蘋果MdGH3-2/12在鹽脅迫下的功能分析

馬夢楠，劉 媛，馬鋒旺，鄒養(yǎng)軍

(西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100)

蘋果(MalusdomesicaBorkh.)是世界主栽果樹之一，我國蘋果的種植面積和產量均占世界50%以上，居世界第一位[1]。西北地區(qū)是我國主要蘋果產區(qū)，因條件限制，干旱和鹽脅迫等成為制約這一地區(qū)蘋果產業(yè)發(fā)展的重要因素。我國的鹽堿地約占全國耕地面積的7%左右，而將來土壤鹽漬化可能會更嚴重[2]。土壤鹽漬化會改變土壤中離子濃度、滲透勢，造成離子紊亂，影響植株生長，進而導致作物產量下降。近年來鹽堿地的改良已經在技術方面取得了不錯的成果[3]，但是因為成本過高，改良往往達不到預期效果。因此盡快發(fā)掘蘋果中逆境脅迫基因以提高蘋果抵御脅迫的能力，保證其在不良條件下產量也能增加，對于促進我國的蘋果產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

植物在受到鹽脅迫后會發(fā)生許多變化[4]，從表觀來看，長期鹽脅迫會導致植株長勢緩慢，根系不能正常發(fā)育，莖稈矮小，葉片發(fā)黃失綠直至壞死脫落，干物質積累量減少等[5]。從微觀來看，植物在受到鹽脅迫時體內會發(fā)生許多復雜的理化反應，主要有Na+濃度過高引起的離子毒害、根系細胞失水引起的滲透脅迫和體內活性氧積累引起的氧化脅迫[6]，細胞膜的完整性與穩(wěn)定性，以及植株凈光合速率、代謝能力、滲透調節(jié)物質的生成，活性氧的產生與消除，抗氧化相關酶活性和礦質元素的吸收和積累等都會受到影響[7-8]。除了改變形態(tài)以及生理活性來適應鹽脅迫外，植物還會通過調控激素變化來響應各種脅迫[9]。人類最早發(fā)現(xiàn)的一種植物激素是生長素(IAA)[10]，IAA通過調控下游基因的表達來控制植物對環(huán)境作出反應，GH3(GretchenHagen3)家族就是一個生長素早期響應基因家族，最早由Gretchen Hagen在大豆中發(fā)現(xiàn)[11]，目前已在蘋果[12]、擬南芥(Arabidopsis)[13]、煙草(Nicotiana)[14]、水稻(Oryza)[15]、辣椒(Capsicum)[16]、玉米(Zea)[17]和小麥(Triticum)[18]等多種植物中得到鑒定。前人的研究證實GH3基因會參與植物生長發(fā)育，GH3蛋白可通過促進各種激素與氨基酸結合來調節(jié)體內不同激素的穩(wěn)態(tài)，激活激素信號途徑來提高植物對逆境的抗性[19]，部分GH3蛋白還參與植物根部生長發(fā)育的調控，控制頂端優(yōu)勢、衰老及逆境適應等生理過程[13，20-21]，對植物的早期發(fā)育和形態(tài)建成均具重要意義。大部分GH3家族成員具有不止一種生長素氨基酸合成酶活性，例如AtGH3.6在鹽脅迫下表達量顯著增加，在干旱、ABA和高鹽等逆境脅迫下，過表達GH3-6還會抑制RD22、KIN1和RD29A等逆境響應基因的表達[22]。與野生型相比，擬南芥過表達GH3-6突變體明顯不耐干旱和鹽脅迫[23]。干旱也會顯著誘導GH3-5表達，但不同的是GH3-5過表達突變體表現(xiàn)出較強的耐旱性，這可能因為GH3-6只能以IAA為底物完成腺苷酰化，而GH3-5可以同時作用于IAA和SA，其可能會通過水楊酸途徑提高擬南芥植株的耐旱能力[24]。水稻中過表達OsGH3.1會降低生長素的含量，進而抑制細胞的生長，提高了水稻在真菌病原脅迫下的抗病性[25]。本實驗室博士黃冬[26]發(fā)現(xiàn)MdGH3-2/12在叢枝菌根共生中扮演重要角色，將蘋果中MdGH3-2和MdGH3-12基因同時干擾后發(fā)現(xiàn)AMF侵染率降低，且轉基因植株比野生型植株對干旱脅迫表現(xiàn)得更敏感[27]。以上研究表明，GH3基因家族在響應非生物脅迫中起著重要作用。

