枸杞西洋參復(fù)合物提高小鼠免疫力效果的研究

張艷珍，王 菲，單 斌，王 亮，曹文秀

(1.青海省輕工業(yè)研究所，青海 西寧 810001；2.青海省保健食品行業(yè)協(xié)會(huì)，青海 西寧 810001)

西洋參，又稱花旗參，在我國種植面積廣泛。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，具有能滋陰補(bǔ)氣、清熱生津等功效[1]。西洋參中含有人參皂苷、多糖、甾醇、氨基酸、蛋白質(zhì)等多種活性物質(zhì)[2]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，西洋參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及對(duì)抗癌癥都具有積極的影響[3-4]。枸杞是我國名貴藥材，味甘、性平，有滋肝補(bǔ)腎、益精明目等功效[5-6]。研究表明，枸杞的主要活性物質(zhì)有枸杞多糖、多酚及類胡蘿卜素類等，具有降糖、降脂、增強(qiáng)免疫力的功效[7]。絞股藍(lán)作為傳統(tǒng)中藥在我國有悠久的藥用歷史，是一種藥食同源的植物，有“第二人參”之稱[8]。據(jù)《本草綱目》記載，絞股藍(lán)具有常用于治瘡癤、蟲咬，也具有涼血解毒、利小便等藥效。絞股藍(lán)含有皂苷、多糖、黃酮類等有效成分[9]，具有很好的藥理活性包括神經(jīng)保護(hù)、 抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、血脂調(diào)節(jié)等[10]。中醫(yī)理論觀點(diǎn)表明，機(jī)體免疫力低下是機(jī)體正氣不足導(dǎo)致的身體各方面機(jī)能減退，難以抵御外邪的一系列正虛癥狀，主要治法為扶助正氣、固本培元[11]。本研究依照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中有關(guān)增強(qiáng)免疫力功能的檢測方法，研究枸杞西洋參復(fù)合物增強(qiáng)免疫力的效果。

1 材料與方法

1.1 受試材料

本研究所用的材料為枸杞西洋參復(fù)合物，由陜西佰草源生物科技有限公司提供，本品由西洋參、枸杞及絞股藍(lán)等為原料制成，人體推薦量5.0g/d，折合枸杞生藥4.2g/d，西洋參生藥1.6g/d，絞股藍(lán)生藥6.0g/d。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

由北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供SPF級(jí)雄性昆明種小鼠200只，體重18-22g。200只雌性小鼠(共五組分8項(xiàng)試驗(yàn))，每組用40只小鼠并隨機(jī)分為4小組，每小組10只小鼠。一組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH);二組為小鼠測定和淋巴器官/體重比值測定和碳廓清試驗(yàn)；三組為ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測定；四組為抗體生成細(xì)胞檢測和血清溶血素測定；五組為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。設(shè)計(jì)0.417g/kg.BW、0.833g/kg.BW、1.667g/kg.BW枸杞西洋參復(fù)合物低、中、高三個(gè)劑量組，其劑量分別相當(dāng)于人體推薦量的20倍、10倍、5倍，另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組(蒸餾水)。各組動(dòng)物按照劑量每天灌胃樣品一次，灌胃容量均為20ml/kg.BW，陰性對(duì)照組灌等量蒸餾水，連續(xù)灌胃30d后開始試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)

小鼠經(jīng)口灌服枸杞西洋參復(fù)合物和蒸餾水30d 后，頸椎脫臼處死。無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸浮于2.0ml的完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(95%)以上，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。按照程序中MTT法進(jìn)行淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)，最后在Thermo酶標(biāo)儀570nm測定OD值，計(jì)算ConA+與ConA-各孔的光密度差值，各劑量組結(jié)果與溶劑對(duì)照組比較進(jìn)行方差分析。

1.3.2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)測定

樣品小鼠在第26d時(shí)腹腔注射，注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/只)進(jìn)行致敏，于免疫后第四天每鼠左右足跖部皮下注射20%(v/v)SRBC(20μl/只)進(jìn)行攻擊。并與攻擊前和攻擊后24h分別測量每鼠足跖同一部位厚度，同一部位測三次，取平均值。計(jì)算攻擊前、后足跖厚度差值，各劑量組結(jié)果與陰性對(duì)照組比較進(jìn)行方差分析。

