藥用植物中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的研究現(xiàn)狀與展望

張貴翔，吳連花，吳友根*，楊東梅，于 靖，張軍鋒

（1 海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南?？?570228；2 湖南省衡陽市中心醫(yī)院）

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMGCR）存在于所有的真核及原核生物中，在植物中，HMGCR 都是由1 個(gè)多基因家族編碼的，組成每個(gè)多基因家族的基因數(shù)量在不同的植物中是不同的[1]。自20 世紀(jì)90 年代起，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)特定物種中HMGCR的mRNA 表達(dá)模式不同，表明了編碼的酶可能參與了類異戊二烯的生物合成，且這些酶的功能多樣性可能與亞細(xì)胞位置的差異有關(guān)[2]。隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)HMGCR 是與許多藥用植物活性成分合成相關(guān)的MVA 途徑（甲羥戊酸途徑）中的第1 個(gè)關(guān)鍵酶，其可以催化 3-羥基 -3-甲基戊二酸單酰輔酶 A（HIMG-CoA）生成甲羥戊酸（MVA），該反應(yīng)是不可逆過程，是萜類物質(zhì)合成的第一個(gè)限速步驟和重要調(diào)控點(diǎn)[3]。有學(xué)者通過研究真菌誘導(dǎo)煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，以此方式生物合成倍半萜類物質(zhì)，結(jié)果表明，如果很快增加HMGCR 的活性，則倍半萜環(huán)化酶活性增強(qiáng)，與此同時(shí)相應(yīng)的活性物質(zhì)產(chǎn)量也會增加，這表明了萜類物質(zhì)代謝合成途徑與HMGCR 調(diào)控密切相關(guān)[4]。

HMGCR 是限速酶，在催化HMG-CoA 合成甲羥成酸的過程中，需要NADP 的協(xié)助，同時(shí)也能夠受洛伐他汀抑制劑的特異性抑制，是MVA 生物合成途徑中最重要的步驟[5]。研究表明，HMGCR 基因家族在植物和其他生物中有非常高的保守性，因此該家族是作為開發(fā)萜類物質(zhì)合成代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵生物元素[6]。隨著代謝途徑中關(guān)鍵酶基因如HMGCR、MVAK、DXP、DXR 等的研究，使得萜類物質(zhì)合成的代謝工程轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實(shí)產(chǎn)業(yè)成為了可能。HMGCR 作為植物體內(nèi)重要代謝物質(zhì)通路上的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，已成為越來越多的學(xué)者研究植物代謝的關(guān)鍵酶之一[7]。研究藥用植物中HMGCR，可為進(jìn)一步開發(fā)利用藥用植物的商業(yè)價(jià)值，開拓更廣闊的市場提供借鑒。

1 HMG-CoA 還原酶的催化機(jī)制

1.1 HMG-CoA 還原酶的結(jié)構(gòu)特征

研究表明，植物HMGCR 亞型都具有相似的結(jié)構(gòu)組織，表明了共同的進(jìn)化起源，該蛋白的一級結(jié)構(gòu)中界定了4 個(gè)區(qū)域：N 末端（N-terminal region）、連接區(qū)（linker region）、跨膜區(qū)（membrane domain）以及C 末端催化域（catalytic domain）[8]?？缒^(qū)及C 末端在植物的HMGCR 中具有高度保守性，而N 端和連接區(qū)在長度和氨基酸序列上都有顯著的差異性。植物HMGCR 序列的5'端主要編碼形成N 末端區(qū)域，而3'則形成大約由400 個(gè)氨基酸殘基組成且具有高度保守性的C 末端催化域，除此之外，植物的HMGCR 結(jié)構(gòu)還包括一部分開放閱讀框區(qū)域（ORF），用于翻譯編碼蛋白[9]。并且，HMGCR 的蛋白質(zhì)序列具有4 個(gè)高度保守的基序，它們存在于所有植物的HMGCR 催化區(qū)域中，即2 個(gè)HMG-CoA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列 EMPIGYVQIP 和TTEGCLVA 以及2 個(gè)NADP（H）結(jié)合結(jié)構(gòu)域DAMGMNM 和GTVGGGT，這也反映了功能域在分子進(jìn)化中具有很高的穩(wěn)定性[10]。