為進一步探究MdGH3-2和MdGH3-12基因在蘋果響應鹽脅迫中的功能，本試驗以野生型蘋果植株和RNA干擾MdGH3-2/12蘋果植株為材料，進行了為期15 d的120 mM·L-1NaCl水培處理，對鹽脅迫下蘋果植株的生長指標與生理指標的變化進行了分析，初步探究了將MdGH3-2和MdGH3-12基因干擾后蘋果植株對鹽脅迫的響應，為提高蘋果耐鹽性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘋果野生型(WT)材料為本實驗室保存‘嘎啦’蘋果(M.domesticacv. Gala)品種(GL-3)，轉基因材料由實驗室已畢業(yè)博士黃冬轉化獲得。MdGH3-2/12干擾植株獲得3個株系，分別為RNAi的1、9和10號，簡寫為GR-1、GR-9以及GR-10。

1.2 試驗設計

試驗于2020年5月起在西北農林科技大學果樹逆境生物學實驗室的組培室以及水培室進行，位于陜西省咸陽市楊凌區(qū)西北農林科技大學南校區(qū)(東經107°59′，北緯34°14′)。供試材料的培養(yǎng)條件參照孫遜[27]的方法。組培苗在生根培養(yǎng)基上生根后移栽至營養(yǎng)土中，在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長1個月，待其長至8片真葉后挑選長勢一致的植株轉移至水培盆中進行鹽脅迫處理，水培方式參考梁博文[28]的方法。將植株分成2組，一組進行鹽處理(120 mM·L-1NaCl+1/2 Hoagland營養(yǎng)液)，另一組設為對照組(1/2 Hoagland營養(yǎng)液)。Hoagland營養(yǎng)液的配置參考康曉育[29]的方法。各重復每株系至少40株。處理15 d時植株表現(xiàn)出明顯傷害，取頂部1～2片葉用來檢測基因對鹽脅迫的響應，取莖尖以下第4～6片葉用來檢測生理指標。

1.3 生物量的測定

處理結束時各處理各株系隨機選取10株蘋果苗，將植株分為根、莖、葉三部分，并用清水、蒸餾水、超純水依次清洗一遍，擦干水分后，用萬分之一天平測定植株鮮重，然后將各部分分別裝入信封袋后置于烘箱105℃殺青20 min，而后在65℃下烘至恒重，再用萬分之一天平分別稱量植株各部分的干重。總鮮重和總干重分別為各部分鮮重和干重之和，相對生長速率的計算方法為處理植株的重量除以對照植株的重量。

1.4 生理指標的測定

1.4.1 光合參數(shù)、總葉綠素含量、丙二醛含量、根系活力以及相對電導率的測定 在試驗進行的第0、5、10、15天，上午8∶30—11∶30使用CIRAS-3便攜式光合系統(tǒng)(CIRAS, Amesbury, MA,USA)測定植株從頂端數(shù)第4～8片葉的光合參數(shù)：Pn、Gs和Ci，每處理每株系取3個生物學重復，每個重復選取5棵植株。測定時選用紅藍光源，設定光強為1 000 μmol·m-2·s-1，流速為300 μmol·s-1以及參比室CO2濃度為300±5 cm3·m-3。

葉綠素含量：根據(jù)Porra等[30]改良修訂的方法進行測定。在鹽處理結束時，取植株新鮮葉片，去掉主葉脈后剪成1 mm左右的細絲混勻，稱取0.1 g浸泡入10 ml 80%的丙酮溶液中避光浸提，期間充分搖晃離心管4次使葉綠素完全溶解，每處理每株系進行3次生物學重復。48 h后待浸提結束，用UV-2550分光光度計分別測定663、645 nm和470 nm下吸光值，以80%丙酮作為空白對照，分別計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素濃度以及總葉綠素含量。

葉綠素計算公式：

Ca(mg·L-1)=12.7×A663-2.69×A645×V/(1000×W)

Cb(mg·L-1)=22.9×A645-4.68×A663×V/(1000×W)

Cc(mg·L-1)=(1000×A470-3.27×Ca-104×Cb)×229×V/(1000×W)

