青蒿素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

侯 昆 李 欣* 沈義媛 詹經(jīng)緯 牛 慧 熊本海 童津津** 蔣林樹**

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

乳汁分泌是乳腺組織的分泌細(xì)胞以血液中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為原料，在細(xì)胞中生成乳汁后分泌到腺泡腔中的過(guò)程[1]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)執(zhí)行泌乳功能，其分泌活性對(duì)牛乳生產(chǎn)至關(guān)重要[2]。牛乳中基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量受多種因素的影響而發(fā)生變化，其中變化最大的成分就是乳脂[3]。據(jù)報(bào)道，乳脂主要由甘油三酯(TG)、甘油二酯、游離氨基酸、酸磷脂和膽固醇等組成，其含量是鑒定乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]。乳脂在牛乳中的含量為3%～5%，但我國(guó)的乳脂率水平一直不高，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，乳品質(zhì)低下已成為制約我國(guó)奶業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，故探索提高乳品質(zhì)的手段和方法迫在眉睫。飼料的有效利用可以提高奶牛的泌乳性能，其中植物提取物飼糧添加劑因其具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化等特性，在動(dòng)物無(wú)抗飼料中替代抗生素和改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。青蒿是一年生草本植物，其提取物內(nèi)含有倍半萜內(nèi)酯化合物且具有抗氧化、抗炎和提高免疫力等多種生物學(xué)功能[5]。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)患有隱性乳房炎的奶牛飼喂青蒿提取物(60 g/d)后，血清中的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量顯著降低，而超氧化物歧化酶(SOD)活性具有上升的趨勢(shì)，證明青蒿素可改善奶牛的產(chǎn)奶性能，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力與免疫功能，同時(shí)顯著降低乳汁中體細(xì)胞數(shù)(SCC)[6-7]。Hunt等[8]研究發(fā)現(xiàn)，嗜中性粒細(xì)胞在被細(xì)菌脂多糖(LPS)激活的情況下，添加青蒿提取物(100～200 μg/mL)可顯著抑制活化的嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，改善機(jī)體炎癥反應(yīng)。此外，青蒿提取物可通過(guò)阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少炎癥介質(zhì)的合成和釋放，從而降低體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]。由于青蒿提取物中含有的大量酚類和黃酮類化合物，可以誘導(dǎo)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的轉(zhuǎn)錄來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量，使得細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)更加穩(wěn)定，進(jìn)而預(yù)防或中和自由基的破壞作用[10-11]。因此，青蒿素作為一種綠色安全抗生素替代物，在提高奶牛生產(chǎn)性能和免疫功能方面，具有重要的意義。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為一種調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的重要分子，也是調(diào)控脂類代謝的核心物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，機(jī)體中AMPK作為一種糖脂代謝的關(guān)鍵酶參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，AMPK激活抑制機(jī)體內(nèi)脂肪酸及膽固醇的合成及代謝，調(diào)控脂肪組織的生成[12-13]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)作為核轉(zhuǎn)錄家族的一員，其中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-c(SREBP1-c)主要參與機(jī)體脂類合成相關(guān)酶的激活，可通過(guò)靶向基因乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)和脂肪酸合成酶(FASN)等脂肪酸催化酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)乳脂的合成[14]；目前已證明，SREBP1-c為調(diào)節(jié)BMECs乳脂合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)提高脂肪酸的合成[15]。然而，青蒿提取物對(duì)BMECs乳脂的合成是否有影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)基于磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)和AMPK-mTOR乳脂合成關(guān)鍵信號(hào)通路，研究青蒿素對(duì)奶牛乳脂合成影響，為青蒿素作為奶牛功能性添加劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試驗(yàn)主要試劑：青蒿素(CAS：63968-64-9，貨號(hào)：361593，純度99%)購(gòu)于Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自Gibco公司；OMEGA Total RNA Kit Ⅰ試劑盒、cDNA合成試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞裂解液(P0013)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(P1046)、蛋白上樣緩沖液(P0015)、電泳液(P0014B)、Western轉(zhuǎn)膜液(P0021B)、凝膠配制試劑盒(P0012A)、洗滌液(P0023C6)、QuickBlockTMWestern封閉液(P0252-500 mL)、考馬斯亮藍(lán)快速染液(P0017)、麗春紅染色液(P0022)、轉(zhuǎn)印濾紙(FFP51)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(FFP32)、熒光檢測(cè)試劑(P0018S)、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)10～180 ku(P0069)均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；AMPK(一抗)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)(一抗)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)(一抗)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)(一抗)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)(一抗)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(一抗)均購(gòu)于CST公司；mTOR(一抗)購(gòu)于Proteintech公司；SREBP1-c(一抗)、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)與山羊抗鼠IgG均購(gòu)于Santa公司；PI3K(一抗)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)(一抗)均購(gòu)于北京博奧森公司；細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(一抗)購(gòu)于Abcam公司。