1.2 HMG-CoA 還原酶的催化反應(yīng)

HMGCR 在細(xì)胞液中進(jìn)行催化反應(yīng)，HMG-CoA 通過利用兩分子的NADPH 并經(jīng)過2 個(gè)連續(xù)的氫化物的轉(zhuǎn)移還原裂解為甲羥戊酸。整個(gè)催化反應(yīng)分為3 個(gè)步驟，第1 次通過一分子的NADPH 還原形成mevaldyl-CoA 半縮硫醛中間體，該中間體隨后分解為高分子聚乙醛和CoAS-，然后被質(zhì)子化，第2 個(gè)NADPH 隨后替代NADP+將聚乙醛還原為甲羥戊酸[11]。因HMGCR 復(fù)雜的催化機(jī)制，其過程具體受哪些物質(zhì)的調(diào)控還有待進(jìn)一步的研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯可以使HMGCR 基因表達(dá)量提高，從而增加相關(guān)次生代謝物質(zhì)的合成。適量濃度的茉莉酸甲酯能夠明顯增加紫杉細(xì)胞懸浮液內(nèi)紫杉醇的含量[12]；茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的露水草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中20-羥基蛻皮酮是空白組含量的8 倍[13]。此外，水楊酸、Ag+等都可以影響HMGCR 基因的轉(zhuǎn)錄水平[14]。以此類物質(zhì)為基礎(chǔ)，結(jié)合植物類異戊二烯代謝途徑的生物特性，可為進(jìn)一步研究HMGCR 的催化機(jī)制提供基礎(chǔ)。

2 藥用植物中HMGCR 基因的克隆研究

在生物界中，盡管對HMGCR 基因的克隆方法可包括保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增、同源序列篩庫、功能互補(bǔ)、直接法克隆[15]，但目前絕大多數(shù)在植物HMGCR 基因克隆試驗(yàn)中均采取第1 種方法，即采用保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR 及RACE 技術(shù)來克隆目的基因全長。許巧仙[16]通過RACE 法分別對甘草HMGCR 基因5'和3'端進(jìn)行克隆，然后拼接出cDNA 全長，得到甘草HMGCR 基因，全長1842bp，預(yù)測包含一段完整的開放閱讀框（ORF）長度為1722bp，編碼574 個(gè)氨基酸，與苜蓿、煙草等植物具有高度同源性，并且具有HMGCR 基因典型的底物結(jié)合位點(diǎn)；Liu 等[17]在三七的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)注釋到HMGCR 的轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)ORF 設(shè)計(jì)引物克隆基因得到三七的HMGCR 基因全長1690bp，編碼563 個(gè)氨基酸，存在2 個(gè)跨膜區(qū)分別分布在35-37 和78-100 的氨基酸內(nèi)；郭思遠(yuǎn)等[18]克隆到雷公藤HMGCR 基因編碼區(qū)的全長序列，共1770bp，編碼589 個(gè)氨基酸，根據(jù)生物信息預(yù)測發(fā)現(xiàn)其被定位在葉綠體，有跨膜域，并含有4 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，與不同物種進(jìn)行同源比對發(fā)現(xiàn)相似度較高，表明具有較強(qiáng)的保守性。除此之外，還有諸如青蒿[19]、牛樟芝[20]、茅蒼術(shù)[21]、陽春砂[22]等很多藥用植物的HMGCR 基因被克隆出來，通過利用生物信息學(xué)分析、功能驗(yàn)證等手段進(jìn)一步開拓了這些植物的利用價(jià)值。

3 藥用植物中HMGCR 調(diào)控及基因組織特異性研究

3.1 HMGCR 在生物合成途徑中的調(diào)控

MVA 途徑是一種在高等真核生物中都可以發(fā)現(xiàn)存在的途徑，甚至在許多病毒體內(nèi)也存在著此途徑，雖然某些植物、原生生物頂復(fù)門的生物及大多數(shù)微生物（如結(jié)核桿菌和某些病毒）可以通過另一種途徑合成IPP 和DMAPP，但甲羥戊酸途徑的代謝產(chǎn)物作為類萜等的生物合成過程中的前體，是植物體內(nèi)的生產(chǎn)代謝中重要的單位[23]。植物中甲羥戊酸途徑是一個(gè)不可逆的過程，而HMGCR 作為這條甲羥戊酸代謝途徑上的第一個(gè)限速酶，被認(rèn)為是影響此途徑代謝水平的關(guān)鍵酶，具有調(diào)控作用，許多萜類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成都與HMGCR 有關(guān)[24]。盡管HMGCR 的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，但都包括2 個(gè)主要的方面，即反饋抑制調(diào)控和交叉調(diào)控，分別受甲羥戊酸途徑和不同的生化途徑作用影響酶的活性。迄今為止，HMGCR 的活性在植物中調(diào)控作用的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，HMGCR 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平可被許多誘導(dǎo)因子所影響。除了上述提及的影響因子之外，一些物理因素如光、機(jī)械傷害，生物因素如病菌感染，化學(xué)因素Ca2+等都可以從轉(zhuǎn)錄水平有效調(diào)控HMGCR 的活性及表達(dá)[25]。

