熱應(yīng)激對奶牛乳腺功能的影響及機制研究進(jìn)展

鄭宇慧 歐陽潼 薛圣霖 李勝利

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

當(dāng)環(huán)境溫度升高到一定程度，奶牛產(chǎn)熱大于散熱，進(jìn)而出現(xiàn)體溫升高、呼吸頻率增加、產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降等現(xiàn)象，稱為奶牛熱應(yīng)激[1]。近年來已經(jīng)證實全球溫度的普遍升高和奶牛產(chǎn)奶量日益增加導(dǎo)致的代謝產(chǎn)熱增加是加劇奶牛熱應(yīng)激的2個直接誘因[2]。在熱帶及溫帶地區(qū)，奶牛的熱應(yīng)激問題日益受到關(guān)注[3]，如在德國、意大利和美國的溫帶地區(qū)，熱應(yīng)激已經(jīng)被認(rèn)為是影響奶牛產(chǎn)奶、繁殖和健康的重要因素[4-6]。在中國，奶牛主要飼養(yǎng)于北方地區(qū)，其中熱應(yīng)激對我國奶業(yè)主產(chǎn)區(qū)的河北、山東、河南、陜西和山西奶牛養(yǎng)殖影響較為嚴(yán)重[7]。

熱應(yīng)激會給奶牛生產(chǎn)帶來多方面的不良影響，如熱應(yīng)激會直接損害奶牛的乳腺健康，導(dǎo)致奶牛乳房炎等疾病的發(fā)病率增加[8-9]，進(jìn)而影響產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)，降低奶農(nóng)的盈利。因此，關(guān)注熱應(yīng)激對奶牛乳腺功能的影響及乳腺細(xì)胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)，對于維持奶牛乳腺結(jié)構(gòu)和功能的完整性、更好地采取有效措施緩減熱應(yīng)激對其乳腺組織的損傷具有重要意義。

1 熱應(yīng)激對泌乳期奶牛泌乳功能和乳腺健康的影響

1.1 產(chǎn)奶量

熱應(yīng)激是嚴(yán)重影響奶牛生產(chǎn)的因素之一。目前，盡管在奶牛養(yǎng)殖中已經(jīng)廣泛使用遮陽、風(fēng)扇和噴淋等降溫措施，但是由于熱應(yīng)激導(dǎo)致的泌乳期奶牛產(chǎn)奶量下降的經(jīng)濟損失仍然十分巨大[10]。熱應(yīng)激會降低泌乳期奶牛產(chǎn)奶量，且其影響程度與奶牛的泌乳階段密切相關(guān)[3]，熱應(yīng)激對泌乳早期奶牛的影響明顯高于泌乳中期和泌乳后期[11]。此外，熱應(yīng)激對泌乳期奶牛產(chǎn)奶量的影響在達(dá)到最大之前存在一個延遲期。Spiers等[12]和Bernabucci等[4]的研究均表明，將泌乳初期或泌乳中期奶牛從熱中性環(huán)境轉(zhuǎn)移到熱應(yīng)激環(huán)境后4 d，其產(chǎn)奶量會降至最低。溫濕度指數(shù)(THI)主要用于反映牲畜的熱應(yīng)激強度，已被廣泛用于評估奶牛在高溫條件下的熱應(yīng)激[13]。研究證實，在熱應(yīng)激條件下，奶牛產(chǎn)奶量隨THI升高呈線性降低，如當(dāng)THI從60增加到80時，THI每升高1，奶牛日產(chǎn)奶量就會降低0.13 kg[14]；在亞熱帶氣候條件下，當(dāng)日平均THI從72.1增加到83.6時，THI每增加1，荷斯坦奶牛的日產(chǎn)奶量就會降低0.88 kg[15]。

