“疏肝降脂”針法治療非酒精性脂肪肝動物模型及療效

王喜臣 趙杰 賈炳超 劉新宇 胡英華

(長春中醫(yī)藥大學 1醫(yī)藥信息學院，吉林 長春 130117；2針灸推拿學院；3藥學院)

脂肪肝屬于良性病變，但最終可導致肝細胞纖維化，甚至肝硬化與癌變〔1〕。非酒精性脂肪肝(NAFLD)在人們追求飲食享受的過程中逐漸發(fā)展為一種社會疾病。由于目前尚缺乏有效的治療方法，且發(fā)病年齡日趨下降與發(fā)病率逐漸上升，已引起了相關研究人員的高度關注。研究表明，肝組織PGC-1α、PPARα等的基因表達水平與NAFLD的形成和發(fā)展關系密切〔2〕，而且PGC-1α、PPARα信號通路直接或間接參與白色和褐色脂肪代謝活動，促進能量與脂肪的代謝，進而減少脂質沉積。中醫(yī)治療NAFLD療效顯著〔3,4〕，針灸可起到疏肝降脂作用，故“疏肝降脂”針法的相關穴位與PPARα、PGC-1α信號通路具有可能潛在的相關性。本研究探討疏肝降脂針法治療NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇SPF級SD雄性大鼠40只，體質量160～200 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001。

1.2主要試劑與儀器 無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181023；甲醛，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170912；二甲苯，廣東光華科技股份有限公司，批號：20200902； 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒，碧云天，批號：c0105s； 高線切片石蠟，上海華永石蠟有限公司，批號：20171106；中性樹脂，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130619； 蛋白Marker，碧云天，P0068BCA；蛋白濃度測定試劑盒，碧云天，批號：P0012S； 抗UCP2抗體，博士德生物，批號：A02256-1，無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181023； ddH2O，北京鼎國昌盛生物技術有限公司，批號：B14100140； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time Takara，批號：AKF1919A。 脫水機，Leica，產品型號：TP1020 ；包埋機，Leica，產品型號：EG1150H；切片機，Leica，產品型號：RM2235；顯微鏡，Olympus，產品型號：IX73。

1.3動物分組 將大鼠隨機分為空白組(n=8)與實驗組(n=32)。將實驗組大鼠采用88%鼠糧+10%豬油+2%膽固醇喂養(yǎng)，誘發(fā)NAFLD，造模成功后，隨機分為模型組(n=8)、針灸治療組(n=12)、陽性藥物對照組(n=12)。

1.4方法 空白組與模型組正常喂養(yǎng)，陽性藥物對照組給予多烯磷脂酰膽堿膠囊灌胃，4 g/100 g,每天3次。針灸治療組選取肝俞、脾俞、足三里、中脘、豐隆，每日1次，每次20 min,各組均觀察30 d。

1.5觀察指標

1.5.1血脂檢測 取血前禁食禁水 12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠(0.4 ml/100 g)，抽取腹主動脈血約 5 ml，10 min 4 000 r/min離心 取上層血清，采用羅氏Cobas C701全自動生化分析儀和檢測羅氏 C701生化試劑檢測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5.2HE染色石蠟切片的制作過程 (1)取材與固定：取動物新鮮組織塊(一般厚度不超過0.5 cm)投入預先配好的固定液中(10%甲醛溶液)使組織、細胞的蛋白質變性凝固，以防止細胞死后的自溶或細菌的分解，從而保持細胞本來的形態(tài)結構。(2)脫水透明：一般用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑(80%酒精12 h，90%酒精12 h，95%酒精1 h，95%酒精1 h，100%酒精1 h，100%酒精1 h)，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。(3)浸蠟包埋：將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋：先制備好容器，倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻凝固成塊即成。包埋好的組織塊變硬，才能在切片機上切成很薄的切片。(4)切片與貼片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為5 μm厚。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45℃恒溫箱中烘干。(5)脫蠟：常用HE染色，以增加組織細胞結構各部分的色彩差異，利于觀察。染色前，二甲苯脫去切片中的石蠟，再經由高濃度到低濃度酒精(95%酒精12 h，85%酒精12 h，75%酒精1 h，50%酒精1 h)，最后入蒸餾水，行HE染色。(6)染色：①將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色10 min。②酸水中分色，各數秒鐘。③流水沖洗入蒸餾水片刻。④入酒精伊紅染色液染色2 min。(7)：脫水透明：染色后的切片經純酒精脫水，再經二甲苯使切片透明。(8)封固：將已透明的切片滴上樹脂，蓋上蓋玻片封固。待樹脂略干后，貼上標箋，切片標本就可使用。