C總(mg·L-1)=(20.2×A645+8.02×A663)×V/(1000×W)

式中,A663、A645、A470分別為相應波長下的吸光值，V為提取液的體積，W為葉片鮮重。

丙二醛(MDA)含量和根系活力使用檢測試劑盒(蘇州科銘生物)按照說明書方法測定。

相對電導率(REL)的測定參照陳愛葵等[31-32]的方法：取莖尖以下第4～6片葉，用打孔器打取10個小葉圓片，充分浸泡在8 ml去離子水中，蓋好離心管蓋。常溫浸泡4 h，期間充分搖晃離心管4次，直至完全浸泡出葉圓片中的細胞液。而后使用雷磁DDS-307電導率儀測定電導率，用R1表示，去離子水電導率用R0表示。再將離心管沸水浴20 min，冷卻至室溫后搖勻，測定煮沸后電導率R2，按以下公式計算REL:

REL(%)= (R1-R0)/(R2-R0)×100%

1.4.2 葉片氣孔的觀察 鹽處理結束后，取各株系第3～6片葉片，避開葉片主脈剪下寬約5 mm的細條，并迅速剪成方形放入1 mL離心管中，管內裝有冰浴預冷的4%戊二醛固定液，置于4℃冰箱保存。上機觀察前將樣品經0.1 M磷酸緩沖液沖洗1次后，用90%、80%、75%、50%、30%的乙醇溶液逐級脫水，在通風櫥用乙酸異戊酯置換處理，用Hitachi HCP-2型臨界點干燥器干燥后粘樣噴金。用鎢燈絲掃描電鏡分別在300和3 000倍下觀察并拍照，每個處理各拍10張，最后用ImageJ軟件對氣孔密度、長度和開張度進行統(tǒng)計分析。

1.4.3 氨基酸含量的測定 使用液質聯(lián)用儀(SCIEX, QTRAP5500)測定氨基酸含量：將葉片凍樣研磨成粉末后準確稱取0.1 g至預冷的1 mL 50%乙醇提取液中提取，然后4℃、12 000 r·min-1離心10 min，用1 mL注射器吸取上清液用0.22 μm有機濾膜過濾后，置于冰上待測。吸取50 μL上清液加入干凈棕色進樣瓶中，添加950 μL色譜級純甲醇至終體積為1 mL后上樣。使用LC-MS系統(tǒng)檢測，色譜柱為Inertsil ODS-4 C18(4.6×250 mm, 5 μm)，流速設定為0.3 mL·min-1。洗脫溶劑體系為含有0.1%(v/v)甲酸的超純水(A)和乙腈(B)。通過與Sigma氨基酸標準品獲得的峰面積(標曲)進行比較來計算結果。

1.4.5 礦物質元素含量測定 Na+、K+含量通過火焰分光光度計Sherwood M410(Cole-Parmer，Chicago，America)測定，具體參考趙琪[33]的方法。

1.4.6 RNA提取和qRT-PCR表達定量分析 植物總RNA使用Wolact?植物RNA分離試劑盒(深圳市凱聯(lián)生物技術有限公司，中國)，按照說明書進行提取。反轉錄得到的cDNA核酸樣品的濃度和純度使用微型分光光度計進行檢測。NanoDrop 2000C(Thermo Fisher Scientific，Massachusetts,America)測定濃度后，用滅菌后的蒸餾水將cDNA全部稀釋成200 ng·μL-1。LightCycler 96熒光定量儀(Roche, Switzerland)進行qRT-PCR分析，熒光實時定量染料采用SYBR Premix Ex TaqTMII(Takara, Tokyo, Japan)。選取蘋果MDH(MDP0000197620)為內參基因；用2-ΔΔCT方法計算目的基因的相對表達量[34]。引物序列見表1。

表1 論文中所用引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

所獲得的原始數(shù)據(jù)在Microsoft office Excel中處理并作圖，利用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA方法進行Duncan’s檢驗(P<0.05)，數(shù)據(jù)全部以平均值±標準偏差(SE)表示。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株表型的變化