1.2 乳成分

此前大量研究證實，熱應(yīng)激與牛奶品質(zhì)下降有關(guān)，主要體現(xiàn)在乳蛋白、乳脂和乳糖含量的降低[16-17]。首先，與其他季節(jié)相比，夏季牛奶的乳蛋白含量降低了6%[16]。在熱應(yīng)激條件下，奶牛的產(chǎn)奶量降低了40%，牛奶的乳蛋白含量降低了4.8%[18]。干奶期熱應(yīng)激奶牛與噴淋降溫處理的奶牛相比，下一個泌乳期牛奶的乳蛋白含量顯著降低[19]；其次，脂質(zhì)是牛奶的重要成分之一，乳脂中98%由甘油三酯(TG)組成，以脂肪小球的形式存在[20]，鞘磷脂等極性脂質(zhì)對人體健康也具有減少膽固醇吸收[21]、促進(jìn)嬰兒認(rèn)知發(fā)展等有益作用[22]。此前研究發(fā)現(xiàn)，夏季牛奶的乳脂率較低[16,23-24]。通過氣象數(shù)據(jù)與紅外光譜預(yù)測的脂肪酸性狀之間的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激會導(dǎo)致牛奶中短鏈和中鏈脂肪酸含量減少。對牛奶的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測結(jié)果顯示：熱應(yīng)激(THI=84)與含有短鏈和中鏈脂肪酸的TG基團(tuán)的減少有關(guān)[25]。但是，在干奶期遭受熱應(yīng)激對奶牛下一泌乳期的乳脂產(chǎn)量無顯著影響[19]；除此之外，乳糖是牛奶中主要的碳水化合物，含量為4.5%～5.0%，約占牛奶能量的30%。乳糖易被人體吸收[26]，具有促進(jìn)兒童大腦發(fā)育、促進(jìn)離子吸收和預(yù)防糖尿病等慢性疾病的功能。權(quán)素玉[27]的研究顯示，熱應(yīng)激會降低奶牛乳糖產(chǎn)量。另外，在干奶期遭受熱應(yīng)激也會降低奶牛在下一泌乳期的乳糖產(chǎn)量[28-29]。

1.3 乳腺健康

乳房內(nèi)感染是奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失的主要原因之一，主要由葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等病原體誘發(fā)[30]。夏季溫度高且噴淋等降溫措施會增加環(huán)境濕度，為病原菌的生長繁殖提供了較為適宜的條件[15]，且熱應(yīng)激會損傷動物的免疫功能，進(jìn)而影響乳腺的局部免疫功能[31]。因此，熱應(yīng)激會引起奶牛乳房內(nèi)感染發(fā)生率的增加，進(jìn)而導(dǎo)致其乳汁中體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)升高，甚至誘發(fā)乳房炎，嚴(yán)重危害奶牛乳腺健康。研究表明，與其他季節(jié)相比，夏季的牧場大罐奶的SCC明顯升高[32]，奶牛的臨床性乳房炎發(fā)病率顯著上升[33-35]。李建國等[36]也證實，隨外界環(huán)境溫度改變，夏季乳房炎發(fā)病率顯著高于冬季，具體而言，奶牛乳房炎發(fā)病率在1(3.75%)～8月份(18.10%)逐步上升，之后隨氣溫降低逐步下降。THI從65上升至75，荷斯坦奶牛的SCC增幅最大[37]，且其乳房炎的發(fā)病率隨牛舍THI的升高而顯著增加[38]。研究證實，牛奶中的細(xì)菌數(shù)與動物乳腺病原體的脫落密切相關(guān)，Hamel等[39]通過對奶牛乳腺細(xì)菌脫落模式及不同致病菌脫落強度的研究表明，引起乳房炎的病原體中葡萄球菌的脫落強度低于鏈球菌。熱應(yīng)激條件下，THI的升高不僅會增加牛奶中的SCC[40]，還會顯著增加引起乳房炎的病原體從被感染的乳腺脫落的風(fēng)險，因此增加了牛群中新的乳房炎感染風(fēng)險。

2 熱應(yīng)激對干奶期奶牛乳腺的影響

2.1 乳腺結(jié)構(gòu)