1.5.3蛋白操作 取大鼠肝組織加入液氮剪碎并研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合物(100∶1)置于冰上 30 min，10 min 12 000 r/min離心后收集上清液，參照 BCA蛋白濃度測定試劑盒，測定肝組織中總蛋白濃度，配制 12%分離膠、5%濃縮膠，取 20 μg 蛋白上樣，待蛋白樣品剛進入濃縮膠時電壓設置為80 V，進入濃縮膠和分離膠分界線后，電壓升高至 120 V，電泳結束后，目的蛋白凝膠轉移到 PVDF 膜上，冰上進行轉膜，電流為 250 mA，反應時間 90 min，將目的條帶剪下，結束后用碧云天洗滌液清洗，加入碧云天封閉液進行10 min封閉，洗滌液溶液清洗后，分別加入一抗(抗-UCP2抗體、PPARα兔單克隆抗體、PGC1α兔單克隆抗體，稀釋倍數均為 1∶1 000)，搖床過夜，洗滌液清洗 后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(稀釋倍數1∶1 000)，室溫下孵育70 min，洗滌液清洗后，ECL顯色置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達情況。實驗采用Image J軟件對Western印跡條帶進行采集分析，并計算目的條帶相對值。

1.5.4肝臟總RNA提取 ①使用已高溫蒸汽滅菌的手術刀和鑷子從大鼠腹部解剖開，從中取出完整的肝臟組織，置于離心管后立即放入液氮中；②組織在液氮下研磨成粉，取少量至加有1 ml Trizol的1.5 ml離心管中，充分混合后于4℃，12 000 r/min離心15 min；③取上清移至新1.5 ml離心管中，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4℃，12 000 r/min離心15 min；④取上清移至新1.5 ml離心管中，加入500 μl異丙醇，輕輕顛倒10次，冰上放置20 min，于4℃，12 000 r/min離心15 min；⑤棄上清，加入1 ml 75%乙醇(用DEPC水現配現用)，于4℃，12 000 r/min離心5 min，重復此步驟一次；⑥棄上清后，室溫干燥5～7 min；⑦加入適量(20～30 μl)的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃保存，檢測RNA濃度，并電泳檢測。

1.5.5RNA濃度測定和電泳檢測 取2 μl提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter測定RNA濃度及A260/A280的相對吸光度，純凈RNA的A260/A280應在1.8～2.2。電泳檢測：1%瓊脂糖，1×ATE緩沖液，90 V電泳30 min，凝膠成像系統觀察，并分析結果。

1.5.6肝臟cDNA合成 反應按照TaKaRa公司的PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒說明書進行，合成cDNA模板。(1)(殘存的)基因組DNA的除去反應，在PCR管中配制如下緩沖液?；旌暇鶆蚝?，室溫放置20～30 min緩沖液具體配制用量，緩沖液試劑與用量：5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μl；gDNA Eraser，1.0 μl。(2)反轉錄反應，在PCR管中配制如下緩沖液(20 μl)，反應液配制在冰上進行。為了保證反應液配制的準確性，進行各項反應時，先按反應數+1的量配制Master Mix ，然后再分裝到每個反應管中。反轉錄反應試劑與用量：5倍PrimeScript? Buffer 2(for Real Time)，4.0 μl；PrimeScript? RT Enzyme Mix I，1.0 μl；RT Primer Mix，1.0 μl。(3)混合均勻后，在PCR儀上進行逆轉錄反應，反應條件為：37℃，15 min；85℃。然后將得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。

1.5.7實時定量PCR 以β-actin作為內參，在實時定量PCR儀(CFX96)中擴增，并測定擴增曲線。反應體系為: 1 μl引物(濃度:10 μmol/L)， 8.5 μl RNase-free water， 12.5 μl TB Green，2μl cDNA(逆轉后稀釋10倍)，反應結束后讀取CT值，并計算2-ΔΔCt，分析各基因表達情況，引物序列分別為：PGC-1α正義鏈5′- TTCAGGAGCTGGATGGCTTG-3′，反義鏈5′-GTGAGGACCGCTAGCAAGTT-3′；PPARα正義鏈5′-AGTCCTGGAACTGAAGCGAC-3′，反義鏈5′-GTTGAATGGTTGTGGCCAGG-3′；UCP2正義鏈5′-GCAGTTCTACACCAAGGGCT-3′，反義鏈5′-GGAAGCGGACCTTTACCACA-3′；β-actin正義鏈5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反義鏈5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

