板栗果皮色素的成分鑒定及提取

劉義慶，謝 榮，胡思前，2*

（1.江漢大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430056；2.湖北省健康代糖產(chǎn)品企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北武漢 430056）

板栗是殼斗科栗屬植物，分布于世界各地。板栗營養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素和微量元素，特別是維生素C（VC）、維生素B1（VB1）和胡蘿卜素的含量比一般干果要高[1]。板栗果實(shí)有較高的醫(yī)療保健價(jià)值，中醫(yī)認(rèn)為，板栗有養(yǎng)胃、健脾、補(bǔ)腎、壯腰、強(qiáng)筋、活血、止血、散瘀、消腫等功效，特別是對老年人有很好的滋補(bǔ)效能。板栗對高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等也具有較好的防治作用，故有“干果之王”的美譽(yù)，在國外被稱為“人參果”[2-3]。我國是世界板栗第一生產(chǎn)大國，板栗產(chǎn)量居世界第一。2019 年世界板栗產(chǎn)量2.40×106t，我國板栗總產(chǎn)量2.20×106t，約占世界板栗產(chǎn)量的90%[4]。湖北羅田板栗為湖北優(yōu)質(zhì)板栗品種，栗殼、板栗果皮為板栗副產(chǎn)品，多廢棄不用。近年來對板栗殼的綜合利用已引起人們的關(guān)注，板栗殼提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗腫瘤等生理活性，還可應(yīng)用在凈化水質(zhì)、食用菌生產(chǎn)、食品生產(chǎn)、印染工業(yè)等方面[5-8]。

國內(nèi)學(xué)者對板栗果皮的成分與綜合利用進(jìn)行了探索，如劉治梅[9]、張捷莉等[10]分別以碳酸鈉溶液和50%乙醇為溶劑提取板栗果皮棕色素，初步試驗(yàn)了棕色素的性質(zhì)。臧延青等[11]、陳龍等[12]分別以河南信陽和山東沂蒙板栗果皮為原料，以乙醇與水混合為提取溶劑，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了板栗果皮色素的提取工藝。盧川等[13]發(fā)現(xiàn)板栗果皮乙醇提取物含有黃酮類、多酚類、甾類、脂肪酸等化學(xué)成分。綦菁華等[14]發(fā)現(xiàn)板栗果皮中酚類組分具有抗氧化活性。夏姣云等[15]則將板栗果皮應(yīng)用于對水溶液中鎘離子和鉛離子的吸附。目前還沒有以丙酮與水混合作為提取劑提取板栗果皮中有效成分的報(bào)道。

鑒于此，本文以湖北羅田板栗作為原料，對板栗果皮的提取溶劑進(jìn)行了系統(tǒng)研究，應(yīng)用化學(xué)分析的方法確定了提取物的主要化學(xué)成分，并采用正交試驗(yàn)法對板栗果皮中縮合鞣質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)利用板栗果皮奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮板栗，購自湖北羅田，去殼、剝皮并將板栗果皮粉碎，置于5 ℃冰箱中冷藏備用。

丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、溴、明膠、氯化高鐵、生物堿、鎢酸鈉、磷鉬酸、無水碳酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.5%，CAS：149-91-7），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

福林酚試劑的配制：鎢酸鈉50 g，磷鉬酸10 g 溶于含375 mL 水的燒瓶中，再加入25 mL、85%磷酸，水浴回流2 h，冷卻后在500 mL 容量瓶中定容并保存。

1.2 儀器與設(shè)備

721 分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；85-1恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；ST-02A 多功能粉碎機(jī)，永鑫市帥通工具有限公司；RE-S2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 板栗果皮中色素提取及其化學(xué)成分的鑒定

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 板栗果皮粉末于帶塞錐形瓶中，加入20 mL、50%丙酮-水溶液，密封，浸提3 h。過濾，減壓蒸餾濃縮，得板栗色素提取液。