在正常條件下，WT和RNAi各株系植株的生長和表型無明顯差異，經過鹽處理后，所有的植株葉片表面都出現(xiàn)了比較明顯的傷害，RNAi植株的葉表面比WT明顯出現(xiàn)更多褐斑，葉片壞死的程度也要明顯高于WT植株(圖1a)。鹽處理后各株系MDA含量均上升，RNAi植株株系(GR-1,GR-9,GR-10)MDA含量分別為WT植株的1.15、1.25倍和1.16倍，差異顯著(圖1b)。REL也有相同變化規(guī)律，RNAi植株株系內REL分別為WT植株的1.23、1.39倍和1.48倍(圖1c)。鹽處理后植株的總葉綠素含量都顯著降低，RNAi植株株系內總葉綠素含量分別為WT植株的90.7%、86.2%和81.9%(圖1d)。觀測植株根系發(fā)現(xiàn)低濃度鹽脅迫促進了蘋果植株發(fā)新根(圖1f)，測定后發(fā)現(xiàn)各株系根系活力增加，但RNAi植株各株系的根系活力顯著低于WT植株，分別為WT植株的93.8%、77.5%和90.0%(圖1e)。

2.2 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株的生長量變化

如表2所示，鹽處理15 d后分別對處理組和對照組植株的鮮重進行測量后發(fā)現(xiàn)，與對照處理相比，鹽處理后各組織的鮮重均下降，各株系(WT,GR-1,GR-9,GR-10)葉片鮮重分別為對照組的73.9%、81.5%、72.6%和77.8%，顯著下降；植株莖重也有相同趨勢；根鮮重變化無顯著差異。正常條件下，RNAi植株各株系的總鮮重與WT植株無顯著差異。鹽處理后，RNAi植株各株系的總鮮重分別為WT植株的86.7%、82.4%和87.9%，顯著下降。

如表3所示，與對照處理相比，鹽處理后，各株系根部的干重顯著增加，分別為對照組的119.8%、117.7%、102.9%及109.0%；莖干重、葉片干重顯著下降。鹽處理后，RNAi材料各株系的根干重分別為WT材料的88.2%、85.0%和89.5%，莖干重分別是WT材料的87.7%、91.8%和89.7%，葉片干重分別為WT材料的96.2%、87.9%、和97.6%，均顯著下降。綜上可知，鹽處理會對植株生物量的積累產生不利影響，但一定程度鹽濃度可促進植株根部物質積累。與WT植株相比，RNAi植株各株系在鹽脅迫下受到的不利影響更大，將MdGH3-2/12基因干擾后會導致植株的干重和鮮重均下降。

2.3 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株光合熒光參數(shù)的變化

在正常條件下，對照組各株系之間的光合參數(shù)，包括Pn、Gs和Ci值均無顯著差異(圖2)。鹽處理后植株(WT,GR-1,GR-9,GR-10)的Pn、Gs和Ci值都表現(xiàn)出顯著的下降趨勢，Pn值分別下降至對照處理的51.3%、33.0%、40.3%和43.1%，RNAi植株各株系顯著低于WT植株(圖2a)；Ci和Gs值也有類似的變化趨勢(圖2b,2c)。對植株的最大光化學效率(Fv/Fm)的測量結果表明，經過鹽處理后，RNAi植株各株系的Fv/Fm值顯著降低，分別為WT植株的97.0%、96.4%和97.5%(圖2d)，植株的活體熒光圖也能證明干擾株系在鹽脅迫下受到的傷害更大(圖2e,熒光數(shù)值越小，顏色越接近黑色，受傷害越嚴重)。

2.4 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株葉片氣孔的變化

在掃描電鏡下300倍和3 000倍鏡頭視野下對蘋果野生型和轉基因植株的氣孔形態(tài)進行了觀測，發(fā)現(xiàn)正常條件下的野生型和轉基因蘋果植株的氣孔開度沒有明顯差異；在鹽處理后，RNAi植株各株系和WT植株的氣孔開度分別縮小了35.0%、39.0%、55.0%和46.2%，與WT植株相比，RNAi植株各株系的氣孔開放程度顯著降低，部分氣孔甚至出現(xiàn)閉合狀態(tài) (圖3a,3d)。鹽處理后，氣孔變短，但各株系之間無顯著差異(圖3b)；RNAi植株各株系的氣孔密度顯著高于WT植株，氣孔密度分別增加了15.0%、40.8%、21.2%和26.5%(圖3c)。