1.6統計學方法 運用SPSS23.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1針灸對非酒性脂肪肝大鼠血脂的影響 與空白組相比，模型組和陽性藥物對照組TC、TG及LDL-C明顯升高(P<0.05)，HDL-C明顯降低(P<0.05)。針灸治療組血脂趨于空白組。 見表1。

表1 各組血脂水平及肝臟組織PPARα、PGC-1α、UCP2 mRNA表達比較

2.2針灸改善高脂飲食肝臟組織病理變化 SD大鼠造模成功后HE染色，肝臟細胞腫脹，可見彌散性脂質空泡，經過陽性對照藥和針灸之后組織病理變化改善明顯脂質空泡變少。見圖1。

圖1 各組肝組織病理學改變(HE,×400)

2.3針灸調節(jié)高脂飲食肝臟組織PPARα、PGC-1α、UCP2 mRNA表達 與模型組相比，針灸治療組肝臟組織中脂質相關代謝基因UCP2表達降低(P<0.05)，而解耦聯蛋白PPARα、PGC-1α表達升高(P<0.05)，對引起損傷急性肝細胞凋亡有促進作用，見表1。

2.4針灸調節(jié)高脂飲食肝臟組織PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表達 與空白組相比，模型組SD大鼠肝臟組織中脂質相關代謝蛋白PPARα、PGC-1α表達降低(P<0.05)，而解耦聯蛋白UCP2表達增加(P<0.05)。經過針灸干預之后，PPARα、PGC-1α表達升高(P<0.05)，解耦聯蛋白UCP2表達降低(P<0.05)，趨于空白組。見圖2，表2。

1～4：模型組，陽性藥物對照組，針灸治療組，空白組圖2 各組肝臟組織PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表達

表2 各組肝臟組織PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表達

3 討 論

中醫(yī)中雖無NAFLD病名,但依據NAFLD臨床癥狀與發(fā)病原因可歸于中醫(yī)學“積聚”“肥”“肝癖”“痰痞”“脅痛”等范疇〔5,6〕，其病變部位在肝，其形成與肝、膽、腎、脾的生理功能失常密切相關。臨床治療一般應從脾腎虧虛論治，且須肝脾同調，健脾利濕，疏肝降脂。NAFLD病因以濕盛痰瘀為主，多因起居失常、氣機不利、情志失調、久病體虛而致正氣不足、邪氣上逆、濕邪困脾，終致多臟功能失調。臨床治療大多以健脾清熱，疏肝降脂為法，化痰祛濁，活血化瘀為則，常需大劑量藥物長期治療，重劑起沉疴。

多烯磷脂酰膽堿膠囊為從植物中提取，可對脂環(huán)醇、對乙酰氨基酚(撲熱息痛)、四氯化碳、氨基牛乳糖和乙醇等誘導的急性肝損傷具有肝臟保護作用，修復肝細胞膜，亦有抑制纖維化和脂肪變性功效，臨床中常用于輔助治療急慢性肝炎，藥物性肝損傷，肝硬化與肝衰竭等，改善脂質代謝，療程不少于90 d〔7～9〕。張明麗等〔10〕運用多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復)為治療組治療NAFLD，與運用肌苷片和維生素C治療進行治療的對照組進行統計比較，治療3個月后，治療組臨床癥狀、血脂、B超檢查結果、肝功能改善情況均優(yōu)于對照組，表明易善復治療NAFLD可取得良好的臨床療效。

本研究通過多年臨床經驗，提出運用“疏肝降脂”針法來治療非酒精性脂肪肝，臨證多選用期門、豐隆、中脘、足三里、三陰交、太沖等穴，結合中醫(yī)臟腑辨證，標本兼治，內外同調，攻補均施，調氣血，補津液，每獲良效，為臨床中治療本病提供了新的思路。本研究中所選用穴位中，肝俞益肝通絡、疏肝理氣，針刺可治療肥胖、肝氣郁滯型慢性膽囊炎、肝氣郁結型神志等多種疾病〔11,12〕；脾俞益氣健脾，利水濕、助運化，治療高脂血癥療效確切〔13,14〕；足三里燥脾化濕，生發(fā)胃氣，臨床針灸此穴，無論配伍他穴還是單用本穴，艾灸還是針刺，均有顯著的調脂功效，且具有雙向調節(jié)作用，為臨床調脂要穴〔15,16〕，中脘、豐隆通調脾胃氣機,使氣行津布，且與足三里聯合應用，療效更佳〔17,18〕。

本實驗表明“疏肝降脂”針法治療NAFLD動物模型療效顯著。