幽門螺桿菌無創(chuàng)性分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

遲文靜， 劉 濤， 劉宜昕， 趙 虎， 張艷梅

（復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

幽門螺桿菌是一種革蘭陰性微需氧菌，感染人體后，可定植在人胃部數(shù)十年之久[1]，與慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤和胃癌等消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是目前唯一被世界衛(wèi)生組織定為Ⅰ類致癌原的病原菌[2]。有流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，不同國家和地區(qū)幽門螺桿菌感染率不同，發(fā)達(dá)國家感染率為30%～50%，發(fā)展中國家為50%～90%[3]；我國的平均感染率為59%[4]。早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)干預(yù)是預(yù)防和控制幽門螺桿菌感染相關(guān)消化系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵。目前，診斷幽門螺桿菌的方法較多，其中培養(yǎng)法、快速尿素酶檢測(cè)法組織染色法等有創(chuàng)性方法，僅適用于少部分能采集到胃活檢組織的患者群體，陽性檢出率僅為20%左右，耗時(shí)長(zhǎng)（1周左右），而且除培養(yǎng)法之外，其他方法均存在著不能同步進(jìn)行耐藥及毒力分析的局限性[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)，口腔幽門螺桿菌與胃內(nèi)幽門螺桿菌具有很高的同源性，被稱為幽門螺桿菌的第二儲(chǔ)存池[6]。口腔內(nèi)幽門螺桿菌與胃部疾病伴發(fā)口腔疾病密切相關(guān)，也可能是幽門螺桿菌根除治療后復(fù)發(fā)的原因之一[7]。糞便樣本也有較高的幽門螺桿菌檢出率，且其菌種與耐藥表型與胃內(nèi)的幽門螺桿菌高度一致，尤其在慢性胃病患者抑制胃酸治療后，胃酸過少可能會(huì)增加糞便中幽門螺桿菌的數(shù)量[8]。此外，在臨床工作中，采集口腔和糞便樣本具有方便、無創(chuàng)傷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，在分子水平評(píng)估幽門螺桿菌的遺傳信息，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)人體內(nèi)幽門螺桿菌的感染情況，為臨床幽門螺桿菌感染的精準(zhǔn)診療提供了有效幫助[9]。本文重點(diǎn)介紹幽門螺桿菌無創(chuàng)性分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，并比較多種常規(guī)幽門螺桿菌檢測(cè)方法的利弊。

1 幽門螺桿菌常規(guī)檢測(cè)方法

幽門螺桿菌組織病理切片染色法可在鏡下鑒定幽門螺桿菌的同時(shí)進(jìn)行胃黏膜的病理學(xué)診斷，準(zhǔn)確性較高，但必須通過胃鏡采集胃黏膜活檢組織，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)[10]。分離培養(yǎng)鑒定法可將胃黏膜活檢組織勻漿后接種在高營養(yǎng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行幽門螺桿菌培養(yǎng)，是鑒定幽門螺桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但幽門螺桿菌培養(yǎng)需要微需氧等苛刻條件，且陽性檢出率僅20%左右，培養(yǎng)時(shí)間也長(zhǎng)達(dá)1周，不利于幽門螺桿菌感染的快速診斷[11]。快速尿素酶檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、特異性高，但僅適用于活動(dòng)性幽門螺桿菌感染；若幽門螺桿菌數(shù)量少，或觀察時(shí)間短、試劑質(zhì)量不穩(wěn)定，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，假陰性率較高[12]。13C或14C尿素呼氣試驗(yàn)不需通過內(nèi)鏡獲取樣本，目前主要應(yīng)用于體檢人群或門診患者，技術(shù)要求低、敏感性高，但缺點(diǎn)是特異性相對(duì)較低、費(fèi)用高，且易受抑菌藥物和抑酸藥物的影響，非幽門螺桿菌尿素酶細(xì)菌也可能造成假陽性[13]。血清抗體檢測(cè)法主要檢測(cè)血清中幽門螺桿菌IgG/IgM抗體成分，可用于幽門螺桿菌篩查[14]，具有快速、微創(chuàng)和能夠分型等優(yōu)點(diǎn)，但存在窗口期，不能反映現(xiàn)癥感染[15]。尿液抗體檢測(cè)法主要檢測(cè)尿液中的幽門螺桿菌IgG，該方法敏感性和特異性較高，適合大范圍幽門螺桿菌感染的流行性調(diào)查[16]。但目前尚沒有尿液幽門螺桿菌檢測(cè)的共識(shí)或指南，故該方法未廣泛應(yīng)用于臨床。糞便抗原檢測(cè)也能反映是否感染幽門螺桿菌，目前主要分為以單克隆抗體為基礎(chǔ)和以多克隆抗體為基礎(chǔ)兩大類，其中以單克隆抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性更高，該方法也可應(yīng)用于體檢人群的篩查，但不能進(jìn)行耐藥性和毒力分析[17]。以上常規(guī)檢測(cè)方法中，有些方法不能對(duì)幽門螺桿菌感染進(jìn)行實(shí)時(shí)、快速和無創(chuàng)檢測(cè)，有些方法不能對(duì)幽門螺桿菌的耐藥特點(diǎn)或毒力分型進(jìn)行分析，極大地影響了幽門螺桿菌感染的早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)治療。

