辣椒堿對泌乳前期奶牛產奶性能、血清生化指標、瘤胃微生物及代謝組的影響

朱 靖 林 紅 裴明財 韓兆玉

(南京農業(yè)大學動物科技學院乳?？茖W研究所，南京 210095)

奶牛分娩后因泌乳需要，對營養(yǎng)需求較高,但此時干物質采食量較低，無法滿足泌乳需求，往往導致奶牛機體發(fā)生能量負平衡[1]。干物質采食量是維持泌乳前期高產基礎，能量供給不足導致奶牛不能達到理想的產奶高峰，高峰期縮短，致使整個泌乳期產奶量大幅度降低[2]。此外，為了滿足產奶的能量需要，奶牛必須分解自身貯存的脂肪，產生大量酮體，易發(fā)生酮病，影響產奶量、乳成分及奶牛健康[3]。為了解決能量負平衡這一難題，許多研究者提議提高奶牛飼糧中精料比例，從而滿足奶牛的營養(yǎng)需要。但精料比例過高會導致瘤胃pH降低，瘤胃長期處于高酸環(huán)境中，導致奶牛易患蹄葉炎、脂肪肝等疾病[4]，且高精料飼糧會導致奶牛采食量下降，并不一定能夠促進奶牛能量攝入。因此，在適度提高泌乳前期奶牛飼糧精料比例基礎上，還需尋找提高奶牛干物質采食量的方法。瘤胃中的微生物能夠降解營養(yǎng)物質，產生揮發(fā)性脂肪酸，并合成微生物蛋白質，分別是反芻動物的能量和蛋白質主要供應來源[5]。然而，由于甲烷損失和氨態(tài)氮流失，這種發(fā)酵過程的能量和蛋白質產生效率是比較低的，可能會限制生產性能，并導致污染物釋放到環(huán)境中?？股仉x子載體在減少瘤胃中的能量和蛋白質損失方面非常成功，但是抗生素在動物飼糧中的使用正面臨著社會質疑，世界各國逐漸禁止抗生素作為添加劑飼喂動物[6-8]。為此，科學家們不斷探索其他控制特定微生物種群以調節(jié)瘤胃發(fā)酵的替代方法。有研究結果表明，辣椒堿可以增加丙酸鹽的產生，減少乙酸鹽或甲烷的產生，并改變瘤胃中的蛋白質水解、肽解或脫氨作用[9]。因此，本試驗選擇辣椒堿添加到泌乳前期奶牛飼糧中，探究其對奶牛產奶性能、血清生化指標、瘤胃微生物及代謝組學的影響，期望能夠為辣椒堿在泌乳前期奶牛生產上的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用微囊包被的天然辣椒堿作為試驗材料，由廣州某生物科技股份有限公司提供，有效成分含量為2%，其余成分為石粉、沸石粉等載體。

1.2 試驗設計

試驗選取(2.9±0.9)歲、胎次(1.9±0.9)胎和產奶量(35.57±2.57)kg的40頭泌乳前期奶牛，隨機分為對照組和試驗組，每組分為5個重復，每個重復4頭牛。試驗地為某乳液公司奶牛場，試驗時間在2020年10—11月份。對照組飼喂原奶牛場飼糧，試驗組在原奶牛場飼糧基礎上每頭添加1.2 g/d辣椒堿(生產方建議添加量)，用少量玉米粉混合后均勻地分成3份，分別于每日04:00、12:30、19:00均勻地撒在奶牛飼糧上。保證自由飲水，定期對牛舍消毒，打掃衛(wèi)生。預試期7 d，正試期2個月。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 干物質采食量、產奶量及乳成分的測定

試驗期間，采用全自動配料機配料，每天記錄總投料量，每天早上分別清理2組試驗牛剩料并稱重記錄，測定干物質含量，計算試驗牛干物質采食量。試驗第1、15、30、45、60天時，分別記錄產奶量并采集奶樣，測定乳成分，用裝有防腐劑的50 mL離心管，按奶樣早∶中∶晚=4∶3∶3收集并混合均勻，冰袋保存迅速帶回南京農業(yè)大學乳品檢測中心，使用全自動乳成分分析儀(MilkoScan-FT120)進行檢測，測定指標有乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固形物含量、體細胞數(shù)和尿素氮含量。4%標準乳(FCM)含量計算公式如下：