干奶期是奶牛產(chǎn)前6～8周的非泌乳階段，此時奶牛乳腺會經(jīng)歷退化和再發(fā)育的過程，奶牛衰老的乳腺上皮細(xì)胞會被功能齊全的新細(xì)胞替代，為下一次泌乳做好準(zhǔn)備[41]。熱應(yīng)激會影響細(xì)胞的形態(tài)、凋亡和增殖，包括細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)膜功能、高爾基復(fù)合物的破壞、線粒體腫脹和熱休克等[42]。奶牛的產(chǎn)奶量由乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和每個細(xì)胞的泌乳能力共同決定，而乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量是由細(xì)胞增殖與凋亡之間的差異所決定的[43]。在乳腺組織中，熱應(yīng)激會導(dǎo)致具有抗凋亡作用的熱應(yīng)激蛋白表達(dá)增加[44]，并下調(diào)參與細(xì)胞生長的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、吞噬和存活相關(guān)基因的表達(dá)[45]，還會損傷乳腺上皮細(xì)胞合成相關(guān)蛋白，改變角蛋白和肌動蛋白的表達(dá)，造成乳腺退化。在乳腺再發(fā)育階段，熱應(yīng)激會導(dǎo)致干奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖受阻[46]，損傷其乳腺的微觀結(jié)構(gòu)，降低奶牛乳腺組織中的腺泡數(shù)量和面積，并增加其結(jié)締組織的比例，進(jìn)而對奶牛的下個泌乳階段造成不良影響[47-48]。

2.2 免疫狀態(tài)

熱應(yīng)激會對干奶期奶牛的免疫狀態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響，如抑制淋巴細(xì)胞增殖、降低針對非特異性抗原的抗體水平，還會影響奶牛下一個泌乳期血液中性粒細(xì)胞的氧化活性、吞噬作用和破壞病原體的能力[44]。遭受熱應(yīng)激的奶牛其乳腺相對而言需要更大的免疫細(xì)胞浸潤性[49]和礦物質(zhì)利用率[50]以應(yīng)對局部炎癥，熱應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能受損[51]，影響乳腺的局部免疫功能[31]，甚至導(dǎo)致全身免疫細(xì)胞的功能受損。奶牛乳腺在干奶期的更新過程會導(dǎo)致大量細(xì)胞碎片的積聚[43]，這些細(xì)胞碎片需要通過巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞進(jìn)行清除，因此，此時免疫活性的降低會干擾干奶初期奶牛乳腺的退化。

圍產(chǎn)期免疫功能失調(diào)是導(dǎo)致奶牛在泌乳早期發(fā)病率增加的重要因素，研究表明，干奶期熱應(yīng)激會加劇圍產(chǎn)期奶牛免疫功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致其泌乳早期乳房炎、呼吸系統(tǒng)疾病和胎衣不下等的發(fā)病率增加[52]。研究證實，奶牛產(chǎn)前熱應(yīng)激會減少其血液中能夠觸發(fā)機體免疫應(yīng)答的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，導(dǎo)致奶牛外周血中具有吞噬異物產(chǎn)生抗體作用的單核細(xì)胞增殖反應(yīng)減弱以及參與機體炎癥反應(yīng)的腫瘤壞死因子-α的生成減弱[51]，這可能與熱應(yīng)激加劇奶牛圍產(chǎn)期免疫功能失調(diào)密切相關(guān)。

2.3 犢牛初生重與初乳質(zhì)量

干奶期不僅是母牛乳腺發(fā)育的關(guān)鍵時期，也是其腹中胎兒快速生長發(fā)育的時期，干奶期熱應(yīng)激不僅影響胎兒發(fā)育，還會對犢牛未來的生長性能造成持續(xù)性影響。熱應(yīng)激會縮短奶牛的妊娠期，還會直接導(dǎo)致其干物質(zhì)采食量和體重降低[48]，進(jìn)而導(dǎo)致奶牛胎兒初生重降低[46,53]，與干奶期未熱應(yīng)激奶牛相比，妊娠后期奶牛若遭受熱應(yīng)激，其所產(chǎn)犢牛的平均出生重會降低約4.4 kg[54]。研究證實，干奶期熱應(yīng)激會降低初乳產(chǎn)量[55]，但對奶牛初乳中免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)含量的影響結(jié)果不一。Nardone等[56]和Adin等[19]的研究均表明，與非熱應(yīng)激奶牛相比，熱應(yīng)激會降低奶牛初乳中IgG含量。但也有研究發(fā)現(xiàn)，處于熱應(yīng)激狀態(tài)的奶牛其初乳中IgG含量與非熱應(yīng)激奶牛相比無顯著差異[57-59]。因此，干奶期奶牛熱應(yīng)激被動免疫受損是否會造成初乳中IgG含量的改變有待進(jìn)一步研究。