2 無創(chuàng)性分子生物學(xué)方法

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等分子檢測(cè)技術(shù)有著更高的靈敏度和特異性，根據(jù)不同的基因序列設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)無創(chuàng)性樣本中幽門螺桿菌的鑒定基因（16SrRNA、ureC）、毒力基因（cagA、vacAS1、vacA2、vacAm1、vacAm2、glmM、babA、babB）和耐藥基因（23SrRNA、rdxA、pbp1A、gyrA），能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)幽門螺桿菌的感染情況[18]，具有快速、經(jīng)濟(jì)和實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 口腔幽門螺桿菌的分子檢測(cè)

唾液中含有口腔定植的細(xì)菌、病毒、真菌和脫落上皮細(xì)胞等，可在口腔中不斷產(chǎn)生，且容易自行收集。因此，檢測(cè)口腔中的幽門螺桿菌成為一種快速、可行的方法。然而口腔中大量快速生長(zhǎng)的細(xì)菌可能抑制苛養(yǎng)菌的生長(zhǎng)，唾液中含有的一些抑菌蛋白，如分泌型IgA、乳鐵蛋白、溶菌酶等，使得通過培養(yǎng)方法檢測(cè)唾液中的幽門螺桿菌幾乎不太可能實(shí)現(xiàn)。牙菌斑是牢固地黏附在牙齒表面，以黏性基質(zhì)為基礎(chǔ)的細(xì)菌性群體，是一種不能通過洗漱去掉的細(xì)菌性薄膜[19]；牙菌斑由大量細(xì)菌、細(xì)胞間物質(zhì)、少量白細(xì)胞、脫落上皮細(xì)胞和食物殘?jiān)冉M成，成分復(fù)雜，通過培養(yǎng)的方法檢測(cè)牙菌斑中幽門螺桿菌的研究極少。PCR通過設(shè)計(jì)不同引物檢測(cè)口腔樣本中的幽門螺桿菌，使口腔幽門螺桿菌檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)[20]。

2.1.1 口腔幽門螺桿菌分子檢測(cè)方法和檢出率

用不同的方法檢測(cè)口腔中的幽門螺桿菌，檢出率存在較大的差異[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括TaqMan探針法和染料法2種方法，TaqMan探針法應(yīng)用更廣泛。TaqMan探針法的引物和探針與靶基因的結(jié)合都是特異性的，利用這種雙重特異性，可以按不同的檢測(cè)目的進(jìn)行設(shè)計(jì)，如評(píng)估幽門螺桿菌的數(shù)量、測(cè)定其毒力基因分型、測(cè)定耐藥基因[22]。WONGPHUTORN等[23]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和半巢式PCR檢測(cè)了泰國東北部110例無癥狀感染者糞便和唾液樣本中的16SrRNA基因和vacA基因，發(fā)現(xiàn)群體感染率為64%，提示實(shí)時(shí)熒光定量PCR和半巢式PCR具有良好的檢測(cè)性能；通過7名參與者糞便和唾液樣本來源的基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹（該樹形成了不同的聚類群），可見幽門螺桿菌在宿主體內(nèi)有著不同的基因進(jìn)化特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)行完全閉管式操作，避免了因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)不同步導(dǎo)致的污染所產(chǎn)生的假陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物和信號(hào)讀取的同步性也提高了反應(yīng)精度，擴(kuò)增產(chǎn)物也可進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠[24]。

