響應(yīng)面優(yōu)化提取向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷的工藝研究

呂佳佳，張 勇，戴余軍*，江 芹，魏帥潤喆，蔡樹龍，殷 曉

(1.湖北工程學(xué)院 湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北 孝感 432000； 2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

向日葵列當(dāng)(OrobanchecumanaWallr.)俗稱獨根草、兔子拐棍，為列當(dāng)科(Orobanchaceae)列當(dāng)屬(Orobanche)一年生全寄生性草本植物，在我國分布很廣，主要分布于河北、北京、新疆、山西、內(nèi)蒙古、黑龍江、遼寧、吉林等省(自治區(qū)、直轄市)[1-2]。列當(dāng)屬多種植物在我國部分地區(qū)民間已作為藥用，其全草可入藥，具有強筋壯骨、壯陽補腎、延緩衰老、改善腦組織循環(huán)、增強免疫等功效[3-4]。其主要的活性成分為苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides，PhGs)，是一類由咖啡酸、苯乙醇苷元和糖基組成的天然化合物，其結(jié)構(gòu)特征主要是以β-葡萄糖為母核的并含有酯鍵及氧苷鍵，羥基和甲氧基連于苯乙基上，中心葡萄糖基上常連有乙?；涂Х弱；鵞5]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。現(xiàn)代藥理研究表明，苯乙醇苷類化合物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等方面發(fā)揮著重要的作用[6-12]。向日葵列當(dāng)是一種?；暂^強的寄生性雜草，由于其自身沒有葉綠素，不能進行光合作用，得完全靠從寄主向日葵根部吸取營養(yǎng)而存活，從而影響向日葵的產(chǎn)量和品質(zhì)[13-15]。所以長期以來，向日葵列當(dāng)一直被當(dāng)作農(nóng)田雜草進行防治根除，其藥用價值被長期忽視。

圖1 苯乙醇苷基本結(jié)構(gòu)

本研究以向日葵列當(dāng)全草為原料，采用乙醇加熱回流法提取向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷，在單因素的試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對其工藝條件進行優(yōu)化，以期為向日葵列當(dāng)藥用資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

T9CS型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市億能實驗儀器廠)；GTR16-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司)；PTX-JA2105電子天平(華志電子科技有限公司)；超純水(Milli-Q純水系統(tǒng)，武漢優(yōu)普純水設(shè)備有限公司)。向日葵列當(dāng)于2020年9月購自內(nèi)蒙古商都縣；毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS No：61276-17-3，批號：M01101910014 ，HPLC > 99%)購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜級)和乙醇(分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 苯乙醇苷的提取

1.2.1 原料預(yù)處理

將一定量向日葵列當(dāng)洗凈后，置60 ℃干燥箱烘干，于多功能粉碎機中粉碎，過60目篩(0.25 mm孔徑)，密封冷藏備用。

1.2.2 提取工藝流程

向日葵列當(dāng)粉與一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇配制成一定液固比→在一定溫度下加熱回流一定時間→離心(轉(zhuǎn)速5000 r/min，15 min)→濾渣重復(fù)浸提一定次數(shù)→合并濾液，得到待測樣品溶液。

1.2.3 最大吸收波長的確定

精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液，于200 ～ 800 nm處進行全波長掃描。

1.2.4 樣品中苯乙醇苷含量的測定

本研究采用紫外分光光度法測定向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷含量[16]。用乙醇配制毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL)，精確吸取1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 mL標(biāo)準(zhǔn)液并定容至25 mL，充分混勻。以95%乙醇為空白，在335 nm下測定吸光度值，以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：y=0.0289x+ 0.003(R2=0.9999)，表明在0 ～ 52 μg/mL范圍內(nèi)毛蕊花糖苷濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

樣品溶液用95%乙醇溶液稀釋至合適濃度，測定335 nm處吸光度值，計算樣品中苯乙醇苷含量。苯乙醇苷得率的計算公式為：

式中：Y為苯乙醇苷得率(%)，C為樣品溶液中苯乙醇苷的含量(μg/mL)，V為樣品溶液體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.5 影響提取效果的因素試驗

1)單因素試驗設(shè)計

分別對溶劑的種類(乙醇、甲醇、水)、溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(35%,45%,55%,65%,75%)、提取溫度(35,50,65,80,85 ℃)、提取時間(30,60,90,120,150 min)、液固比(10∶1,20:1,30:1,40:1,