4%標準乳=M×(0.4+0.15F)。

式中：M為產奶量；F為乳脂率。

1.4 血清生化指標的測定

在試驗第1、60天時，分別尾靜脈采血10 mL，分離血清，-80 ℃保存待測。測定血清生化指標包括：葡萄糖(glucose,GLU)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，以上指標由酶標儀(RT-6000)測得，試劑盒來源為南京建成生物工程研究所；血清皮質醇(cortisol,COR)、多巴胺(dopamine,DA)含量及磷酸肌酸激酶(phosphocreatine kinase,CPK)活性由江蘇酶免實業(yè)有限公司檢測，測定儀器為全自動放免儀(Sn-69513)，使用試劑盒為放射免疫試劑盒，由江蘇酶免實業(yè)有限公司生產。

1.5 試驗牛瘤胃液的采集與測定

在試驗第60天，每個重復中隨機挑選1頭試驗牛以備采集瘤胃液，每組5頭，共計10頭。采樣前，提前3～4 h讓試驗牛禁食以便采集瘤胃液，采樣方法為瘤胃口腔導管法。先用牛頸夾將試驗牛固定，再用牛鼻鉗夾住牛鼻中隔拉向正前方使牛頭和頸部伸直；然后將特制的、清洗干凈的瘤胃口腔導管沿牛舌方向緩慢插入，經(jīng)食管抵達瘤胃腹囊內；用250 mL的大號采集器抽氣直到瘤胃液流出，待瘤胃液均勻度一致后即可采樣。采樣完畢，將導管體外端密封后再將采樣管緩慢抽出，將瘤胃口腔導管用清水徹底清洗后方可用于下一頭試驗牛瘤胃液樣品的采集。注意保證每頭奶牛瘤胃液采集部位相同，避免由于瘤胃不同位置的微生物差異對試驗結果造成影響，同時為了減少人為誤差，所有試驗牛瘤胃液的采集均由同一名技術嫻熟的獸醫(yī)專門負責。每頭試驗牛采集200 mL瘤胃液，4層紗布過濾后，測定pH，留存100 mL分裝到每個測定指標的離心管中待后續(xù)測定揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮、微生物蛋白含量，其中測定細菌的瘤胃液分裝在5 mL的凍存管，投入液氮罐中速凍，并送往南京奧青生物有限公司測定微生物區(qū)系及代謝組。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)由Excel 2016初步處理后用SPSS 20.0的一般線性模型(GLM)進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，然后各組間進行最小顯著差數(shù)法(LSD)多重比較，所有數(shù)據(jù)結果用平均值±標準誤表示。P<0.05為差異顯著，生長性能及血清生化指標含40個樣本，瘤胃發(fā)酵參數(shù)、微生物區(qū)系及代謝組含10個樣本。

2 結果與分析

2.1 辣椒堿對泌乳前期奶牛干物質采食量、產奶量及乳成分的影響

由表2可知，與對照組相比，在試驗第15、30、45、60天，試驗組產奶量顯著上升(P<0.05)，但4%標準乳含量僅在試驗第60天后有顯著升高(P<0.05)，其他時間均無顯著性差異(P>0.05)。在試驗第30、45天時，對照組乳脂率顯著高于試驗組(P<0.05)，在同一時間，干物質采食量、乳糖率、乳蛋白率及總固形物、乳尿素氮含量無顯著變化(P>0.05)。與對照組相比，在試驗第1、30、45天，試驗組乳體細胞數(shù)顯著提高(P<0.05)，而試驗第60天，試驗組乳體細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表2 辣椒堿對泌乳前期奶牛干物質采食量、產奶量及乳成分的影響Table 2 Effects of capsaicin on DM intake,milk yield and milk composition of early lactation dairy cows

2.2 辣椒堿對泌乳前期奶牛血清生化指標的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加辣椒堿對奶牛血清谷胱甘肽抗氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均無顯著影響(P>0.05);在試驗第60天，辣椒堿組血清中丙二醛含量顯著升高(P<0.05)。辣椒堿組血清β-羥丁酸、多巴胺含量顯著高于對照組(P<0.05)；辣椒堿組血清膽囊收縮素含量顯著低于對照組(P<0.05)；對胰島素含量無顯著性影響(P>0.05)。添加辣椒堿對泌乳奶牛血清中總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖含量均無顯著影響(P>0.05)。

表3 辣椒堿對泌乳前期奶牛血清生化指標的影響Table 3 Effects of capsaicin on serum biochemical indexes of early lactation dairy cows

2.3 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼喂辣椒堿后，奶牛瘤胃中各類揮發(fā)性脂肪酸含量均無顯著改變(P>0.05)。

表4 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of capsaicin on rumen fermentation parameters of early lactation dairy cows