1.3.3 血清溶血素的測定

樣品小鼠在第26d時(shí)腹腔注射，注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/只)，于免疫后4-5d摘眼球采血，分離血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝板內(nèi)，每孔100μl，再加入100μl 0.5%(v/v)SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h進(jìn)行血清溶血素測定。統(tǒng)計(jì)血球凝集度，計(jì)算相應(yīng)抗體積數(shù)。

1.3.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)

各組小鼠均腹腔注射20%(v/v)雞紅細(xì)胞懸液1ml/只，間隔30min，頸椎脫臼處死小鼠，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml/只，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min后吸出腹腔洗液1ml平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，37℃溫育30min。孵畢，再用生理鹽水漂洗、晾干。以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4% Giemsa-磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。鏡檢，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)按照以下公式求出吞噬率、吞噬指數(shù)。

1.3.5 小鼠碳廓清試驗(yàn)

小鼠末次給藥結(jié)束后1h，給各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁(生理鹽水4.0倍稀釋)10ml/kg.BW，于注射墨汁后2min及10min分別準(zhǔn)時(shí)內(nèi)眥靜脈叢采血各20μl，并迅速加入到2ml 0.1%碳酸鈉溶液中并搖勻。以碳酸鈉溶液作為空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)600nm波長處測光密度值(OD)。將小鼠處死后取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表明血污，分別稱重。按照以下公式計(jì)算吞噬指數(shù)(a)，受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組，可判定結(jié)果陽性。

K為未經(jīng)校正吞噬指數(shù)，OD1為t1時(shí)(2min)血標(biāo)本光度度值，OD2為t2時(shí)(10min)血標(biāo)本光密度值。

1.3.6抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法)

樣品小鼠在第26d時(shí)腹腔注射，注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/只)，將SRBC免疫5d后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛裝有Hank’s液的小平皿中，輕輕磨碎脾臟，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，離心10min(1000r/min)，用Hank’s液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮在5ml RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)到細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml。

空斑的測定：將表層培養(yǎng)基(1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml)加熱溶解后，放入45-50℃水浴保溫，與等量pH 7.2-7.4、2倍濃度的Hank’s液混合后進(jìn)行分裝，每管0.5ml，再向管內(nèi)加50μl 10%(v/v)SRBC(用SA緩沖液配制)，20μl脾細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后用SA緩沖液稀釋補(bǔ)體(1∶8)加入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)育溫1.5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。各劑量組結(jié)果與陰性對(duì)照組比較進(jìn)行方差分析。

1.3.7 NK細(xì)胞活性測定

試驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml。

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。過200目篩網(wǎng)，用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5ml滅菌水20s，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5ml 2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，離心10min(1000r/min)，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)該在95%以上)，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml。

分別取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各10μl，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中：靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1% NP40各10μl；上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)平行孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以(1500r/min)離心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μl，反應(yīng)8min，每孔加入1mol/L的HCL 30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測定光密度值(OD)。按照下式計(jì)算NK細(xì)胞活性，各劑量組結(jié)果顯著高于陰性對(duì)照組判定結(jié)果陽性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠體重的影響

本試驗(yàn)中不同劑量枸杞西洋參復(fù)合物在ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)、血清溶血素的測定、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、小鼠碳廓清試驗(yàn)、抗體生成細(xì)胞檢測及NK細(xì)胞活性測定的五組實(shí)驗(yàn)中，各劑量組小鼠各期體重?zé)o明顯變化，且與陰性對(duì)照組比較，無顯著差異。見表1-5。由此可見，劑量對(duì)小鼠體重的作用效果較小。

表1 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)試驗(yàn)一組小鼠體重的影響(x±s)

表2 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)試驗(yàn)二組小鼠體重的影響(x±s)

表3 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)試驗(yàn)三組小鼠體重的影響(x±s)

表4 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)試驗(yàn)四組小鼠體重的影響(x±s)

表5 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)試驗(yàn)五組小鼠體重的影響(x±s)

2.2 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠淋巴器官/體重比值的影響

由表6中試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無明顯影響，且與陰性對(duì)照組比較，無顯著差異(P>0.05)，由此可見，不同劑量的枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠淋巴器官和體重的影響整體相對(duì)較小。

表6 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠淋巴器官/體重比值的影響(x±s)