巢式PCR利用2套引物進(jìn)行2次擴(kuò)增，根據(jù)DNA模板序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，利用第1對(duì)引物（外引物）對(duì)靶DNA進(jìn)行15～30個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增，之后將部分100～1 000倍稀釋的擴(kuò)增產(chǎn)物作為二次擴(kuò)增的模板，依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)第2次擴(kuò)增的引物（內(nèi)引物），再進(jìn)行15～30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，第2次擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段為第1次擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部堿基[25]。由于巢式PCR首先用第1引物對(duì)樣本內(nèi)的原始DNA模版進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行第2次擴(kuò)增和檢測(cè)，運(yùn)用雙引物特異性的累加，使特異性和靈敏度高于普通PCR，這一特點(diǎn)十分有利于唾液和糞便等幽門螺桿菌含量低的樣本的檢測(cè)，也適用于胃出血或正在服用質(zhì)子泵抑制劑的患者樣本的輔助檢測(cè)[26]。ISMAIL等[27]采用巢式PCR和組織病理學(xué)方法檢測(cè)49例幽門螺桿菌感染者的牙菌斑樣本，發(fā)現(xiàn)巢式PCR的敏感性（40.8%）略高于組織病理學(xué)方法（36.7%）。FERNáNDEZ-TILAPA等[28]為研究無消化不良癥狀人群口腔中幽門螺桿菌的感染率和vacA基因，采集了200名無癥狀成年人的牙菌斑和唾液樣本，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、半巢式PCR和巢式PCR對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)口腔幽門螺桿菌的陽性率為17%，且有些樣本中存在多種vacA基因型。提示無癥狀感染人群中血清學(xué)檢測(cè)陽性者口腔幽門螺桿菌陽性率比陰性者高，表明無癥狀感染者口腔中可能存在多種基因型的幽門螺桿菌菌株。

2.1.2 口腔幽門螺桿菌與胃幽門螺桿菌的相關(guān)性

口腔幽門螺桿菌基因型與胃黏膜幽門螺桿菌的比對(duì)結(jié)果可以驗(yàn)證2個(gè)不同部位的幽門螺桿菌是否有相關(guān)性或同源性。ZOU等[21]通過薈萃分析，比較了PCR檢測(cè)胃幽門螺桿菌與口腔幽門螺桿菌的檢出率，結(jié)果表明，胃幽門螺桿菌陽性患者口腔幽門螺桿菌陽性檢出率比胃幽門螺桿菌陰性患者高，提示口腔中的幽門螺桿菌與胃部幽門螺桿菌具有一定相關(guān)性。

為研究慢性胃炎患兒口腔與胃部幽門螺桿菌是否具有同源性，CAI等[29]收集了235例患兒胃鏡檢查前的口腔樣本和胃黏膜樣本，采用PCR檢測(cè)16SrDNA基因和cagA基因，結(jié)果顯示，有46例患兒胃幽門螺桿菌陽性，其中26例患兒口腔和胃黏膜幽門螺桿菌的16SrDNA基因均陽性，且這26例患兒中，有12（46.1%）例口腔幽門螺桿菌的cagA基因陽性，明顯低于胃黏膜幽門螺桿菌cagA基因的陽性率（80.8%，P=0.010）；口腔和胃黏膜樣本序列比對(duì)的同源性范圍為74.0%～92.1%，證實(shí)了在同一個(gè)體中口腔幽門螺桿菌與胃部幽門螺桿菌具有較高的同源性。