3 熱應(yīng)激影響奶牛乳腺功能的潛在機制

3.1 采食與代謝

恒溫動物通過保證熱量獲得和熱量損失之間的平衡來維持體溫，其中獲得的熱量是體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的熱量和環(huán)境中積累的熱量總和。在泌乳奶牛中，代謝產(chǎn)熱與產(chǎn)奶量密切相關(guān)[60]。產(chǎn)奶量為31.6 kg/d的奶牛代謝率比產(chǎn)奶量為18.5 kg/d的奶牛高17%[61]。隨著產(chǎn)奶量的增加，奶牛采食量和相關(guān)的消化產(chǎn)熱增加，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)熱增加，故高產(chǎn)奶牛在熱應(yīng)激時更難保持熱量平衡。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)奶量從35 kg/d增加到45 kg/d，導(dǎo)致奶牛熱應(yīng)激的空氣溫度閾值降低5 ℃[62]，因此，近年來奶牛產(chǎn)奶量的增加導(dǎo)致其代謝產(chǎn)熱增加，進(jìn)一步加劇了奶牛的熱應(yīng)激。

人們一直認(rèn)為熱應(yīng)激引起的干物質(zhì)采食量降低是導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少的主要原因[63]，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在高環(huán)境溫度下奶牛的生理狀態(tài)和新陳代謝發(fā)生明顯變化，這可能才是影響奶產(chǎn)量及乳成分的關(guān)鍵所在。熱應(yīng)激奶牛的分解代謝與熱中性條件下限飼誘導(dǎo)的分解代謝有本質(zhì)區(qū)別。在熱中性限飼條件下，奶牛依靠脂肪組織中脂肪酸的長期氧化來維持生命功能，并將葡萄糖用于乳糖合成。因此其典型特征是血漿非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸濃度升高及血漿葡萄糖濃度降低[64]。而在熱應(yīng)激條件下，血漿NEFA濃度沒有增加[65]，但肝臟葡萄糖輸出量大于牛奶乳糖輸出量。此前研究證實，在熱應(yīng)激條件下，泌乳期奶牛機體更偏好碳水化合物而非脂質(zhì)氧化，而在熱應(yīng)激的泌乳早期和泌乳中期奶牛中，優(yōu)先使用葡萄糖作為外周組織的主要能量底物是以犧牲產(chǎn)奶量為代價的[66-67]。但是，不同于泌乳早期和泌乳中期奶牛，在熱應(yīng)激條件下，妊娠后期奶牛的血漿NEFA濃度顯著增加，血漿葡萄糖濃度顯著降低，表明此階段奶牛的耐熱性更強[68]。這可能與其代謝產(chǎn)熱較低有關(guān)，因為妊娠后期奶牛的能量需要僅相當(dāng)于產(chǎn)奶量為3～6 kg/d的泌乳期奶牛[69]。因此，熱應(yīng)激條件下奶牛特殊的分解代謝可能是降低奶牛產(chǎn)奶量的關(guān)鍵所在，此外，這也可能是影響熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺吸收與利用營養(yǎng)物質(zhì)的重要因素。