3.2 藥用植物中HMGCR 組織特異性研究

隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在植物中的應(yīng)用，其靈敏、簡便、特異性高等特點(diǎn)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR反應(yīng)，使對特定區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物的定量和定性成為現(xiàn)實(shí)[26]。對基因在不同部位的表達(dá)量研究可以對藥用植物中有關(guān)的活性物質(zhì)的分布有更表觀的認(rèn)識，為藥用成分的研究、分子驗(yàn)證等提供更快捷、準(zhǔn)確的方向[27]。Wang 等[13]從露水草的芽培養(yǎng)物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，克隆并鑒定了編碼HMGCR 基因的cDNA 全長，根據(jù)qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGCR 在莖、根、葉片中較為豐富。而刁秀楠等[28]通過對大豆8 個(gè)HMGCR 基因家族的成員組織特異性研究發(fā)現(xiàn)，盡管8 個(gè)基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但同一基因在不同部位以及不同基因在同一部位都顯示出差異性；孟想想等[29]測定了羅馬洋甘菊花、莖、根和葉中HMGCR 的表達(dá)量，在各個(gè)組織中均檢測到了HMGCR 基因的存在，花中相對表達(dá)量最多，莖中最少。

4 HMGCR 基因功能分析研究進(jìn)展

酶動力學(xué)研究是衡量基因功能的重要手段之一，通過酶和底物結(jié)合的能力以及對反應(yīng)催化的速率可以判斷所克隆基因編碼的酶是否具有催化活性的重要依據(jù)[30]。在植物HMGCR 酶動力學(xué)研究中，當(dāng)反應(yīng)酶和底物結(jié)合能力的Km 值越大時(shí)，表明酶與底物的結(jié)合能力越弱，其催化能力也就越小，反之越大[31]。

4.1 HMGCR 酶動力學(xué)研究

Bach 等[25]開發(fā)了一種利用Brij W-1 對從黃化蘿卜幼苗中分離的重膜組分HMGCR 進(jìn)行增溶的方法。通過硫酸銨沉淀、基于藍(lán)色葡聚糖瓊脂糖及HMG-CoA 己烷瓊脂糖的色譜分析的方法純化已被溶解的酶，然后用于研究其分子和動力學(xué)性質(zhì)。數(shù)據(jù)顯示，蘿卜中HMGCR 的Km 值為1.5μM，對應(yīng)于NADPH 的值為27μM，是迄今為止藥用植物中HMGCR 活性研究較高的結(jié)果。然而這種純化方法易出現(xiàn)去污劑可溶解的膜蛋白的異常沉淀問題，即經(jīng)硫酸銨飽和離心后發(fā)現(xiàn)其漂浮在溶液頂部。盡管可以使用大量的二硫赤蘚糖醇和只使用新配制的緩沖液可以保護(hù)酶免受氧化，但陰離子交換色譜很不利于酶表現(xiàn)活性。

4.2 HMGCR 體外重組表達(dá)

隨著對體外重組表達(dá)的研究越來越多，高效的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和簡單的純化程序被越來越多地應(yīng)用在酶蛋白的研究當(dāng)中[32]。其中，大腸桿菌作為一種代謝活躍、培養(yǎng)簡便、遺傳穩(wěn)定的原核生物，是目前科研中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一[33]，具有處理簡單、費(fèi)用低、表達(dá)高效、用途廣泛、質(zhì)粒拷貝數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)，在蛋白表達(dá)系統(tǒng)中具有良好的利用價(jià)值。

20 世紀(jì)90 年代，有學(xué)者將擬南芥中HMGCR 亞型1 的催化域在大腸桿菌中催化活性形式表達(dá)并純化，獲得了大量的純化酶，最終的比活也高達(dá)17U/mg，這比當(dāng)時(shí)從任何植物源純化的HMGCR 所報(bào)道的活力都要高[34]。梅抗抗[15]克隆了油橄欖HMGCR 基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體在大腸桿菌中成功表達(dá)，并使用TPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE 檢測，結(jié)果表明重組蛋白分子量均在66.2kDa 以上，經(jīng)分離純化后進(jìn)行酶促反應(yīng)驗(yàn)證蛋白功能。由于在HMGCR 酶促反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物甲羥戊酸容易內(nèi)酯化形成甲羥戊酸內(nèi)酯，所以一般通過甲羥戊酸內(nèi)酯的形成及含量來衡量HMGCR 體外催化活性。上述研究中由于在試驗(yàn)組反應(yīng)產(chǎn)物中檢測到了甲羥戊酸內(nèi)酯，而對照組則未見，證實(shí)了HMGCR 體外催化活性。