試驗(yàn)主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(lightcycler 96，瑞士)，DeNovix核酸蛋白定量?jī)x(DS-11，美國(guó))，電泳儀(BIO-RAD，美國(guó))，Mini Trans-Blot Cell(BIO-RAD，美國(guó))，Mini PROTEAN Tetra Cell電泳槽(BIO-RAD，美國(guó))，水平脫色搖床(CX-S800，上海舍巖)，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon-4600，北京原平皓)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑配制

BMECs來(lái)自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的惠贈(zèng)。在37 ℃水浴鍋內(nèi)將凍存的細(xì)胞解凍，完全融化后用酒精擦拭凍存管轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中，使用1 mL移液器將細(xì)胞取出放入預(yù)熱的培養(yǎng)液中并混勻細(xì)胞，離心除去上清液。加入12 mL培養(yǎng)液后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到90%用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化和傳代，本次試驗(yàn)采用3～5代細(xì)胞。

青蒿素依據(jù)試劑說(shuō)明書進(jìn)行配制，經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)將其濃度分別配制為10、20、40、60、80、100 μmol/L，用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 BMECs增殖測(cè)定

將細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，分別加入150 μL含有10、20、40、60、80、100 μmol/L的青蒿素培養(yǎng)基，與細(xì)胞共培養(yǎng)1、3、6、9、12、24 h，每孔及每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)立6個(gè)重復(fù)和6個(gè)空白對(duì)照。共培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入噻唑藍(lán)(MTT)溶液10 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后每孔加入100 μL Formazan溶解液，混勻，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3～4 h后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下每個(gè)培養(yǎng)孔的吸光度(OD)值。

1.3.2 BMECs內(nèi)乳脂合成產(chǎn)物的檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi)脂滴含量利用油紅O脂肪染色法進(jìn)行檢測(cè)。將BMECs接種于6孔板中培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后洗滌細(xì)胞，每孔加入150 μL含有10、20、40、60、80、100 μmol/L的青蒿素培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，每孔及時(shí)間點(diǎn)設(shè)立6個(gè)重復(fù)和6個(gè)空白對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，D’Hanks緩沖液洗滌細(xì)胞，使用2 mL 4%多聚甲醛固定30～40 min后棄溶液，用D’Hanks緩沖液洗滌2次，加油紅O工作液1 mL，1 h后舍棄油紅O染液進(jìn)行細(xì)胞洗滌，在顯微鏡下觀察染色情況。

細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測(cè)依照試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入TG試劑盒中的裂解液0.1 mL處理10 min，收集細(xì)胞用于蛋白含量測(cè)定。將樣品水浴加熱70 ℃ 10 min，室溫下離心獲取上清液；配制TG的工作液(24 h內(nèi)有效)；將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為500.0～62.2 μmol/L；將10 μL樣品加入96孔板中，用工作液補(bǔ)足至200 μL，用10 μL蒸餾水調(diào)零，在37 ℃ 反應(yīng)15 min測(cè)定各孔OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品TG含量。