3.2 乳腺營養(yǎng)物質(zhì)吸收

乳腺的血液流動在提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)支持乳成分合成方面起著關(guān)鍵作用，但關(guān)于動物在熱應(yīng)激下乳腺營養(yǎng)物質(zhì)吸收的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，相較未熱應(yīng)激組，熱應(yīng)激會降低處于泌乳中期奶山羊的乳腺血流量，還有降低其葡萄糖動靜脈濃度差的趨勢，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺葡萄糖的凈吸收量降低[70]；泌乳早期的家兔暴露于急性熱應(yīng)激時其乳腺血流量減少了35%[71]。熱應(yīng)激期間奶牛乳蛋白合成減少的機制主要包括以下幾點：1)乳腺血流量減少導(dǎo)致乳蛋白合成前體受限；2)乳腺蛋白合成活性的特定下調(diào)[72]；3)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)增加，酪蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白合成競爭氨基酸；4)瘤胃蛋白質(zhì)代謝的變化限制熱應(yīng)激期間牛奶蛋白質(zhì)前體的可用性[73]；5)奶牛暴露于嚴(yán)重的熱應(yīng)激后，熱休克蛋白(HSP)表達(dá)的增加可能會降低用于乳蛋白合成的循環(huán)氨基酸的利用率[72]；6)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑的激活減少[74]；7)調(diào)節(jié)奶牛的激素水平影響泌乳基因的表達(dá)[75]，增加機體發(fā)生氨基酸分解代謝提供能量，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成前體供應(yīng)不足[76]。關(guān)于熱應(yīng)激影響奶牛乳脂合成機制的研究表明[77]，乳脂合成受到抑制的途徑主要有2個：一個是在熱應(yīng)激狀態(tài)下，瘤胃中不飽和脂肪酸的氫化路徑改變，產(chǎn)生如共軛亞油酸的不飽和中間體，這些中間體被吸收后，會抑制乳腺細(xì)胞中合成乳脂基因的表達(dá)，從而影響乳脂率；另一個是在熱應(yīng)激情況下，脂多糖通過“腸漏”進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，刺激胰腺產(chǎn)生胰島素，導(dǎo)致動物體脂動員減少，乳脂率下降。此外，研究表明，造成乳糖產(chǎn)量下降的原因可能是熱應(yīng)激激活了奶牛的免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)激活后轉(zhuǎn)向利用葡萄糖，且腸道滲漏導(dǎo)致葡萄糖更多地進(jìn)入血液被利用，使得乳糖合成前體供給減少[77]。此外，Wang等[78]通過KEGG富集分析表明，血小板反應(yīng)蛋白受體36(CD36)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的基因表達(dá)在熱應(yīng)激條件下奶牛乳脂的合成中發(fā)揮著重要作用。

目前，由于乳腺活檢得到的是不同類型細(xì)胞的勻漿，包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞等，熱應(yīng)激如何影響體內(nèi)乳腺上皮細(xì)胞的營養(yǎng)吸收尚未完全明確。因此，未來研究可以關(guān)注熱應(yīng)激對乳腺上皮細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)吸收及熱應(yīng)激對奶牛不同泌乳階段乳腺營養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響。

3.3 內(nèi)分泌變化

除血流量外，熱應(yīng)激誘發(fā)的機體內(nèi)分泌的改變由于能導(dǎo)致全身性代謝變化進(jìn)而影響泌乳，也引發(fā)了人們的關(guān)注。如生長激素和胰島素樣生長因子-1含量在熱應(yīng)激條件下的減少，表明機體新陳代謝和營養(yǎng)分配發(fā)生了變化，這可能是導(dǎo)致熱應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)奶量下降的重要因素[18,79]。此外，下丘腦-垂體軸在抗逆性和泌乳調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，下丘腦是調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要大腦區(qū)域，能夠?qū)囟刃畔⑥D(zhuǎn)化為機體的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)[80]。垂體被認(rèn)為是奶牛體內(nèi)最重要的內(nèi)分泌腺，分泌催乳素(PRL)和生長激素(GH)，在乳腺發(fā)育、乳汁形成和乳脂合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[47]。Han等[81]研究顯示，下丘腦、垂體和乳腺的轉(zhuǎn)錄變化可能會影響小鼠在熱應(yīng)激條件下的泌乳性能，其潛在機制為：1)熱應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦食欲相關(guān)肽表達(dá)降低，導(dǎo)致牛奶合成的底物供應(yīng)不足；2)熱應(yīng)激增加神經(jīng)元死亡并減少神經(jīng)遞質(zhì)的合成，導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙和垂體激素(PRL和GH)含量的下降，降低奶產(chǎn)量。因此，后期試驗可進(jìn)一步以奶牛為試驗動物開展相關(guān)研究。