2.3 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

由表7中試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，與陰性對(duì)照組比較，處理組隨著枸杞西洋參復(fù)合物劑量的增加，能夠顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，說明枸杞西洋參復(fù)合物劑量越高，越能加強(qiáng)淋巴細(xì)胞增值。另外，足跖厚度差值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，各劑量組小鼠組足跖厚度差值明顯增大，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，說明枸杞西洋參復(fù)合物的劑量對(duì)小鼠的足趾厚度影響較大。

表7 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響(x±s)

2.4 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

由表8中的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復(fù)合物劑量的升高，小鼠體內(nèi)血清溶血素(抗體積數(shù))逐漸增加，且顯著高于陰性對(duì)照組，說明枸杞西洋參復(fù)合物劑量的增加能夠有效提升小鼠的血清溶血素水平，其中高劑量組的效果最佳?？梢圆聹y，隨著劑量的再次增加，其抗體積數(shù)可能還會(huì)增加，但是同樣也可能帶來一定的副作用。

表8 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響(x±s)

2.5 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

由表9中試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復(fù)合物劑量的增加，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率逐漸增大，且與陰性對(duì)照組比較，高劑量組吞噬率、吞噬指數(shù)顯著升高，差異顯著(P<0.05)，說明枸杞西洋參復(fù)合物劑量的增加是對(duì)小鼠腹腔的巨噬細(xì)胞吞噬能力有積極的影響效果。

2.6 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠碳廓清功能的影響

由表10中試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參劑量的增加，小鼠碳廓清功能作用逐漸顯著試驗(yàn)小鼠的吞噬指數(shù)a逐漸增加，其中與陰性對(duì)照組比較，高、中劑量組能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)，差異顯著(P<0.05)，說明枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠的碳廓清功能這一方面具有明顯的增強(qiáng)作用，可以有效提升吞噬指數(shù)a。

表10 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠碳廓清功能的影響(x±s)

2.7 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞功能的影響

由表11中的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復(fù)合物劑量的增加，小鼠抗體生成細(xì)胞功能作用不斷提升，其中，低、中、高劑量的枸杞西洋參復(fù)合物處理組與陰性對(duì)照組的溶血空斑數(shù)相比，差異不顯著。但枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠的小鼠抗體生成細(xì)胞功能這一方面具有一定的作用。

表11 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞功能的影響(x±s)

2.8 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

由表12中的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復(fù)合物劑量的增加，小鼠NK細(xì)胞活性顯著升高，與陰性對(duì)照組比較，高、中劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均顯著升高，與陰性對(duì)照相比，差異極顯著(P<0.01)。說明枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性具有一定的促進(jìn)作用。

表12 各劑量組枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響(x±s)

3 結(jié)論

免疫指的是機(jī)體識(shí)別、清除外來物質(zhì)，并將其排出體外的一種生理學(xué)功能，分為特異性免疫與非特異性免疫，免疫與機(jī)體的亞健康狀態(tài)有密切的關(guān)系[12]。研究數(shù)據(jù)表明，西洋參、枸杞及絞股藍(lán)均具有增強(qiáng)免疫力的功效。為驗(yàn)證枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)機(jī)體是否具有免疫調(diào)節(jié)功能，本研究按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中有關(guān)增強(qiáng)免疫力功能的檢測方法，研究了枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)小鼠免疫功能的影響。

試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較，各劑量組對(duì)小鼠各期體重、小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無明顯影響，各劑量組小鼠抗體積數(shù)及溶血空斑數(shù)均高于對(duì)對(duì)照組，但差異無顯著性(P>0.05)。與陰性對(duì)照組比較，高劑量組能夠顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，差異顯著(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較，高劑量組吞噬率、吞噬指數(shù)顯著升高，差異顯著(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較，各劑量組小鼠組足跖厚度差值顯著增高，差異顯著(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較，高、中劑量組能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)及NK細(xì)胞活性，差異顯著(P<0.05)。

根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》中增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，枸杞西洋參復(fù)合物對(duì)細(xì)胞膜免疫功能測定以及機(jī)體免疫功能測定結(jié)果均為陽性，認(rèn)為該產(chǎn)品具有增強(qiáng)免疫力的作用。本研究可為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)及廣泛應(yīng)用提供有力的佐證，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用及資源開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。