50:1(mL/g))、提取次數(shù)(1,2,3,4,5)進行單因素考察。

2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面法Central Composite Design設(shè)計原理，以單因素結(jié)果所選因素為自變量，苯乙醇苷得率為響應(yīng)值，進行4因素3水平響應(yīng)面試驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行多元線性回歸方程擬合，檢驗?zāi)Ｐ?，根?jù)模型進行響應(yīng)值預(yù)測，優(yōu)化向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷的提取工藝條件，并進行驗證試驗。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)分別用Excel 2016、Design-Expert 8.0.6軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均在335 nm處有最大吸收峰，故選擇335 nm作為本試驗苯乙醇苷的測定波長。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的掃描光譜圖

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 溶劑的種類對苯乙醇苷提取效果的影響

不同的提取溶劑對苯乙醇苷提取效果的影響見圖3。由圖3可知，3種不同溶劑提取苯乙醇苷得率分別為9.23%(乙醇)、7.70%(甲醇)和4.31%(水)，由于乙醇具有低毒性、高滲透性和易揮發(fā)性等性質(zhì)，其在天然活性成分的提取中備受青睞。因此，本研究選用乙醇作為后續(xù)實驗提取劑。

圖3 溶劑種類對苯乙醇苷得率的影響

2.2.2 溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苯乙醇苷提取效果的影響

不同溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苯乙醇苷提取效果的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)在35% ～ 55%時，苯乙醇苷得率隨溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增加，當(dāng)溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于55%，隨著溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，苯乙醇苷得率反而下降，這可能是較高的溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)使苯乙醇苷的溶出率趨于飽和，同時使其他醇溶性物質(zhì)增多，從而導(dǎo)致苯乙醇苷得率下降。因此選擇最佳的溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%。

圖4 溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對苯乙醇苷得率的影響

2.2.3 提取溫度對苯乙醇苷提取效果的影響

溫度的高低，會影響苯乙醇苷分子之間的擴散速度。不同提取溫度對苯乙醇苷提取效果的影響見圖5。由圖5可知，隨著提取溫度的升高，苯乙醇苷提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在30 ～ 80 ℃時，隨提取溫度的增加而升高，當(dāng)提取溫度超過80 ℃后，苯乙醇苷提取得率呈下降趨勢，這可能是由于過高的提取溫度影響了苯乙醇苷的穩(wěn)定性，因此選擇最佳的提取溫度為80 ℃。

2.2.4 提取時間對苯乙醇苷提取效果的影響

時間因素是影響工業(yè)化產(chǎn)量周期的一個關(guān)鍵性因素，因此常作為工業(yè)提取重要的因素考察。不同提取時間對苯乙醇苷提取效果的影響見圖6。由圖6可知，隨著提取時間的延長，苯乙醇苷提取得率呈現(xiàn)先升高后急劇下降至基本穩(wěn)定的趨勢。在60 min時，苯乙醇苷得率最高，這可能是因為在60 min前，原料中的物質(zhì)在提取溶劑中得到充分溶解。繼續(xù)延長浸提時間，開始急劇下降最后趨于穩(wěn)定，這可能是由浸提時間過長導(dǎo)致苯乙醇苷物質(zhì)的活性發(fā)生改變，且較長的時間也會大大影響工業(yè)化生產(chǎn)周期。因此選擇最佳的提取時間為60 min。

圖5 提取溫度對苯乙醇苷得率的影響

圖6 提取時間對苯乙醇苷得率的影響

2.2.5 液固比對苯乙醇苷提取效果的影響

合適的液固比可以減少原料和試劑的消耗。不同液固比對苯乙醇苷提取效果的影響見圖7。由圖7可知，隨著液固比的增加，苯乙醇苷提取得率隨之增大，當(dāng)液固比為40:1(mL/g)之后，苯乙醇苷得率開始下降，這可能是在苯乙醇苷提取的過程中，需要一定的溶劑滲入原料的孔隙中，進行溶解出苯乙醇苷，當(dāng)溶劑過多時，溶解出的苯乙醇苷達(dá)到飽和后便開始稀釋苯乙醇苷溶液，進而導(dǎo)致苯乙醇苷得率降低。因此選擇最佳的液固比為40:1(mL/g)。