取適量提取液，加入等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取。各取四份乙酸乙酯萃取液和經(jīng)過乙酸乙酯萃取后的水相部分溶液，分別做三氯化鐵顯色反應(yīng)、溴水反應(yīng)、明膠氯化鈉反應(yīng)和生物堿反應(yīng)試驗(yàn)，以確定色素的物質(zhì)類別。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用福林酚法：取0.500 0 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于5 mL 乙醇，用水定容至100 mL。分別準(zhǔn)確移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 上述溶液于10 mL 比色管中，蒸餾水定容，制成沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL 加入10 mL 比色管中，再加入6 mL 蒸餾水進(jìn)行混合后，再加入0.5 mL 的福林酚試劑，混勻后靜置5 min 后，加入1.5 mL、20%Na2CO3溶液，混合后定容至10 mL，20 ℃避光放置2 h 后，用蒸餾水作空白對照，在760 nm 下測定其吸光值A(chǔ)。以沒食子酸的濃度為X 軸，吸光值為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.3.3 板栗皮縮合鞣質(zhì)的提取率

（1）板栗果皮中縮合鞣質(zhì)的總量測定

稱取板栗果皮粉末樣品0.500 0 g，置于25 mL 帶塞比色管中，加入15 mL 提取溶劑，靜置提取3 h，重復(fù)提取4～5 次至縮合鞣質(zhì)提取完全，合并提取液，定容至100.0 mL，取適量提取液于10 mL 比色管中，按1.3.2 方法測定10 mL 比色管中縮合鞣質(zhì)的濃度，并計(jì)算0.500 0 g 板栗果皮提取液含縮合鞣質(zhì)的總量。計(jì)算公式見式（1）。

式中，m0-縮合鞣質(zhì)總量，mg；c0-沒食子酸的濃度，mg/mL；V0-定容的體積，mL；n0-稀釋倍數(shù)。

（2）提取率的計(jì)算

按1.4 及1.5 設(shè)計(jì)的方法提取縮合鞣質(zhì)，按1.3.2 定量方法測定縮合鞣質(zhì)濃度和提取量，按公式（2）計(jì)算提取率。

式中，y-提取率；m-提取液縮合鞣質(zhì)的質(zhì)量，mg；c-提取液中的濃度，mg/mL；V-定容的體積，mL；n-稀釋倍數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn)

取25 mL 比色管，各加0.5 g 板栗果皮粉末，每組3份，加入溶劑提取板栗果皮色素，分別試驗(yàn)不同溶劑、混合溶劑的體積百分比濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對板栗果皮色素提取效率的影響。溶劑考察甲醇、乙醇、丙酮；丙酮-水混合溶劑考察的丙酮體積百分比濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%。板栗果皮色素穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，板栗果皮色素在60 ℃以下穩(wěn)定[10]，故提取溫度分別考察20、30、40、50、60 ℃。提時(shí)間分別考察15、30、45、60、75 min，料液比分別考察1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）。取2 mL 提取液于10 mL 比色管中，加入福林酚法顯色劑和碳酸鈉溶液，定容后靜置，測760 nm 下的吸光值，計(jì)算縮合鞣質(zhì)提取率，分析各因素對縮合鞣質(zhì)提取效率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

綜合考慮提取溶劑的體積百分比濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間這幾個(gè)因素對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取率的影響，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而探索板栗果皮中提取縮合鞣質(zhì)的最佳條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction orthogonal test

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗果皮色素的化學(xué)成分鑒定

試驗(yàn)了板栗果皮色素提取液的三氯化鐵顯色反應(yīng)、溴水反應(yīng)、明膠氯化鈉反應(yīng)和生物堿反應(yīng)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 板栗果皮色素的化學(xué)鑒定結(jié)果Table 2 Chemical identification results of chestnut peel pigment

表2 顯示，有機(jī)相乙酸乙酯萃取部分和水相部分均能使三氯化鐵變成灰綠色或黑色，說明板栗果皮色素提取液含有鄰二酚羥基化合物，而且能使溴水變色，能與明膠氯化鈉反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，能沉淀生物堿，因此判斷該提取物中含有縮合鞣質(zhì)。鞣質(zhì)有低縮合鞣質(zhì)和多聚縮合鞣質(zhì)之分，低縮合鞣質(zhì)存在于乙酸乙酯中，多聚縮合鞣質(zhì)存在于水中[16]。

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用福林酚法測定溶液吸光度值，得回歸方程式為y=1.141x-0.006，R2=0.999 0。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同溶劑對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取效率的影響

在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下研究了3 種提取劑對板栗果皮中縮合鞣質(zhì)提取效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲醇、乙醇、丙酮三種提取劑的提取效率分別為31.3%、35.3%、41.2%。由此可見，丙酮浸提果皮色素提取效果最好，乙醇次之，甲醇最差。因此，選擇丙酮作為提取溶劑。