2.5 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株中氨基酸代謝的變化

檢測MdGH3-2/12基因干擾后蘋果葉片各材料中15種氨基酸水平的變化，結果顯示，鹽處理后，各株系中甘氨酸(Gly)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)的含量均顯著增加(圖4e,4g,4k,4l,4n)，其中WT植株中Pro的含量增加了2.6倍，而相比于WT植株，RNAi植株GR-9中Pro的含量增加了10.3倍，GR-10和GR-1也分別增加了6.3和7.1倍(圖4k)。此外，鹽處理后，各植株各株系中精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)和蘇氨酸(Thr)的含量都顯著下降(圖4b,4c,4d,4f,4i,4m)，其中WT植株中Asp含量下降了2倍，相比于WT植株，RNAi植株各株系分別下降了1.5、2.4、1.2倍(圖4c)。

2.6 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株中活性氧含量及抗氧化系統(tǒng)的變化

2.7 鹽脅迫下MdGH3-2/12干擾蘋果植株中Na+和K+積累的變化

對處理組和對照組各株系的根、莖、葉中Na+和K+的濃度進行了測定，發(fā)現(xiàn)鹽處理后各組織尤其根中Na+有大量積累，分別增加至對照后9.5、5.9、12.2倍和10.3倍，RNAi植株GR-9和GR-10的Na+積累量顯著高于WT植株(圖6a-6c)；而各組織中的K+的含量都顯著降低，如各植株葉片中K+的含量分別降低了31.2%、48.2%、40.5%和39.3%，差異顯著(圖6d～6f)。鹽處理后，各組織Na+/K+比值顯著高于對照處理，各株系根中的Na+/K+比值分別為0.497、0.558、0.525和0.577，RNAi植株各株系顯著高于WT植株(圖6g～6i)。

為了探究植株中Na+/K+比值變化與離子轉運相關基因表達量的關系，對各株系根系中離子轉運相關基因的表達量進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)鹽處理后各株系根中MdSOS1、MdSOS2和MdSOS3以及MdNHX1的表達量都顯著上調，但RNAi植株各株系內各基因表達量顯著低于WT植株(圖7a～7d)，其中MdSOS1分別上調3.97、2.31、1.91倍和2.81倍；MdSOS2分別上調2.37、1.44、1.26倍和2.34倍；MdSOS3分別上調1.74、1.56、2.21倍和1.68倍；MdNHX1分別上調1.59、1.74、1.45倍和1.40倍，而植株中MdAKT2-3(K+transporter 2-3)基因的表達量分別下調61.7%、44.4%、46.8%和35.9%，RNAi植株各株系顯著低于WT植株(圖7e)。

3 討 論

大量研究表明鹽脅迫會改變植物的形態(tài)、生理、生化和代謝特征，對植物的生長和生物量的積累會產生不利影響[36-39]。本試驗結果表明，在正常條件下，轉基因植株和野生型植株的生長狀況和表型無明顯差異，經過鹽處理后，所有的植株葉片表面都出現(xiàn)了比較明顯的受傷害特征，這與前人研究一致。與對照處理相比，鹽脅迫后，將MdGH3-2/12基因干擾后的蘋果植株葉面存在比野生型植株更多的褐斑和壞死現(xiàn)象，且各株系的葉片干、鮮重也都顯著低于野生型。細胞中的MDA含量高低可以代表膜脂過氧化程度，相對電導率可以衡量生物膜的透性，二者的含量可以在一定程度上直接反映植物細胞膜在受到脅迫時生物膜的完整程度和損傷程度[40]。鹽處理后，轉基因植株較野生型植株中總葉綠素含量顯著下降，轉基因株系內總葉綠素含量分別為野生型的90.7%、86.2%和81.9%；MDA含量和REL則顯著增加，轉基因株系內MDA含量分別為野生型的1.15、1.25倍和1.16倍，REL分別為野生型的1.23、1.39倍和1.48倍，這表明相比于野生型植株，干擾MdGH3-2/12轉基因蘋果植株在鹽脅迫下生物膜受損傷程度更大。有研究表明擬南芥GH3家族的一個基因ydk1-D可參與調控擬南芥下胚軸生長和根的伸長[41]，本試驗中觀察到轉基因植株根系小于野生型。在對植株的根系活力進行測定后發(fā)現(xiàn)，經過鹽處理后各株系的根系活力上升，但轉基因植株各株系的根系活力顯著低于野生型植株，分別為野生型的93.8%、77.5%和90.0%，可能導致在鹽脅迫下蘋果植株根部吸收能力下降。

