,發(fā)酵時間次之,接種量和通氧量對產(chǎn)漆酶活性影響較小。
表6 正交試驗結(jié)果與分析Table 6 Orthogonal test results and analysis
由表7可知,驗證結(jié)果與正交試驗結(jié)果一致,最適發(fā)酵條件為接種量5%、含水量62.5%、通氧量15%、發(fā)酵時間120 h,漆酶活性達9 522.22 U/g,較優(yōu)化前(3 111.53 U/g)提高了2.06倍。
表7 結(jié)果驗證Table 7 Result verification
利用成本低廉的天然有機原料為基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵,具有操作工序簡單、節(jié)能和供氧更充足等優(yōu)點,較適合于絲狀真菌生長。固態(tài)發(fā)酵也存在養(yǎng)分流動性差、發(fā)酵散熱不良和無法持續(xù)補充養(yǎng)分等缺點。因而,科學(xué)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)對提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要。本研究篩選獲得了1株靈芝屬高產(chǎn)漆酶菌,屬于絲狀真菌類,在自然界中主要生長在固態(tài)基質(zhì)中。本研究采用固態(tài)發(fā)酵方法模擬其自然生長狀態(tài),并優(yōu)化其產(chǎn)漆酶的最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵參數(shù),以期滿足實際生產(chǎn)應(yīng)用的需要。
接種量大小會直接影響菌種在培養(yǎng)基中的發(fā)酵速度和產(chǎn)酶效率。本研究結(jié)果顯示,該靈芝屬菌產(chǎn)漆酶適宜接種量為5%,而血紅密孔菌[29]、云芝[30]和變色栓菌[31]產(chǎn)漆酶適宜接種量分別為4%、10%和10%,與本研究結(jié)果存在一定差異。這可能與不同菌種之間的生長特性以及培養(yǎng)基的組成有關(guān)。高接種量雖然可以縮短菌絲繁殖達到高峰的時間,減少雜菌生長機會,但也會造成養(yǎng)分消耗過快、產(chǎn)熱積累集中或溶氧不足等問題,進而影響漆酶合成。過低接種量會導(dǎo)致發(fā)酵周期延長、生產(chǎn)效率降低和雜菌污染等風(fēng)險。本研究結(jié)果也證明了這一點,當(dāng)接種量高于5%時,漆酶活性逐漸降低。這說明在本試驗條件下過高接種量不利于該菌株分泌漆酶。
固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)適宜含水量既有利于營養(yǎng)物質(zhì)的溶解與傳遞,且使基質(zhì)呈松散狀態(tài),又有助于通氧和散熱。高恩麗[30]和張樹江[32]報道的云芝固態(tài)發(fā)酵,產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基適宜含水量為65%;江義[33]報道的栓菌屬FA-J1培養(yǎng)基含水量為70%;而孫珂[31]報道的變色栓菌漆酶培養(yǎng)基含水量為83.57%。本研究的靈芝屬菌產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基適宜含水量為62.5%。這說明不同菌種固態(tài)發(fā)酵,產(chǎn)漆酶對培養(yǎng)基中含水量需求不盡一致。此外,本研究以麩皮為主要發(fā)酵基質(zhì),而高恩麗[30]、孫珂[31]和張樹江[32]以玉米皮與麩皮混合物、玉米皮和茶渣為發(fā)酵基質(zhì)。不同基質(zhì)間持水力不同,也可能是導(dǎo)致菌株間發(fā)酵培養(yǎng)基含水量需求存在差異的原因。
微生物生長代謝越旺盛,其代謝產(chǎn)物積累越快。好氧生物發(fā)酵過程中,通常以加大通氧量的方式來提高微生物生長代謝速度。漆酶是一種氧化還原酶,需在氧的參與下才能發(fā)揮其作用。本研究發(fā)現(xiàn),適度限制試驗菌株發(fā)酵過程中的通氧量可增加漆酶產(chǎn)量。通氧量過低時,菌絲生長速度明顯減慢,使得菌絲稀疏且纖細(xì),進而影響其漆酶分泌。通氧量過高時,可能會加快漆酶氧化木質(zhì)素的速度,氧化產(chǎn)物過度積累,進而反饋抑制該菌株漆酶分泌,最終影響漆酶產(chǎn)量。有關(guān)通氧量對白腐菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響尚未見相關(guān)報道,具體的影響機制尚需進一步深入研究。
漆酶是由白腐真菌分泌的次級代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生主要發(fā)生在發(fā)酵中后期[30]。本研究結(jié)果表明,以麩皮為發(fā)酵基質(zhì),該靈芝屬菌隨發(fā)酵時間延長,漆酶活性快速升高至峰值后開始下降,發(fā)酵時間為120 h時漆酶活性達到最大。趙杰[29]將血紅密孔菌漆酶基因轉(zhuǎn)進里氏木霉后,重組漆酶培養(yǎng)96 h時活性達到最大;張樹江[32]以玉米皮和麩皮為原料,發(fā)酵10 d后云芝產(chǎn)漆酶活性達高峰;Gómez等[34]研究發(fā)現(xiàn),彩絨革蓋菌以栗子殼和麩皮為基質(zhì),發(fā)酵12 d時酶活性達到最大;Meza等[35]研究的朱紅密孔菌以木糖渣為載體,最高酶活性出現(xiàn)在發(fā)酵14 d;孫榮等[36]研究的雜色云芝發(fā)酵8 d酶活性達到最大。這些研究結(jié)果表明,不同菌株在不同的培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶適宜發(fā)酵時間各異,這一方面與菌株本身生長特性有關(guān),同時也可能與培養(yǎng)基組成和為菌株提供產(chǎn)漆酶養(yǎng)分的效率不同而異。另外,在本研究中還發(fā)現(xiàn),隨著發(fā)酵時間的延長,漆酶活性出現(xiàn)下降趨勢,這說明漆酶在本發(fā)酵條件下穩(wěn)定性較差,過長發(fā)酵時間不利于漆酶高產(chǎn)。因此,適宜的發(fā)酵時間對提高漆酶產(chǎn)量和發(fā)酵生產(chǎn)效率至關(guān)重要。
本研究在各發(fā)酵參數(shù)單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗及驗證試驗對靈芝屬菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化,將各因素最優(yōu)水平進行組合后,發(fā)酵所產(chǎn)漆酶活性提高了2.06倍。段珺等[37]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化長絨毛栓菌產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件后,漆酶活性提高了1.56倍;甄靜等[38]采用單因素試驗優(yōu)化毛栓孔菌XYG422產(chǎn)漆酶條件后,漆酶活性顯著提高;馮波等[39]研究的毛栓菌最優(yōu)產(chǎn)漆酶條件為麩皮2.0%、豆餅粉0.6%、發(fā)酵5 d,此時漆酶活性達到最大。以上研究表明,不同方法優(yōu)化不同菌株產(chǎn)漆酶條件存在一定差異,但漆酶活性均有不同幅度地提高,這說明固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)間的相互影響對提高漆酶活性至關(guān)重要。由此可知,適宜的培養(yǎng)條件更有利于白腐菌高效分泌漆酶。
本試驗篩選獲得了1株靈芝屬高產(chǎn)漆酶菌株。該菌株經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后,漆酶活性達9 522.22 U/g,具有較大應(yīng)用價值。