2.3.2 溶劑濃度對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取效率的影響

選用不同濃度的丙酮為溶劑提取板栗果皮縮合鞣質(zhì)類色素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1（見下頁）所示。

圖1 溶劑濃度對板栗果皮鞣質(zhì)提取效率的影響Fig.1 Effect of solvent concentration on extraction efficiency of tannins

由圖1 可看出，隨著溶劑丙酮濃度的增加，縮合鞣質(zhì)的提取量先增大后減小，丙酮的最佳濃度為40%～60%。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)比較丙酮濃度為40%、50%和60%時(shí)的提取率，發(fā)現(xiàn)40%、50%丙酮的提取率接近，所以選擇40%丙酮為最佳的提取溶劑。

2.3.3 溫度對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取效果的影響

前期試驗(yàn)得出，30 ℃以下板栗果皮縮合鞣質(zhì)的提取效率不高，由圖2 知，30～40 ℃間隨溫度升高提取效率不斷增加，40～60 ℃縮合鞣質(zhì)的提取率穩(wěn)定，以40 ℃時(shí)為最好。故從提取率和節(jié)約資源兩方面考慮，40 ℃為提取板栗果皮中縮合鞣質(zhì)的最佳溫度。

圖2 溫度對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取效果的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction efficiency of tannins

2.3.4 提取時(shí)間對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取效果的影響

由圖3 可看出，在15～60 min 范圍內(nèi)，提取時(shí)間越長，縮合鞣質(zhì)提取率越高，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min 時(shí)，縮合鞣質(zhì)提取率達(dá)到最大且基本不變，因此，以60 min為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對板栗果皮鞣質(zhì)浸提效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of tannins

2.3.5 料液比對板栗果皮縮合鞣質(zhì)提取效果的影響

由圖4 可看出，隨著提取液量的增加，提取鞣質(zhì)的提取率先升高后趨于平穩(wěn)，當(dāng)料液比為1∶15 時(shí)，提取率最高，此時(shí)板栗果皮中的縮合鞣質(zhì)已經(jīng)基本提取完全，此時(shí)再增加提取液的量，縮合鞣質(zhì)提取率不會繼續(xù)增加，因此，提取板栗果皮縮合鞣質(zhì)的最佳料液比為1∶15。

圖4 料液比對板栗果皮鞣質(zhì)浸提效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of tannins

2.4 正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)表4 可知，四因素影響大小順序?yàn)镃＞A≈D＞B，因此，提取時(shí)間對板栗縮合鞣質(zhì)提取效率的影響最大，其次是丙酮濃度和料液比，它們對縮合鞣質(zhì)提取效率的影響接近，料液比的影響稍低于丙酮濃度的，提取溫度對提取效率的影響最小，極差分析最佳組合為A1B2C2D2。即丙酮濃度為40%，料液比為1∶20，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為60 min。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，用分析天平稱取1.0 g 板栗粉末于25 mL 比色管中，分別加入20 mL 的體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮，40 ℃水浴加熱提取60 min，取適量于10 mL 比色管中，測得提取率為63.5%，均高于正交試驗(yàn)其他組。

3 結(jié)論

我國是世界板栗第一生產(chǎn)大國，湖北省是國家重要的板栗出產(chǎn)地，羅田板栗為湖北優(yōu)質(zhì)板栗品種。板栗營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有較高的醫(yī)療保健價(jià)值。板栗果皮為板栗副產(chǎn)品，多廢棄不用。本實(shí)驗(yàn)對板栗果皮成分進(jìn)行化學(xué)分析，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化板栗果皮提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)利用板栗果皮奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對提高板栗綜合利用價(jià)值具有重大意義。

以體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮為溶劑提取的板栗果皮色素經(jīng)三氯化鐵反應(yīng)、溴水反應(yīng)、明膠氯化鈉反應(yīng)、生物堿反應(yīng)等一系列定性實(shí)驗(yàn)證明為縮合鞣質(zhì)，經(jīng)乙酸乙酯萃取后，有機(jī)相為低聚縮合鞣質(zhì)，水相為多聚縮合鞣質(zhì)。經(jīng)單因素及正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮是提取板栗果皮縮合鞣質(zhì)的最佳溶劑，最佳提取工藝為提取劑丙酮的體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶20，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間為60 min，提取率可達(dá)63.5%。