1.3.3 青蒿素對(duì)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

試驗(yàn)分為對(duì)照組(不加青蒿素)和試驗(yàn)組(加入20、40、60 μmol/L的青蒿素培養(yǎng))，加藥后每組細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)12 h，每組3個(gè)重復(fù)。BMECs內(nèi)總RNA按照Trizol法提取，用Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度與濃度，OD260/OD280的值在1.8～2.0可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，檢測(cè)乳脂合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定基因主要包括AMPK、mTOR、PPARγ、SREBP1-c、ACC、SCD1、FASN、PI3K、AKT1和CyclinD1，其引物序列見(jiàn)表1。試驗(yàn)重復(fù)3次，各基因相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算得出。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

續(xù)表1基因GenesGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionnumber引物序列Primersequences(5′—3′)脂肪酸合成酶FASNNM_001012699.1F:AGCACACGCCTGTAGTATTCGR:CAGCTTCTGCTGGTGGGTAG磷脂酰肌醇3-激酶PI3KNM_174574.1F:CACTGTGGTTGAATTGGGAGAR:CGATTGACAGACAACCATAAGG絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1AKT1NM_173986.2F:TAAAGAAGGAGGTCATCGTGGR:CGGGACAGGTGGAAGAAAA細(xì)胞周期蛋白D1CyclinD1NM_001046273.2F:GGACCGCTTCCTGTCGCTR:GCCAGGTTCCACTTGAGTTTGT

1.3.4 青蒿素對(duì)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western-blot檢測(cè)乳脂合成相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化。使用PBS清洗細(xì)胞樣本，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中添加細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞后，將懸液移至新的做好標(biāo)記的1.5 mL離心管中放在冰上進(jìn)行充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，將樣品的上清液移入離心管中。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量，并調(diào)整蛋白含量一致。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，樣品在濃縮膠中為恒壓40 V通過(guò)濃縮膠后，改為恒壓100 V，80 min；采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色劑染色，觀察轉(zhuǎn)膜情況，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)染含有目的蛋白的分離膠，觀察蛋白殘留情況；隨后，對(duì)膜進(jìn)行封閉、一抗孵育和二抗孵育，使用BeyoECL Plus熒光檢測(cè)工作液顯色，隨后利用Tanon-4600圖像分析系統(tǒng)的軟件讀取條帶的凈光密度值。所有的目的蛋白的表達(dá)量均與β-actin的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 添加不同濃度青蒿素作用不同時(shí)間對(duì)BMECs活性的影響

利用MTT法檢測(cè)不同濃度的青蒿素作用不同時(shí)間對(duì)BMECs活性的影響，結(jié)果如圖1所示。不同濃度的青蒿素作用BMECs 1～6 h后，相對(duì)細(xì)胞活性與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)；然而處理9 h后，添加10～80 μmol/L的青蒿素顯著提高了相對(duì)細(xì)胞活性(P<0.05)；處理12 h后，添加20、40、60 μmol/L的青蒿素極顯著提高了相對(duì)細(xì)胞活性(P<0.01)，80 μmol/L顯著提高了相對(duì)細(xì)胞活性(P<0.05)；處理24 h后，20～60 μmol/L極顯著提高了相對(duì)細(xì)胞活性(P<0.01)，80 μmol/L顯著提高了相對(duì)細(xì)胞活性(P<0.05)。綜上所述，青蒿素對(duì)BMECs作用的適宜濃度為0～80 μmol/L，青蒿素作用12 h發(fā)生顯著變化，且與24 h對(duì)細(xì)胞相對(duì)活性作用效果相同；故選擇0～80 μmol/L青蒿素處理細(xì)胞12 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 添加不同濃度青蒿素對(duì)BMECs乳脂合成的影響

采用油紅O染色法，觀察用不同濃度青蒿素處理BMECs 12 h后細(xì)胞內(nèi)脂滴的含量。結(jié)果如圖2-A所示，與對(duì)照組相比，在添加20、40、60 μmol/L濃度的青蒿素處理12 h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增加，而添加80 μmol/L青蒿素后細(xì)胞內(nèi)脂滴的含量明顯減少。

