四川樂(lè)山地區(qū)種鴨場(chǎng)沙門菌鑒定與耐藥性分析

尹 皚 ， 黃 毅 ， 韓和祥

(眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)系 ， 四川 眉山 620010)

沙門菌(Salmonella)可以引起雞、鴨、鵝、牛、羊、狐貍等多種動(dòng)物及人發(fā)病，臨床中以急性、慢性或隱性感染為常見(jiàn)，該菌在禽類中主要通過(guò)水平傳播和垂直傳播，致使該病在禽類養(yǎng)殖過(guò)程廣泛流行，尤其對(duì)幼禽危害較大，感染率和死亡率均較高，成為禽類養(yǎng)殖過(guò)程中重要疾病之一[1]。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，禽類是沙門菌儲(chǔ)存庫(kù)之一，該菌可以通過(guò)食品引起人食物中毒，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)每年沙門菌中毒可占細(xì)菌性食物中毒的42.6%以上，對(duì)人類危害較大[2-3]。鴨沙門菌病又叫鴨副傷寒，該病可以感染不同日齡的鴨，尤其對(duì)3周齡以內(nèi)的雛鴨最易感，臨床主要以急性和亞急性癥狀為常見(jiàn)，感染率和死亡率與幼禽的日齡密切相關(guān)[4]。相關(guān)研究表明，沙門菌具有2 600 多種的血清型，其中感染鴨的沙門菌常見(jiàn)血清型主要有鴨沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等[5]?？股厥强刂粕抽T菌感染有效的手段，在養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的超劑量濫用，導(dǎo)致沙門菌病出現(xiàn)了耐藥性增強(qiáng)和多重耐藥增高的變化趨勢(shì)，對(duì)人類的健康存在潛在危害，應(yīng)該引起重視[6]。本試驗(yàn)于2019—2020年從四川樂(lè)山地區(qū)種鴨場(chǎng)采集種鴨肛拭子、死胚、病死雛鴨等病料組織204份并進(jìn)行沙門菌分離和鑒定，檢測(cè)沙門菌的血清型和耐藥性。本試驗(yàn)為指導(dǎo)種鴨場(chǎng)沙門菌的用藥與防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 2019—2020年采集四川樂(lè)山地區(qū)種鴨場(chǎng)的種鴨肛拭子、死胚、病死雛鴨等病料組織204份。

1.1.2 主要試劑 S.S.培養(yǎng)基、沙門菌顯色培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，均購(gòu)自青島海波生物科技有限公司；沙門菌生化鑒定試紙條，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；臨床中常用的獸用藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；沙門菌屬診斷血清，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；DL1 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。常規(guī)儀器與試劑由本單位實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 對(duì)疑似感染的沙門菌病料經(jīng)過(guò)處理后，接種于S.S.培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取S.S.培養(yǎng)基單個(gè)菌落接種于沙門菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

1.2.2 細(xì)菌生化鑒定 按照說(shuō)明書(shū)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行生化特性檢測(cè)與鑒定。

1.2.3 細(xì)菌PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[7]，根據(jù)GenBank中發(fā)表的序列，針對(duì)沙門菌invA和hut基因 (AE014613.1) 設(shè)計(jì) 2 對(duì)特異性引物，設(shè)計(jì)鑒定引物invA，5′- CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′，5′- T-GCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′,目的片段大小為185 bp；hut：5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGC-3′，5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGa-3′，目的片段大小為495 bp；引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。采用細(xì)菌DNA試劑盒以提取菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中沙門菌株進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.4 血清型檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法，采用Kauffmann-White法對(duì)分離的沙門菌進(jìn)行血清型檢測(cè)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行，分析分離菌株的耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離和鑒定 疑似沙門菌分離菌株在S.S.培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、邊緣整齊、灰白色的菌落，個(gè)別的菌落產(chǎn)硫化氫，呈中間黑心菌落；沙門菌顯色培養(yǎng)基上長(zhǎng)出邊緣整齊、大小一致的紫色菌落。染色鏡檢進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，分離菌株為兩端鈍圓、無(wú)莢膜的陰性短桿菌。分離的75株疑似沙門菌的菌株生化鑒定均為沙門菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定 對(duì)分離的菌株用引物invA和hut進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，分離的75株菌株均擴(kuò)增出大約為185 bp 和495 bp的目的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，分離的75株菌株均鑒定為沙門菌。

圖1 75株分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR results of 75 isolated strainsM:DL1 000 marker； 1～15：分離菌株； 16：空白對(duì)照M:DL1 000 marker; 1-15: Isolated strain; 16:Blank control