3.4 自由基穩(wěn)態(tài)失衡與氧化應(yīng)激

熱應(yīng)激會導(dǎo)致機體自由基穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激和免疫失衡與炎癥反應(yīng)失控的聯(lián)動反應(yīng)，如不及時干預(yù)，就會使機體多種生理功能，包括乳腺功能和健康狀況惡化。正常情況下，氧自由基能被機體清除系統(tǒng)及時清理。體內(nèi)自由基的清除系統(tǒng)由酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)2部分組成，酶促系統(tǒng)主要依靠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)發(fā)揮作用。SOD主要作用為將氧自由基歧化分解成水，GSH-Px主要通過其中的巰基和活性氧結(jié)合清除自由基。熱應(yīng)激條件下，動物的交感-腎上腺系統(tǒng)刺激增強，腎上腺髓質(zhì)部分泌大量兒茶酚胺類激素，其中的去甲腎上腺素作用會促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生，若此時酶與非酶類抗氧化物數(shù)量或活性不足會導(dǎo)致機體酶促與非酶促系統(tǒng)功能下降，使自由基無法被及時清除[82]?；钚匝鹾脱踝杂苫罅坷鄯e會引起脂質(zhì)過氧化，生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸將被氧化為不穩(wěn)定的脂質(zhì)過氧化物，如丙二醇(malondialdehyde，MDA)。MDA具有細(xì)胞毒性，可通過交聯(lián)作用破壞細(xì)胞膜蛋白分子構(gòu)象，導(dǎo)致細(xì)胞解體、損傷甚至死亡[83]。前人研究表明，熱應(yīng)激會使雛雞、小鼠[84]和豬[85]的機體代謝過程紊亂，氧自由基含量顯著上升，且抗氧化酶活性顯著下降，導(dǎo)致自由基無法及時被清除[86]。在熱應(yīng)激條件下，奶牛血清中SOD、GSH-Px活性顯著降低[87-88]，活性氧和MDA含量極顯著升高，總抗氧化能力顯著降低[89]。綜上所述，熱應(yīng)激會導(dǎo)致奶牛機體自由基穩(wěn)態(tài)失衡，從而使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

熱應(yīng)激條件下機體免疫功能和炎癥反應(yīng)失控可能與抗氧化酶參與了誘導(dǎo)奶牛淋巴細(xì)胞凋亡的過程有關(guān)[87]。研究證實，熱應(yīng)激會降低奶牛血清SOD和GSH-Px活性，進(jìn)而導(dǎo)致奶牛外周血淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高[90]，且在體外條件下，熱應(yīng)激也會使淋巴細(xì)胞的增殖減弱[91]。熱應(yīng)激誘發(fā)淋巴細(xì)胞凋亡的機制為：熱應(yīng)激刺激動物下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)分泌。GC能夠抑制淋巴細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞分裂，對巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞都有一定程度的損傷，進(jìn)而影響機體免疫過程[92-93]。此外，熱應(yīng)激還會導(dǎo)致抑制抗原遞呈和抗體活化，使得奶牛機體特異性免疫功能下降，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力下降。

4 奶牛乳腺細(xì)胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)

熱應(yīng)激時，奶牛的核心體溫升高[94]、乳溫升高[15]會直接或間接導(dǎo)致乳腺內(nèi)部溫度升高[95]。近年來，關(guān)于乳腺細(xì)胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)，主要圍繞HSP、細(xì)胞凋亡和乳腺上皮屏障的改變展開。