2.1.3 口腔在幽門螺桿菌傳播過程中的作用

有研究發(fā)現(xiàn)，居住環(huán)境、家庭人數(shù)、飲食習(xí)慣和衛(wèi)生條件等與幽門螺桿菌感染率有一定的相關(guān)性，說明幽門螺桿菌很有可能從一個(gè)個(gè)體直接傳播到另一個(gè)個(gè)體，也說明了口-口途徑和糞-口途徑是幽門螺桿菌在人群中最有可能的傳播方式[30]。IWAI等[31]采集了192例患者的牙菌斑和唾液，采用巢式PCR檢測(cè)幽門螺桿菌ureA基因，發(fā)現(xiàn)有23例患者ureA基因陽性，2例患者牙菌斑樣本幽門螺桿菌陽性但唾液樣本陰性，提示牙菌斑可能是口腔中幽門螺桿菌存在的主要部位，幽門螺桿菌可能存在從齲齒到根管的傳播路徑。

MOMTAZ等[32]通過比對(duì)胃黏膜、糞便與唾液樣本中的ureC、vacA和cagA基因，發(fā)現(xiàn)不同類型樣本中有高度相似的幽門螺桿菌基因型，證實(shí)了幽門螺桿菌主要通過糞-口途徑傳播和口腔是幽門螺桿菌另一重要的儲(chǔ)存場(chǎng)所的結(jié)論；同時(shí)，3種樣本中顯著不同的基因型也表明同一患者體內(nèi)可能存在多種基因型的幽門螺桿菌。

2.1.4 口腔幽門螺桿菌在診斷胃幽門螺桿菌感染中的作用

由于口腔幽門螺桿菌和胃幽門螺桿菌之間的基因型存在一定的相關(guān)性，通過口腔幽門螺桿菌基因型的鑒定可為口腔幽門螺桿菌的感染類型和患者疾病類型的診斷提供一定的依據(jù)[33]。為評(píng)估患者胃幽門螺桿菌的感染類型，TIWARI等[34]收集了55例十二指腸潰瘍患者、25例胃潰瘍患者和40例無癥狀感染者的唾液樣本，采用PCR檢測(cè)樣本中cag毒力島的多種基因，發(fā)現(xiàn)與無癥狀感染者的cagE基因和cagT基因所占比例（77.5%和85%）相比，胃潰瘍患者這2種基因所占比例（92.5%和96.2%）更高，證實(shí)了唾液是一種可靠的檢測(cè)毒力基因的無創(chuàng)性樣本，也提示cagT基因作為重要的細(xì)胞毒素相關(guān)基因，很大程度上會(huì)導(dǎo)致人發(fā)生胃部疾病。

2.2 糞便樣本幽門螺桿菌的分子檢測(cè)

糞便成分非常復(fù)雜，主要包含各種微生物、無機(jī)化合物、膽鹽、多糖、未消化的植物纖維和大量降解酶等。糞便中大量快速生長(zhǎng)的微生物會(huì)抑制微需氧菌幽門螺桿菌等苛養(yǎng)菌的生長(zhǎng)[35]。因此，從糞便樣本中分離、培養(yǎng)幽門螺桿菌非常困難。此外，糞便的復(fù)雜成分可能導(dǎo)致DNA抽提困難。選擇合適的類便樣本的分子生物學(xué)檢測(cè)方法至關(guān)重要。