如圖2-D所示，依據(jù)每mg蛋白含量校正TG含量，進(jìn)一步驗(yàn)證了油紅O染色的結(jié)果；與對(duì)照組相比，添加不同濃度青蒿素處理BMECs 12 h后，40 μmol/L的青蒿素極顯著提高了細(xì)胞內(nèi)TG的含量(P<0.01)，20、60 μmol/L的青蒿素顯著提高了細(xì)胞中TG的含量(P<0.05)，而80 μmol/L的青蒿素顯著降低了細(xì)胞內(nèi)TG的含量(P<0.05)。因此，選擇青蒿素濃度為20、40和60 μmol/L進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

與對(duì)照組比較，“*”為差異顯著(P<0.05 )；“**”為差異極顯著(P<0.01)。下圖同。Compared with the CON group,“*”mean significant difference (P<0.05);and “**”mean significant difference (P<0.01).The same as below.圖1 不同濃度的青蒿素作用不同時(shí)間對(duì)BMECs細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of artemisinin at different time on cell viability of BMECs

A:油紅O染色圖，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量(400×)；B:甘油三酯含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定；C:細(xì)胞內(nèi)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定；D:細(xì)胞中甘油三酯含量測(cè)定。A:oil red O staining image to detect the content of lipid droplets in cells (400×);B:standard curve determination of triglyceride content;C:standard curve for determination of protein content in cells;D:determination of triglyceride content in cells.圖2 青蒿素對(duì)BMECs合成TG的影響Fig.2 Effects of artemisinin on TG synthesis in BMECs

2.3 青蒿素對(duì)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

如圖3所示，不同濃度青蒿素處理BMECs 12 h后，與對(duì)照組相比，添加40 μmol/L的青蒿素顯著提高PI3K基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，而20與60 μmol/L青蒿素的PI3K基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3-A)；青蒿素添加組AKT1的基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3-B)；40 μmol/L的青蒿素組中CyclinD1的基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3-C)。

PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；AKT1：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 serine/threonine protein kinase 1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1。圖3 青蒿素對(duì)BMECs中PI3K、AKT1和Cyclin D1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of artemisinin on relative expression levels of PI3K,AKT1 and Cyclin D1 genes in BMECs

由圖4可知，40和60 μmol/L的青蒿素組能量代謝調(diào)控因子AMPK的基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，添加青蒿素可極顯著提高mTOR基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。

AMPK：磷酸腺苷活化蛋白激酶 AMP-activated protein kinase；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin。圖4 青蒿素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞AMPK和mTOR基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of artemisinin on relative expression levels of AMPK and mTOR genes in BMECs

由圖5可知，添加不同濃度的青蒿素組PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；添加青蒿素可顯著提高SREBP1-c基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，40 μmol/L的青蒿素極顯著提高SREBP1-c基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)；此外，與對(duì)照組相比，添加青蒿素后，F(xiàn)ASN、ACC和SCD1基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

PPAR γ：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptors γ；SREBP1-c：膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-c sterol regulatory element-binding proteins 1-c；FASN：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；ACC：乙酰輔酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase；SCD1：硬脂酰輔酶A去飽和酶1 stearoyl-CoA desaturase 1。圖5 青蒿素對(duì)BMECs中PPAR γ,SREBP1-c,FASN,ACC和SCD1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of artemisinin on relative expression levels of PPAR γ,SREBP1-c,FASN,ACC and SCD1 genes in BMECs

2.4 青蒿素對(duì)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6-A所示，與對(duì)照組相比，20與40 μmol/L青蒿素極顯著提高PI3K蛋白的表達(dá)(P<0.01)，而不同濃度的青蒿素均可顯著提高p-PI3K的蛋白表達(dá)(P<0.05)，青蒿素可能激活磷酸化的PI3K從而發(fā)揮作用。然而，青蒿素對(duì)AKT1與p-AKT1蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(P>0.05)(圖6-B)，青蒿素可能沒(méi)有激活PI3K-AKT這條信號(hào)通路調(diào)控乳脂的合成。

PI3K/p-PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶/磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase/p-phosphatidylinositol 3-kinase；AKT1/p-AKT1：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1/磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 serine/threonine protein kinase 1/p-serine/threonine protein kinase 1;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。圖6 青蒿素對(duì)BMECs中PI3K/p-PI3K and AKT1/p-AKT1蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of artemisinin on expression levels of PI3K/p-PI3K and AKT1/p-AKT1 proteins in BMECs