4.1 HSP

當(dāng)牛乳腺上皮細(xì)胞暴露于較高的溫度(42 ℃)時，其基因表達(dá)譜顯示，與應(yīng)激反應(yīng)和蛋白質(zhì)修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞代謝、形態(tài)變化和乳腺上皮細(xì)胞特異性生物合成功能相關(guān)的基因下調(diào)[96]。在熱應(yīng)激條件下，細(xì)胞可以形成高度調(diào)節(jié)的應(yīng)激反應(yīng)能力，熱休克信息在幾分鐘內(nèi)就會傳遞至細(xì)胞質(zhì)中，并立即啟動HSP的合成翻譯，通過修復(fù)蛋白質(zhì)損傷和促進(jìn)細(xì)胞正常生長條件來保護(hù)細(xì)胞免受熱應(yīng)激的損傷[97]。其中，HSP是細(xì)胞應(yīng)對熱應(yīng)激反應(yīng)的主要產(chǎn)物，并在細(xì)胞應(yīng)對熱應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子中發(fā)揮重要作用[98]，應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP能夠通過預(yù)防蛋白質(zhì)變性和修復(fù)變性蛋白質(zhì)保護(hù)細(xì)胞免受損傷，以便細(xì)胞能恢復(fù)其生物學(xué)功能。細(xì)胞會通過熱激轉(zhuǎn)錄因子-1(HSF-1)調(diào)節(jié)熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP基因的表達(dá)，還會刺激HSF-1的激活并與熱應(yīng)激元件(HSE)結(jié)合以誘導(dǎo)HSP的表達(dá)[98]。在正常條件下，細(xì)胞中存在一定量的HSP70，并且在細(xì)胞質(zhì)中與沒有DNA結(jié)合活性的HSF-1單體形成復(fù)合物[99]。熱應(yīng)激條件下，機體對細(xì)胞的保護(hù)可能是通過增加HSP70和其他HSP的合成來介導(dǎo)的。Wang等[100]認(rèn)為，HSP70的表達(dá)動力學(xué)可能是保護(hù)細(xì)胞損傷的重要原因，在細(xì)胞水平上，HSP70與應(yīng)激耐受性密切相關(guān)[101]。Hu等[102]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛乳腺上皮細(xì)胞中HSP70快速特異性合成，其轉(zhuǎn)錄量和蛋白表達(dá)量分別是非熱應(yīng)激組的14和3倍，證實在奶牛體內(nèi)，HSP70對溫度升高極為敏感，是負(fù)責(zé)保護(hù)細(xì)胞免受熱應(yīng)激的主要蛋白之一。胡菡等[103]在對奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行42 ℃熱處理0.5 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中HSF-1、HSP27、HSP70和HSP90幾個熱休克家族標(biāo)志性基因的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，且隨熱處理時間延長先持續(xù)上調(diào)，保持一段時間后降低。這些基因表達(dá)量的增加表明奶牛乳腺上皮細(xì)胞應(yīng)對熱應(yīng)激做出了自我快速保護(hù)反應(yīng)，先增后降的趨勢說明細(xì)胞對高溫應(yīng)激產(chǎn)生了耐受。

細(xì)菌入侵導(dǎo)致乳腺正常的分泌功能被破壞，HSPmRNA表達(dá)量升高，酪蛋白mRNA表達(dá)量降低[104]；3種最豐富的乳蛋白包括酪蛋白、β乳球蛋白和α乳白蛋白的mRNA表達(dá)量降低[105]。這些結(jié)果表明熱應(yīng)激會破壞乳腺正常的分泌功能并增加HSP的合成，以保護(hù)和維持細(xì)胞活性。Hu等[101]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激會誘發(fā)奶牛乳腺上皮細(xì)胞HSPmRNA表達(dá)量升高和酪蛋白mRNA表達(dá)量降低，證實熱應(yīng)激下奶牛乳腺會減少乳蛋白的合成以增加HSP的合成，進(jìn)而增強細(xì)胞自身的防御能力。

4.2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡能讓生物體在發(fā)育過程中去除不需要的細(xì)胞和維持組織穩(wěn)態(tài)，通常發(fā)生在發(fā)育和衰老過程中，是維持組織中細(xì)胞數(shù)量的一種穩(wěn)態(tài)機制。此外，一些生理和病理的原因也是引起細(xì)胞凋亡的重要因素。熱應(yīng)激是一種重要的誘導(dǎo)凋亡的應(yīng)激，它可以影響凋亡蛋白-1(Fas，又稱Apo-1)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[106]，其中，F(xiàn)as最早于1989年被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)多種人體細(xì)胞凋亡[107]，它是一種跨膜蛋白，屬于死亡受體亞家族，可以被凋亡相關(guān)因子配體(FasL)刺激，招募不同的接頭蛋白，激活啟動因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8和Caspase-3，從而啟動凋亡[108]。Cai等[109]研究證實，F(xiàn)as在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

線粒體是雙膜結(jié)合的亞細(xì)胞細(xì)胞器，通過呼吸和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝產(chǎn)生心肌腺苷三磷酸(adenosine triphosphoric acid，ATP)，是細(xì)胞能量的主要來源，其形態(tài)和數(shù)量由其連續(xù)的分裂和融合動態(tài)變化決定[110]。研究報道，熱應(yīng)激與線粒體腫脹及其嵴斷裂、基質(zhì)密度低、心肌ATP含量降低有關(guān)，表明熱應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能損傷[111]。Chen等[112]研究證實，熱應(yīng)激通過破壞線粒體裂變和融合的平衡而導(dǎo)致線粒體破碎，從而導(dǎo)致線粒體疾病和功能障礙，進(jìn)而誘發(fā)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡和乳腺功能障礙，其潛在機制如圖1所示。