糞便樣本中的微生物種群復(fù)雜，進(jìn)行DNA提取后，可能會(huì)有一些干擾PCR檢測(cè)的物質(zhì)存在于臨床樣本中[36]。微滴數(shù)字PCR的微滴被有限稀釋后獨(dú)立分割形成的數(shù)萬個(gè)獨(dú)立擴(kuò)增體系，有效減少了干擾，并保證了即使不超過10 CFU/mL的模版也能得到擴(kuò)增，提高了檢測(cè)低幽門螺桿菌模版樣本的敏感性。同時(shí)，微滴數(shù)字PCR統(tǒng)計(jì)的是初級(jí)模版擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)，引用泊松分布，可提高其計(jì)算的精確度[37]。TALARICO等[38]用微滴數(shù)字PCR測(cè)定了79份幽門螺桿菌抗原陽性的糞便樣本，16SrRNA基因的檢測(cè)敏感性為100%，CagA抗體陽性糞便樣本cagA基因分型陽性率為88%。另一項(xiàng)研究結(jié)果表明，微滴數(shù)字PCR可以有效區(qū)分克拉霉素耐藥基因相關(guān)的23SrRNA基因的突變型和野生型位點(diǎn)，以確定幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥性[39]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）通過1對(duì)外部引物和1對(duì)內(nèi)部引物，可以識(shí)別幽門螺桿菌基因序列上6個(gè)不同的區(qū)域，對(duì)幽門螺桿菌基因序列具有高度的選擇性[40]。BAKHTIARI等[41]用未感染幽門螺桿菌的健康志愿者的糞便和幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 43504）混合制作了8個(gè)濃度（1×10-2～1×105CFU/mL）的幽門螺桿菌菌懸液，采用LAMP測(cè)定幽門螺桿菌的cagA基因，結(jié)果顯示，糞便樣本幽門螺桿菌低濃度檢測(cè)限達(dá)到1×10-1CFU/mL。張超群等[42]采用LAMP檢測(cè)幽門螺桿菌感染者無創(chuàng)性樣本和胃液樣本的cagA基因，并通過稀釋模板的檢測(cè)驗(yàn)證其靈敏度，結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)cagA基因的靈敏度是1×102CFU/mL。以上研究結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)幽門螺桿菌濃度較低的糞便樣本，敏感性較高。

BECKMAN等[43]用TaqMan探針法檢測(cè)了294份幽門螺桿菌感染者的糞便樣本，結(jié)果顯示，檢測(cè)靈敏度為93.8%，克拉霉素耐藥基因突變位點(diǎn)陽性率為36.2%，并證實(shí)了耐藥突變基因型與根除感染密切相關(guān)。GIORGIO等[44]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了52份幽門螺桿菌感染者的糞便樣本和胃活檢組織樣本的克拉霉素耐藥基因突變位點(diǎn)A2143G、A2142C和A2142G，結(jié)果顯示，有10例（19.2%）為A2143G突變，有5例（9.6%）為A2142C突變，有4例（7.7%）為A2142G突變，表明糞便和胃活檢組織樣本檢測(cè)結(jié)果是一致的。陳穎婷等[45]采集了120例經(jīng)胃鏡檢查顯示有胃內(nèi)疾病的患者的胃黏膜樣本和30例幽門螺桿菌感染確診患者的糞便樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胃黏膜樣本幽門螺桿菌陽性率為77.5%、糞便樣本為26.92%；而通過普通PCR擴(kuò)增胃黏膜樣本的16SrRNA基因，發(fā)現(xiàn)胃黏膜樣本陽性率為50%、糞便幽門螺桿菌抗原檢測(cè)的陽性率為5.55%，提示實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定糞便樣本幽門螺桿菌有著良好的檢測(cè)性能。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，傳統(tǒng)的13C或14C呼氣試驗(yàn)、快速尿素酶檢測(cè)和血清學(xué)抗體檢測(cè)等方法雖具備各自的優(yōu)勢(shì)，但是也均存在一定的不足?？谇缓图S便等無創(chuàng)性樣本可以實(shí)時(shí)反映消化道幽門螺桿菌感染的整體性，且患者易于接受，具有較高的臨床應(yīng)用前景。隨著的分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，更多更加靈敏、特異的技術(shù)可從口腔和糞便樣本中得到更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)口腔和糞便樣本進(jìn)行幽門螺桿菌檢測(cè)，既可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人體內(nèi)幽門螺桿菌的感染情況，又可以對(duì)其毒力和耐藥性等進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，為臨床的及時(shí)診斷、精準(zhǔn)治療和療效監(jiān)控提供更加全面、可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。