圖7 液固比對苯乙醇苷得率的影響

2.2.6 提取次數(shù)對苯乙醇苷提取效果的影響

選擇合適的提取次數(shù)，既可以最大限度獲取苯乙醇苷，也可以在一定程度上節(jié)省時間，減少提取劑的浪費。不同提取次數(shù)對苯乙醇苷提取效果的影響見圖8。由圖8可知，隨著提取次數(shù)的增加，苯乙醇苷提取得率隨之增加，提取4次后，苯乙醇苷得率漸漸趨于穩(wěn)定，說明在提取4次后，苯乙醇苷類物質(zhì)已基本提出。因此，綜合考慮，在優(yōu)化試驗中，將提取次數(shù)固定為4次。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷提取工藝

2.3.1 Design-Expert 8.0.6設(shè)計及試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，提取次數(shù)固定為4次，采用響應(yīng)面(Central Composite Design)設(shè)計原理。以苯乙醇苷得率為響應(yīng)值(Y)，選取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、液固比(D)作為自變量，建立4因素3水平共30個試驗點的響應(yīng)面分析試驗?zāi)Ｐ?，其?4個為析因點，6個為檢驗誤差的中心點。因素水平表見表1，試驗設(shè)計和結(jié)果見表 2。

圖8 提取次數(shù)對苯乙醇苷得率的影響

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型顯著性檢驗為極顯著(P< 0.01)，說明模型的建立具有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項為不顯著(P= 0.3259 > 0.05)，說明模型與實驗的誤差較小，無擬合因子的缺失。F值的大小可直接判斷各因素對苯乙醇苷得率的影響程度，F(xiàn)值越大，對苯乙醇苷得率的影響就越顯著。F值大小依次為：提取溫度 > 提取時間 > 溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù) > 液固比。校正決定系數(shù)R2=0.9951，說明自變量引起的苯乙醇苷得率變化占99.51%，變異系數(shù)為0.15%，說明模型中只有0.15%的變異，進一步印證該模型具有較好的擬合度。

通過模型分析，以苯乙醇苷得率(Y)對A、B、C、D的二次多項式回歸方程為：

Y=6.06+0.3A+0.68B+0.18C+0.063D+0.044AB+0.052AC+0.075AD+0.55BC-0.41BD-0.2CD+0.11A2+0.25B2-0.051C2+0.25D2+0.15ABC+0.36BCD-0.41A2B-1.06A2D-0.079AB2+0.85A2B2(R2=0.9951)。

模型中，A、B、C、BC、BD、CD、B2、D2、ABC、BCD、A2B、A2D、A2B2對苯乙醇苷得率的影響為極顯著(P< 0.01)。

表3 響應(yīng)面方差分析表

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)曲面可直觀反映各因素之間交互的顯著性，響應(yīng)曲面越陡峭，說明因素之間的交互作用越顯著，影響越大，反之則影響越小[17]。利用 Design-Expert 8.0.6 軟件可以分析各因素對苯乙醇苷得率的影響以及任意2個因素之間的交互作用，響應(yīng)面曲線見圖9。由圖9可知，在交互項對苯乙醇苷得率的影響中，當(dāng)其他因素保持在零水平時，溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的改變對提取溫度、提取時間和液固比的顯著影響程度不大，反之也是。這說明溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)與提取溫度、提取時間和液固比之間的交互作用并不顯著，但其他因素之間的交互作用顯著，這與表3方差分析結(jié)果是一致的。

圖9 各因素交互作用對苯乙醇苷得率影響的響應(yīng)面圖

2.4 最佳工藝條件的確定及模型驗證

為了確定最佳工藝優(yōu)化參數(shù)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型方程進行進一步分析，得到向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷提取的最佳工藝參數(shù)為：溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，提取溫度為85 ℃，提取時間為90 min，液固比為30:1(mL/g)，提取次數(shù)為4次。在此條件下，模型預(yù)測苯乙醇苷得率為10.117%，與試驗15號條件一致。為進一步確定其工藝參數(shù)的可行性及穩(wěn)定性，在上述條件下進行驗證性試驗，平行測定3次，苯乙醇苷平均得率為10.223%±0.03%，與模型預(yù)測值相比，相對誤差約為0.106%，這說明實際值與模型預(yù)測值之間無顯著性差異。由此可知，通過此模型來預(yù)測向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷的提取工藝是可行的。

3 小結(jié)

本研究采用干燥的向日葵列當(dāng)粉末為原料，乙醇為提取溶劑進行回流提取。通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定了向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷的提取工藝：溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，提取溫度為85 ℃，提取時間為90 min，液固比為30:1(mL/g)，提取次數(shù)為4次，在此條件下，苯乙醇苷得率為10.223%±0.03%，與模型預(yù)測值相比無顯著性差異。通過響應(yīng)面模型分析，該工藝條件是穩(wěn)定可行的。