如圖7所示，與對(duì)照組相比，添加20和40 μmol/L青蒿素均可顯著提高AMPK蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，而60 μmol/L青蒿素對(duì)AMPK蛋白的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。如圖8所示，40 μmol/L青蒿素組中mTOR蛋白的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，20 μmol/L青蒿素顯著提高了mTOR蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，然而60 μmol/L青蒿素對(duì)其蛋白的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；但是添加青蒿素極顯著提高了p-mTOR蛋白的表達(dá)量(P<0.01)。如圖9所示，與對(duì)照組相比，添加20、40 μmol/L青蒿素顯著提高了乳脂合成關(guān)鍵蛋白PPARγ與SREBP1-c的表達(dá)量(P<0.05)，其中60 μmol/L青蒿素只顯著提高了PPARγ蛋白的表達(dá)量(P<0.05)；然而，添加青蒿素后，Cyclin D1蛋白表達(dá)量并沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

AMPK：磷酸腺苷活化蛋白激酶 AMP-activated protein kinase；β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。圖7 青蒿素對(duì)BMECs中AMPK蛋白表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of artemisinin on expression levels of AMPK proteins in BMECs

mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin；p-mTOR：磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 phosphorylated mammalian target of rapamycin;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。圖8 青蒿素對(duì)BMECs中mTOR/p-mTOR蛋白表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of artemisinin on expression levels of mTOR/p-mTOR proteins in BMECs

PPAR γ：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptors γ；SREBP1-c：膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-c sterol regulatory element-binding proteins 1-c；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。圖9 青蒿素對(duì)BMECs中Cyclin D1,PPARγ和SREBP1-c蛋白表達(dá)量的影響Fig.9 Effects of artemisinin on expression levels of Cyclin D1,PPARγ and SREBP1-c proteins in BMECs

3 討 論

3.1 添加青蒿素對(duì)BMECs增殖與乳脂合成的影響

奶牛的泌乳功能與乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目以及每個(gè)細(xì)胞分泌與合成乳汁的能力密切相關(guān)[16]。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物可以作用于小鼠T淋巴細(xì)胞絲裂原ConA，使其脾臟淋巴細(xì)胞增殖，增加機(jī)體的免疫能力。與本研究結(jié)果一致，不同濃度的青蒿素對(duì)BMECs的增殖及活性均具有顯著的影響，由此證明青蒿素促進(jìn)乳腺的泌乳功能。乳汁中TG的含量在一定程度上決定了奶牛的乳脂率[18-19]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞利用3-磷酸甘油氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，在相應(yīng)酶的作用下氧化為有色的產(chǎn)物，進(jìn)而通過(guò)顏色吸光度反映出的TG含量，更直觀地表達(dá)了細(xì)胞內(nèi)TG含量的變化情況。本研究中油紅O染色結(jié)果，從形態(tài)學(xué)上解釋了20～60 μmol/L青蒿素對(duì)BMECs中脂滴的合成具有顯著的促進(jìn)作用。因此，青蒿素對(duì)BMECs具有促增殖、提高乳脂合成的影響，但其具體的調(diào)控乳脂合成的機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

3.2 青蒿素對(duì)BMECs內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

PI3K-AKT-mTOR-Cyclin D1信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)BMECs增殖與生長(zhǎng)[20-21]，此外不僅調(diào)控乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)SREBP1-c等關(guān)鍵信號(hào)傳感器的活化，從而促進(jìn)脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，提高乳脂合成信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。據(jù)報(bào)道，PPARγ和SREBP1-c是mTOR信號(hào)通路中調(diào)節(jié)脂肪合成的主要調(diào)節(jié)劑[23]。當(dāng)mTOR的激活被抑制時(shí)，其下游SREBP1-c表達(dá)被抑制，顯著影響脂肪酸合成酶的活性并降低脂肪酸的從頭合成[24]。而且，研究證實(shí)SREBP1-c是控制牛乳脂合成轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐，乳脂抑制的部分原因是反式-10，順式-12共軛亞油酸可通過(guò)抑制SREBP1-c的活性和表達(dá)來(lái)減少乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制了乳脂合成[25]。此外，PPARγ屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，它能促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化，促進(jìn)脂肪組織中脂蛋白脂肪酶基因的表達(dá)并降低脂肪分解速度；在乳成分合成過(guò)程中，PPARγ能增加乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)TG的含量，在合成乳脂過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加青蒿素可顯著提高BMECs中乳脂轉(zhuǎn)錄因子SRBEP1-c和PPARγ的表達(dá)，說(shuō)明青蒿素的添加能增加脂肪酸的從頭合成，進(jìn)而促進(jìn)乳脂的合成。