2.4 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

表5所示為不同組間細菌優(yōu)勢門相對豐度(相對豐度大于0.5%)，按照相對豐度從高到低依次排列。其中試驗組擬桿菌門、螺旋體菌門、纖維桿菌門、髕桿菌門相對豐度高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，試驗組厚壁菌門相對豐度顯著升高(P<0.05)。此外，與對照組相比，試驗組變形菌門與藍藻菌門相對豐度降低，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃優(yōu)勢菌門相對豐度的影響Table 5 Effects of capsaicin on relative abundance of rumen dominant bacterial phylum of early lactation dairy cows

表6所示為不同組間細菌優(yōu)勢屬相度豐度(相對豐度大于0.5%)，按照相對豐度從高到低依次排列。與對照組相比，試驗組琥珀酸弧菌UCG-001相對豐度顯著下降(P<0.05)，瘤胃球菌科UCG-014屬與瘤胃球菌科RC9腸道群相對豐度顯著升高(P<0.05)，2組之間其他優(yōu)勢菌屬相對豐度無顯著性差異(P>0.05)。

表6 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃優(yōu)勢菌屬相對豐度的影響Table 6 Effects of capsaicin on relative abundance of rumen dominant bacterial genus of early lactation dairy cows %

2.5 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃代謝組的影響

采用PLS-DA模型的VIP(variable importance in the projection)值(閾值≥1)，并結合獨立樣本t檢驗(P<0.05)來尋找差異性表達代謝物。檢測共計發(fā)現(xiàn)45個差異代謝物，利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫，對差異代謝物進行代謝通路注釋，找到與這些差異代謝物相關的代謝通路共計102條。首先通過差異代謝物對KEGG、PubChem等權威代謝物數(shù)據(jù)庫進行映射，然后對對應物種的通路數(shù)據(jù)庫進行搜索和代謝通路分析，其中富集分析P值低于0.05的包含4條通路，分別是萬古霉素類抗生素的生物合成、雙酚降解、維生素B6的新陳代謝及果糖和甘露糖代謝，4條通路對應的差異代謝物如下表7所示。

表7 4條主要代謝通路對應的差異代謝物Table 7 Different metabolites corresponding to four major metabolic pathways

3 討 論

3.1 辣椒堿對泌乳前期奶牛產奶性能的影響

研究顯示辣椒堿能夠增加熱應激下奶牛干物質和水的攝入量[10]，在大鼠試驗中也發(fā)現(xiàn)了相同的結果[11]。但在本次試驗中，泌乳前期奶牛飼糧中添加辣椒堿不能顯著提高干物質采食量，這一結果與我們之前的試驗結果[12]不一致，其可能原因是2組試驗牛所處的泌乳階段和外界環(huán)境不一樣。有報道稱辣椒堿能夠增加單胃動物消化酶的合成，從而提高飼糧消化率[13]。在奶牛試驗中，研究發(fā)現(xiàn)辣椒堿通過降低奶牛氨和甲烷的營養(yǎng)損失，使得食物蛋白質穿過瘤胃直接傳送到十二指腸使得氮利用率提高，從而提高奶牛泌乳效率，有助于增加奶牛的產奶量[14]。這些研究佐證了辣椒堿對奶牛干物質采食量無顯著影響，卻顯著提高了產奶量是因為辣椒堿添加提高了奶牛能量利用率。此外，本試驗結果顯示奶樣中乳蛋白率、乳糖率與乳尿素氮含量等不受辣椒堿的影響，這與其他報道的結果一致，膳食蛋白質向牛奶的轉移效率相對較低，即使辣椒堿能夠增加食物蛋白質的過瘤胃率，也不會顯著改變牛奶蛋白質含量[15]。