B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白是位于線粒體上的跨膜蛋白，可以與其他跨膜蛋白協(xié)同作用，影響線粒體膜通透性和調(diào)控線粒體膜電位，從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[113]。Bcl-2家族蛋白分為2類，一類包括抗凋亡因子，如Bcl-2、重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2xL(Bcl-xL)和骨髓細(xì)胞白血病蛋白-1(Mcl-1)等，并且可以通過Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)起到封閉孔形成的作用，從而防止線粒體釋放凋亡因子細(xì)胞色素C并阻斷細(xì)胞凋亡或阻止鈣離子(Ca2+)的釋放，阻斷Caspase級聯(lián)反應(yīng)并抑制細(xì)胞凋亡；另一類包括促凋亡因子，例如Bax、Bcl2關(guān)聯(lián)死亡啟動子(Bad)和Bcl-2蛋白拮抗劑(Bak)等，它們可插入線粒體外膜形成通道，釋放凋亡活性物質(zhì)[113]。這2種蛋白通過一個二聚物網(wǎng)絡(luò)相互作用，不同的二聚體之間的平衡決定了細(xì)胞的凋亡，因此Bax與Bcl的比例越高，細(xì)胞凋亡的發(fā)生率就越高[114]。研究證實，熱應(yīng)激會通過提高Bax與Bcl的比例以誘發(fā)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡[115]。

4.3 乳腺上皮屏障

熱應(yīng)激會對上皮屏障的完整性產(chǎn)生負(fù)面作用，在先前的報道中，熱應(yīng)激在體外條件下增加了犬[116]和豬[117]腎上皮細(xì)胞以及人結(jié)腸和腎上皮細(xì)胞形成的上皮連接的通透性[118]。同樣，在體內(nèi)條件下，熱應(yīng)激也會損害豬、嚙齒動物和猴子腸道上皮的完整性[119-121]。然而，關(guān)于熱應(yīng)激對哺乳動物乳腺上皮組織通透性的影響研究較少，最近的一項研究探討了給泌乳中后期奶牛降溫和不降溫對奶牛乳腺上皮完整性的影響，結(jié)果表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛的乳腺能夠保持其上皮的整體完整性，但是急性熱應(yīng)激會暫時導(dǎo)致奶牛乳腺上皮屏障的滲漏[122]。在哺乳動物乳腺中，熱應(yīng)激會誘導(dǎo)廣泛的蛋白質(zhì)變性和降解[123-124]，因此，熱應(yīng)激可能導(dǎo)致上皮連接相關(guān)蛋白的凈損失，而熱應(yīng)激乳腺通過增加這些蛋白的基因表達(dá)來盡力保持其上皮的完整性，后期研究可關(guān)注乳腺緊密連接蛋白的表達(dá)情況。Collier等[96]研究表明，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在熱應(yīng)激條件下，有關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、新陳代謝、生物合成和細(xì)胞內(nèi)運輸相關(guān)的基因下調(diào)，而HSP70表達(dá)量下降到基礎(chǔ)水平后，參與細(xì)胞修復(fù)、蛋白質(zhì)修復(fù)降解和熱耐受喪失后凋亡的基因表達(dá)量顯著增加。因此，乳腺可能通過合成更多的蛋白質(zhì)來補償熱應(yīng)激導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損失。這些結(jié)果的確切機制目前尚不明確，但可能代表一種乳腺的適應(yīng)性機制，即動物機體以犧牲乳汁的合成為代價，轉(zhuǎn)移能量和營養(yǎng)以支持乳腺的關(guān)鍵功能如維持上皮的完整性等。

5 小 結(jié)

熱應(yīng)激是影響奶牛乳腺健康和生產(chǎn)性能的重要因素，不僅會導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的下降，還會影響奶牛乳腺健康，導(dǎo)致乳房炎發(fā)病率的增加，了解熱應(yīng)激對奶牛乳腺功能的影響及其潛在機制，明確乳腺細(xì)胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)，能為養(yǎng)殖中緩減奶牛熱應(yīng)激提供理論依據(jù)。