4.3 HMGCR 體內(nèi)表達(dá)研究

除此之外，由于HMGCR 是植物甲羥戊酸途徑中起調(diào)控作用的關(guān)鍵酶，其酶基因在植物體內(nèi)的上調(diào)對提高下游代謝物質(zhì)的含量有重要的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)轉(zhuǎn)基因研究顯示，HMGCR 基因的過表達(dá)可顯著提高酶的轉(zhuǎn)錄活性，提高類異戊二烯物質(zhì)含量[35]。

將含有在超級啟動子控制下克隆的HMGCR 基因的pBIB 質(zhì)粒載體用于橡膠胚性愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并通過Northern 印跡雜交，半定量PCR 和qRT-PCR 分析鑒定了HMGCR 基因的過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于對照植株來說，HMGCR mRNA 轉(zhuǎn)錄物的積累在轉(zhuǎn)基因植株中更豐富。而且還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物中光合色素、蛋白質(zhì)含量和HMGCR 酶活性水平也相繼增加。另外，與對照相比，在所有轉(zhuǎn)基因植物中乳膠產(chǎn)量顯著增加[36]。王家典等[37]通過Gateway 克隆技術(shù)、基因槍介導(dǎo)等方法，把HMGCR 的ORF 連接到正義表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)入雷公藤懸浮細(xì)胞以過表達(dá)雷公藤HMGCR 基因研究其對雷公藤內(nèi)酯和雷公藤紅素生物合成的影響。檢測結(jié)果顯示，目的基因的相對表達(dá)量在過表達(dá)組顯著提高，是對照組的1.75 倍，而雷公藤內(nèi)酯和雷公藤紅素含量在過表達(dá)組中提高了160%以上，證實(shí)了HMGCR 在雷公藤生物合成途徑上對萜類物質(zhì)的正向調(diào)控效果。

另外，HMGCR 基因的異源表達(dá)及共表達(dá)也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)方向之一，為研究物種間的同源性及充分利用基因在次生代謝產(chǎn)物合成生物途徑中的不同作用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。在青蒿中，過表達(dá)長春花的HMGCR基因和青蒿中的amorpha-4、11-diene 合酶（ADS）基因，并使用hptII 基因探針評估轉(zhuǎn)基因再生子形成的轉(zhuǎn)基因品系的整合和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。通過Southern 印跡和RT-PCR 證實(shí)了轉(zhuǎn)基因的整合，表明了HMGCR 和ADS 在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因品系的青蒿素含量比非轉(zhuǎn)基因植株高7.65 倍[38]。

5 結(jié)語

HMGCR 是倍半萜類化合物合成過程中最先起作用的關(guān)鍵酶，對下游的次生代謝物質(zhì)的合成具有緊密的調(diào)控作用：倍半萜類物質(zhì)的合成與HMGCR 活性成正相關(guān)。HMGCR 是一個(gè)多基因家族，其基因家族成員的差異表達(dá)，對甲羥戊酸代謝/碳流的調(diào)控起重要作用，決定了各種萜類最終產(chǎn)物的比例。而在藥用植物中，大部分活性成分都來源于此代謝途徑，由HMGCR緊密調(diào)節(jié)，運(yùn)用基因挖掘手段，結(jié)合分子功能驗(yàn)證工具來充分發(fā)揮HMGCR 的生物功能可為增加藥用植物的利用價(jià)值提供不可估量的前景。

然而盡管是同一物種的同一基因，但序列和結(jié)構(gòu)仍可能會存在差異性，品種、環(huán)境、部位差異等都可能是導(dǎo)致這些不同的因素。這為包括HMGCR 在內(nèi)的各種酶蛋白可操作調(diào)控生物代謝途徑提供了多種可能性。藥用植物在醫(yī)藥中因其栽培手段、成本因素、利用價(jià)值等在醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展過程中占有重要地位，而其資源的保護(hù)及開發(fā)利用也因此受到國家和行業(yè)研究人員的高度重視，包括植物化學(xué)分類方法的進(jìn)一步應(yīng)用在尋找和擴(kuò)大藥用植物的新資源的方面發(fā)揮了重要作用。加上現(xiàn)有的先進(jìn)育種手段、組織培養(yǎng)等，藥用植物的開發(fā)迎來前所未有的機(jī)遇。然而要從根本上提高藥用植物有效成分的含量，必須了解相關(guān)次生代謝產(chǎn)物合成的機(jī)制，相應(yīng)調(diào)控其分子途徑。對HMGCR 等酶蛋白的研究，不僅可節(jié)省植物生產(chǎn)成本，而且能開發(fā)更大的商業(yè)價(jià)值。