鹽脅迫會抑制植物的生長、生物量的積累。在本試驗中，正常條件下各株系鮮重之間無顯著差異，鹽處理后，轉基因植株各株系總鮮重分別為野生型的86.7%、82.4%和87.9%，顯著下降。鹽處理后各株系(WT,GR-1,GR-9,GR-10)葉片的鮮重下降，分別為對照組的73.9%、72.9%、72.6%和77.8%，轉基因植株各株系鮮重分別為野生型的89.9%、85.0%和92.5%，顯著下降；植株莖重也有相同趨勢。從各株系的干重變化來看，與對照組相比，鹽處理后各株系根部的干重都顯著增加，分別為對照組的119.8%、117.7%、102.9%及109.0%， RNAi各株系根的干重相比于野生型都顯著下降，分別為野生型的88.2%、85.0%和89.5%。鹽處理后，各株系的莖干重也顯著下降，轉基因植株各株系莖干重分別是野生型的87.7%、91.8%和89.7%。轉基因植株各株系葉片干重分別為野生型的96.2%、87.9%和97.6%，也顯著下降。以上結果表明，鹽脅迫會影響蘋果生物量積累，而將MdGH3-2/12干擾后，蘋果植株在鹽脅迫下生物量積累較野生型下降。

研究表明，鹽處理會導致不同植物的葉片氣孔開度變小[42]，影響氣體交換參數(shù)、葉綠素含量和葉綠素熒光值，因此葉片吸收外界CO2的能力下降，進而使植物光合能力下降。本試驗中，與對照相比，鹽脅迫下植株的Pn、Ci、Gs值和Fv/Fm值都顯著下降，其中Pn值分別下降至對照組的51.3%、33.0%、40.3%和43.1%；轉基因植株各株系Pn值顯著低于野生型植株；葉片受損嚴重，鹽處理后轉基因植株的最大光化學效率顯著降低，分別為野生型的97.0%、96.4%和97.5%，植株的活體熒光圖也證明轉基因植株各株系在鹽脅迫下受到的傷害更大，這同Alam等[43]對大豆的研究結果相一致。以上結果表明在鹽脅迫下，轉基因植株較野生型植株的光合系統(tǒng)受到更嚴重的傷害，植株光合能力顯著下降。氣孔開度是衡量植物與環(huán)境間的水分、CO2平衡以及循環(huán)的重要生理指標，也是影響蒸騰速率的主要原因之一[44]。在掃描電鏡下對野生型和MdGH3-2/12干擾蘋果植株的氣孔進行了觀測，發(fā)現(xiàn)在正常條件下，株系間氣孔開度沒有明顯差異，而經過鹽處理后，各株系的氣孔開度分別縮小了35.0%、39.0%、55.0%和46.2%，轉基因植株各株系部分氣孔甚至出現(xiàn)閉合狀態(tài)；各株系的氣孔密度分別增加了15.0%、40.8%、21.2%和26. 5%，轉基因植株各株系的氣孔密度顯著高于野生型。因此轉基因植株各株系氣孔縮小甚至部分關閉，可能導致植株在受到鹽脅迫時凈光合速率顯著低于野生型。

植物在遭受脅迫時，細胞內的游離氨基酸會對脅迫做出響應，Pro就是其中的一種多功能氨基酸，常被認為是一種滲透脅迫信號[48-49],在各種逆境條件下都會參與植物的生長發(fā)育。研究表明，很多植物組織中游離氨基酸含量，尤其是Pro的含量在鹽脅迫下會顯著增加[50]。對各株系葉片材料中氨基酸的含量測定結果顯示，鹽處理后，各株系中Gly、Ile、Pro、Ser和Tyr的含量均顯著增加，其中轉基因植株各株系中Pro的含量相比于野生型分別增加了7.1、10.3倍和6.3倍，差異顯著。大部分GH3家族成員具有不止一種生長素氨基酸合成酶，能通過激活水楊酸、茉莉酸和乙烯信號途徑從而提高植物對逆境脅迫的抗性[19]。Khan等[51]發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體AtGH3.9可能通過氨基酸來控制生長素的活性，在IAA和JA之間的信號通路發(fā)揮作用。有研究表明GH3.5蛋白可以催化水楊酸與天冬氨酸的結合[52]，因此本試驗中將MdGH3-2/12干擾后，蘋果植株耐鹽性下降，可能是因為鹽脅迫下轉基因植株各株系內氨基酸的數(shù)量分布發(fā)生了改變，進而改變了植株體內激素的含量及分布，影響了激素信號通路的激活，因此轉基因植株各株系較野生型受到更大程度的脅迫。