PPARγ可作為脂肪細(xì)胞成熟標(biāo)志基因，其含量顯著影響脂肪細(xì)胞的產(chǎn)生[26]；當(dāng)其表達(dá)被抑制時(shí)，顯著降低ACC與FASN的基因表達(dá)水平，并降低脂肪酸與其互作，減少乳脂的生成[4,27]。ACC和FASN是乳脂從頭合成中2個(gè)重要的基因。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)ASN和ACC主要在BMECs內(nèi)作用于乳脂合成的前體物乙酸和β-羥丁酸，F(xiàn)ASN會(huì)調(diào)控37%的脂肪酸從頭合成[28]，乳中約1/2的C16∶0和幾乎全部的C4∶0～C14∶0依賴于乳腺的從頭合成，且FASN會(huì)參與其碳鏈延長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程[29]。在脂肪酸合成過(guò)程中，ACC參與脂肪酸從頭合成的限速，調(diào)控奶牛乳脂的合成速度，其還與合成脂肪酸的轉(zhuǎn)錄因子SREBP1-c在PPARγ的作用下，影響長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝，最終影響乳脂的合成[30-31]。Bionaz等[32]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛泌乳與乳脂合成時(shí)，ACC、PPARγ、FAS、SCD和SREBP1-c等基因表達(dá)都明顯上調(diào)。本研究結(jié)果表明，添加適宜濃度的青蒿素顯著上調(diào)了SREBP1-c與PPARγ蛋白的表達(dá)，而且PPARγ可能參與調(diào)控SREBP1-c基因的表達(dá)，通過(guò)影響脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、從頭合成和酯化過(guò)程從而調(diào)控基因的表達(dá)。

AMPK作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的能量調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)感受細(xì)胞能量狀態(tài)的方式來(lái)維持能量平衡，從而為乳蛋白合成提供充足的能量。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素對(duì)參與調(diào)控機(jī)體乳脂代謝的AMPK-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵基因FASN、ACC、PPARγ和SCD等均有顯著的促進(jìn)作用，這可能與青蒿素以調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的方式上調(diào)AMPK，進(jìn)一步激活mTOR的磷酸化有關(guān)。據(jù)報(bào)道，SCD參與催化不飽和脂肪酸的形成，并在一定程度上參與調(diào)控其他脂肪酸代謝基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)TG的合成[33]。研究發(fā)現(xiàn)，乳脂合成主要以mTOR為主，當(dāng)其被激活，可以促進(jìn)脂肪合成，同時(shí)抑制脂肪分解及氧化，使得TG含量上升，最終提高乳脂含量[34]。據(jù)報(bào)道，泌乳小鼠注射mTOR抑制劑3 h后，乳汁中FASN與ACC 2種酶的活性及含量顯著降低，當(dāng)這2種酶活性下降時(shí)抑制了細(xì)胞中乳脂的合成[35]。由此可見(jiàn)，青蒿素可通過(guò)調(diào)控AMPK-mTOR信號(hào)通路中乳脂肪合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)提高BMECs中乳脂的合成。

4 結(jié) 論

青蒿素可通過(guò)AMPK-mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳脂合成關(guān)鍵調(diào)控因子FASN、ACC、PPARγ和SREBP1-c基因和蛋白的表達(dá)。當(dāng)青蒿素濃度為20～60 μmol/L時(shí)，對(duì)BMECs內(nèi)脂肪酸從頭合成及長(zhǎng)鏈脂肪酸攝取的促進(jìn)效果較好。