3.2 辣椒堿對泌乳前期奶牛血清生化指標的影響

本試驗中，飼糧添加辣椒堿對奶牛血清谷胱甘肽抗氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均無顯著影響，但試驗組血清丙二醛含量反而顯著升高，其可能原因是試驗牛高產奶負荷威脅機體健康，產生更多的自由基，積累丙二醛[16]。奶牛分娩后，胰島素水平較低，機體干物質采食量無法滿足泌乳的能量需求，于是脂肪組織被動員提供能量，大量游離脂肪酸在線粒體中經(jīng)過酶促反應可以轉化為β-羥基丁酸酯，再通過單羧酸轉運蛋白轉運出線粒體，進入血液循環(huán)[17]。因此，血清中β-羥丁酸含量能夠反映機體脂肪動員水平和機體代謝狀態(tài)。在本試驗中，飼喂辣椒堿后泌乳前期奶牛血清中β-羥丁酸含量顯著升高。有研究顯示辣椒堿可能并非直接刺激奶牛機體動員脂肪，而是通過增強乳桿菌代謝活性，加大乳酸桿菌的能量需求間接導致[13]。此外，本研究中試驗組奶牛血清多巴胺含量顯著高于對照組，膽囊收縮素含量顯著降低。在動物試驗中，研究發(fā)現(xiàn)多巴胺含量與動物采食水平相關[18]，而膽囊收縮素主要作用為刺激胰酶分泌與合成，增強胰碳酸氫鹽分泌，刺激膽囊收縮，還可作為飽感因素調節(jié)攝食[19]。

3.3 辣椒堿對泌乳前期奶牛瘤胃微生物的影響

反芻動物瘤胃微生物通過分泌不同種類的酶參與飼糧木質纖維性物質的分解，對于調節(jié)宿主生理功能和改善胃腸道健康起著至關重要的作用[20]，因此，本研究探索了瘤胃中相對豐度大于0.5%的優(yōu)勢菌群。研究結果顯示，辣椒堿的加入對瘤胃厚壁菌門和擬桿菌門有正向影響，其中厚壁菌門相對豐度的增加更顯著。在奶牛瘤胃中，擬桿菌門中數(shù)量最多的是普雷沃氏菌屬，它在多種生物代謝途徑中發(fā)揮作用，能夠將植物蛋白質、多糖、半纖維素和果膠分解轉化為乙酸、琥珀酸和丙酸等奶牛機體能夠直接利用的能量物質[20]。厚壁菌門細菌細胞壁含肽聚糖量高，細胞壁厚，革蘭氏染色反應呈陽性，屬于化能營養(yǎng)型[21]。其主要生理功能是降解結構性多糖，同時抑制甲烷的產生[22]。這些報道證明了辣椒堿是通過影響瘤胃優(yōu)勢菌群相對豐度，從而提高機體能量利用率。Sun等[23]研究紫蘇葉對泌乳奶牛瘤胃微生物群落的影響，結果同樣發(fā)現(xiàn)辣椒堿能夠提高瘤胃厚壁菌門相對豐度，這些試驗表明植物提取物中這些酚類化合物對瘤胃微生物可能具有相似的生物學功能。此外，在本試驗中，對照組瘤胃中琥珀酸弧菌相對豐度較高，瘤胃琥珀酸弧菌能夠發(fā)酵多種糖，主要的代謝終產物是乙酸和琥珀酸[24]。也有研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸弧菌和普雷沃氏菌與牛奶合成和瘤胃發(fā)酵特性相關[25]。

3.4 辣椒堿對泌乳前期奶牛代謝組的影響

萬古霉素類抗生素是一種糖肽類天然抗生素，線性多態(tài)結構，主要生物學功能是通過干擾細菌細胞壁的合成而抑制細菌生長，是黃色葡萄球菌的主要抗菌劑，放線菌屬或鏈霉菌屬是參與萬古霉素類抗生素生物合成的主要微生物[26]。其代謝途徑主要化合物有酪氨酸、對羥苯基丙酮酸，而其轉氨酶也需要磷酸吡哆醛(維生素B6的代謝中間物)充作輔酶。本研究中顯示，與對照組相比，辣椒堿組中瘤胃內萬古霉素類抗生素的生物合成通路的代謝活性較弱，維生素B6代謝通路對應的代謝活性則更強。瘤胃內環(huán)境中萬古霉類抗生素含量降低，對鼠李糖乳桿菌生長繁殖的抑制作用削弱。鼠李糖乳桿菌屬于乳桿菌種屬，是革蘭陽性厭氧菌，可代謝單糖，產生少量醋酸和大量乳酸[27]。總而言之，瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)是一個動態(tài)循環(huán)的系統(tǒng)，各種屬微生物相生相克，彼此關聯(lián)影響，辣椒堿通過抑制放線菌屬或鏈霉菌屬活性，因而降低瘤胃萬古霉類抗生素含量，使得鼠李糖乳桿菌大量繁殖，進而促進奶牛的能量利用、平衡和調節(jié)瘤胃菌群的功能。

4 結 論

綜上所述，辣椒堿具有促進泌乳前期奶牛產奶的潛力，但對干物質采食量無顯著影響，辣椒堿能夠通過改變瘤胃菌群結構，影響瘤胃代謝物含量，改善瘤胃內環(huán)境。