植物細胞對鹽離子的毒害作用高度敏感，Na+進入細胞后，會引起植物的細胞膜功能改變，相關代謝酶活性降低，滲透性增加導致滲透脅迫、K+外流，還會造成氧化脅迫、離子毒害等[53]。在正常情況下， Na+和K+在膜內外進行交換，K+在植物體內具有滲透調節(jié)作用，兩者存在拮抗關系。當胞內Na+過多就會導致Na+、K+競爭K+的結合位點[54]，抑制植物對K+的吸收，造成Na+毒害[55]。在受到鹽脅迫時，耐鹽植物對K+的吸收量會增加，從而減少對Na+的吸收，降低Na+/K+比值，提高植物對鹽脅迫的耐受性[56]。因此調節(jié)其Na+/K+比值的穩(wěn)態(tài)對植物耐鹽性非常重要。本研究在對各株系的根、莖、葉中Na+和K+的含量進行測定以后發(fā)現(xiàn)，鹽處理后植株中Na+都大量積累，而根和葉中的K+的含量都顯著降低，且轉基因植株各株系葉片中的K+含量顯著低于野生型，各株系根中的Na+/K+比值分別為0.497、0.558、0.525和0.577。鹽處理后，轉基因植株各株系中的Na+/K+比值都顯著高于野生型，導致植株對鹽的耐受性下降。對根系中離子轉運關鍵基因的定量表達分析發(fā)現(xiàn)，MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1的表達量都顯著上調，其中MdSOS1分別上調3.97、2.31、1.91倍和2.81倍；MdSOS2分別上調2.37、1.44、1.26倍和2.34倍；MdSOS3分別上調1.74、1.56、2.21倍和1.68倍；MdNHX1分別上調1.59、1.74、1.45倍和1.40倍，而植株中MdAKT2-3基因的表達量分別下調61.7%、44.4%、46.8%和35.9%，各個基因在轉基因植株株系中的表達量顯著低于野生型，這可能也導致MdGH3-2/12干擾植株在面對鹽脅迫時，體內的Na+不能及時外排，K+不能及時內流，加劇了Na+積累，Na+/K+比值升高，干擾植株的耐鹽性降低。

4 結 論

本研究探討了蘋果生長素響應基因MdGH3-2/12在鹽脅迫下的功能，研究發(fā)現(xiàn)：

1)相比于WT植株，干擾MdGH3-2/12轉基因蘋果植株在鹽脅迫下的生長以及生物量都顯著降低，干擾植株葉片的Pn、Gs和Ci值和最大光化學效率(Fv/Fm)也都顯著下降；植株氣孔開度縮?。畸}脅迫下干擾植株光合系統(tǒng)受損更嚴重，導致其光合能力顯著低于WT植株。

2)干擾植株較WT植株對鹽脅迫更敏感，表現(xiàn)為ROS積累更多，而抗氧化酶活性顯著低于WT，因此干擾植株在鹽脅迫下不能有效清除活性氧而造成更大傷害。

3)鹽處理后干擾植株各株系內Pro含量較WT植株顯著增加；根中的Na+/K+比值也顯著高于WT植株，而鹽通路相關離子轉運基因的表達量顯著低于WT植株，導致Na+不能高效外排，植株受到Na+毒害；干擾株系根系活力也顯著低于WT，可能導致植株對周圍環(huán)境離子吸收能力下降，加劇了離子毒害。

以上研究結果表明，MdGH3-2/12基因在蘋果植株的抗鹽性方面發(fā)揮著重要作用，將MdGH3-2/12基因干擾后蘋果植株對鹽脅迫的耐受性下降。