2.3 血清型檢測(cè) 用Kauffmann-White法對(duì)分離的種鴨源沙門菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，分離的75株沙門菌分別屬于12種血清型，其中禽傷寒沙門菌(25.3%)、鴨沙門菌(20.0%)、腸炎沙門菌(17.3%)3種血清型為該地區(qū)的流行優(yōu)勢(shì)血清型(表1)。

表1 75株沙門菌分離株的血清型檢測(cè)結(jié)果Table 1 Serotype results of 75 Salmonella isolates

2.4 藥敏試驗(yàn)與多重耐藥性分析 由表2可知，分離的75株沙門菌耐藥性嚴(yán)重，對(duì)阿莫西林、氨芐西林等9種藥 物耐藥率較高，耐藥率介于77.3%～98.7%；對(duì)多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨曲南等5種藥物的耐藥率介于45.3%～64.0%；對(duì)頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星、林可霉素4種藥物的耐藥率較低，介于13.3%～22.7%。

表2 75株沙門菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity results of 75 Salmonella isolates

由表3可知，臨床中分離的75株沙門菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐 17 種藥物有 1 株、耐 16、7 種藥物各 3 株、耐 15、9、6種藥物各 4 株、耐 14、8 種藥物各有 6 株、耐13種藥物有 5株，耐 12、11、10 種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的 16.0%、18.7%和17.3%。

表3 75株沙門菌多重耐藥性檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection of multidrug resistance of 75 Salmonella strains

3 討論

沙門菌是臨床中重要的人獸共患病原菌，該菌血清型眾多，我國(guó)共報(bào)道約290種血清型，對(duì)動(dòng)物和人類的危害比較大，雞和鴨是主要食源性動(dòng)物，是人類感染沙門菌主要的來(lái)源之一，沙門菌病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康，應(yīng)引起重視[9-10]。近年來(lái)，關(guān)于沙門菌感染的報(bào)道逐漸增多，嚴(yán)重影響我國(guó)禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。任士飛等[7]報(bào)道從徐州及周邊地區(qū)分離得到49 株鴨源沙門菌，以印第安納沙門菌、阿貢納沙門菌和鴨沙門菌為主要流行優(yōu)勢(shì)血清型。張林吉[2]報(bào)道了在徐州地區(qū)分離的26株鴨源沙門菌以腸炎沙門菌為主。許明等[11]研究表明，從江蘇地區(qū)分離的 33 株沙門菌以查理沙門菌血清型為主。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2019—2020年從四川樂(lè)山地區(qū)種鴨場(chǎng)采集種鴨肛拭子、死胚、病死雛鴨等病料組織204份，分離得到75株沙門菌，分離的沙門菌屬于12種血清型，以禽傷寒沙門菌、鴨沙門菌、腸炎沙門菌為流行優(yōu)勢(shì)血清型。本試驗(yàn)與上述報(bào)道的鴨源血清型存在一定差異性，可能與地區(qū)有關(guān)，不同地區(qū)流行的血清型也不一樣。鴨場(chǎng)沙門菌廣泛流行與傳播方式有關(guān)，該菌既能水平傳播，又能垂直傳播，種鴨通過(guò)卵傳播給下一代，導(dǎo)致該菌在養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛發(fā)生與流行[12]。因此，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該注重該病的防控與凈化，減少該病發(fā)生。

近年來(lái)，養(yǎng)殖場(chǎng)中由于抗菌藥物不合理使用，導(dǎo)致沙門菌耐藥菌株逐漸增多，出現(xiàn)多重耐藥菌株，給該病的防控帶來(lái)了一定難度，且沙門菌耐藥性可以通過(guò)食物在人和動(dòng)物中傳播，給人類的健康造成潛在的威脅[12]。本試驗(yàn)表明，分離的75株沙門菌對(duì)臨床常用抗生素耐藥性較嚴(yán)重，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素等13種藥物耐藥率在45.3%以上，出現(xiàn)多重耐藥性，其中耐 12、11、10 種藥物分離菌株最多。說(shuō)明從四川樂(lè)山地區(qū)種鴨場(chǎng)分離的沙門菌耐藥性較強(qiáng)，呈現(xiàn)多重耐藥性。與張林吉等[4]、任士飛等[7]、常江等[13]報(bào)道的存在一定的差異性，可能與地區(qū)、藥物使用情況有關(guān)。因此，在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中應(yīng)該注重抗生素的合理使用。本試驗(yàn)為四川樂(lè)山地區(qū)種鴨場(chǎng)沙門菌防控提供參考依據(jù)。