柿子葉有效部位的抗腫瘤活性研究[2]

劉 彬，宋明霞，李東妮，牛佳曉，鄧先清

柿子葉有效部位的抗腫瘤活性研究[2]

劉 彬1，宋明霞2, 3，李東妮2，牛佳曉2，*鄧先清2, 3

(1.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000；2. 井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009；3.井岡山大學(xué)中藥資源和功能分子研究中心，江西，吉安 343009）

以柿子葉為研究對象，采用70%乙醇回流提取柿子葉的有效成分。提取物濃縮后加水?dāng)嚢?，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種溶劑進(jìn)行梯度萃取，濃縮各相，加上乙醇粗提物共得到六種干燥浸膏。采用CCK試劑檢測法，測定六種浸膏對兩組癌細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞Hela、肺癌細(xì)胞A549和正常細(xì)胞人腎上皮細(xì)胞293的生長抑制作用。結(jié)果表明，六種浸膏均具有較強抗腫瘤活性，其中二氯甲烷層和正丁醇層對Hela細(xì)胞抑制活性最好，其IC50分別為0.24、0.26 mg/mL，A549細(xì)胞則對乙酸乙酯層更為敏感，其IC50值低至0.03 mg/mL。此外，六種浸膏對正常人腎上皮細(xì)胞293也顯示出明顯的抑制作用，尤其是乙酸乙酯層，IC50值達(dá)到0.93 mg/mL。研究證實了柿子葉具有明顯抗腫瘤活性，且其活性成分復(fù)雜，在各相中均有分布，但又對不同細(xì)胞株活性各有差異，提示在后續(xù)的活性追蹤中可以根據(jù)活性需求，選擇恰當(dāng)?shù)氖磷尤~有效部位進(jìn)行研究。

柿子葉；提取物；有效部位；抗腫瘤活性；CCK法

近年來科研工作者們對天然產(chǎn)物中抗腫瘤活性成分的研究越來越廣泛，研究表明，多種天然產(chǎn)物具有抗腫瘤的作用，其中就包括黃酮類、生物堿類、植物多糖類、木脂素類等化合物[1-2]。從天然產(chǎn)物中尋找具有抗腫瘤活性的藥物組分成為目前抗腫瘤藥物研究的重要途徑之一，但大多數(shù)天然產(chǎn)物的具體抗腫瘤作用機制還不夠明確，需要被進(jìn)一步闡明?？傊锌鼓[瘤活性成分的天然產(chǎn)物資源豐富且種類繁多，是潛在的抗腫瘤藥物，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[3]。

柿樹生長在熱帶和溫帶，其中我國柿樹產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上，總體資源豐富[4]。柿子葉中含有黃酮類、鞣質(zhì)、香豆精類化合物、多糖及有機酸等多種物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、通利血脈、清熱解毒、生津止渴作用[5-6]。目前柿子葉在保健領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，如柿子葉作為主要原料的柿子茶是我國多地民間傳統(tǒng)飲料[7]，而其在藥用治療領(lǐng)域的研究報道較少。柿葉的主要有效成分是黃酮類化合物，其中的蘆丁、槲皮素等成分具有廣泛的抗腫瘤活性[8]。因此，研究柿子葉及其提物的抗腫瘤活性，并進(jìn)行其物質(zhì)基礎(chǔ)分析，對柿子葉的綜合開發(fā)具有重要價值。

柿葉中的黃酮多以甙類形式存在，提取時多采用水、甲醇、乙醇作溶劑。吉林大學(xué)牛鳳蘭等人[9]采用水提和醇提獲得了柿子葉粗提物，然后直接用初提物對 Hela (人宮頸癌細(xì)胞) 和H22（小鼠肝癌細(xì)胞）用MTT檢測法進(jìn)行抗腫瘤活性測試，柿子葉水/乙醇初提物對這兩種細(xì)胞在0.78 mg/mL及以上濃度時顯示出明顯的的抑瘤作用。但也存在這一些不足之處：粗提物有待進(jìn)一步的分離，缺乏正常細(xì)胞對照，MTT檢測法誤差較大，未計算出IC50值數(shù)據(jù)沒有直觀的對比性；晏亦林等人[10]研究了柿葉總黃酮的最佳提取工藝，確定最佳提取工藝為70 %乙醇提取3次，溶劑用量依次為8倍、8倍和6倍，提取時間依次為2、1、1 h；而石錦芹等[11]用正交設(shè)計方法研究出乙醇提取柿葉總黃酮的最佳條件為用15倍柿葉重的50 % 乙醇水溶液，在75 ℃下浸提3 h。

本實驗以柿子葉為研究對象，采用70%乙醇回流提取柿子葉的有效成分。提取物濃縮后加水?dāng)嚢?，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種溶劑進(jìn)行梯度萃取，濃縮石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水相，加上乙醇粗提物一共得到六種干燥浸膏。采用比MTT法更為準(zhǔn)確的CCK法來評價各浸膏對兩組癌細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞Hela、肺癌細(xì)胞A549和一組正常細(xì)胞人腎上皮細(xì)胞293的生長抑制作用。通過本實驗，獲得柿子葉提取物及各極性組份的體外抗腫瘤活性數(shù)據(jù)，為柿子葉的抗腫瘤方面的藥用資源開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

SSW-420-2S型電熱恒溫水槽（上海博訊有限公司），WT30001B電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司），ZNHW型電熱套（上海羌強儀器設(shè)備有限公司），MAS-П微波提取器（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5299 (上海凌科智能科技有限公司)，DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），iMark酶標(biāo)儀（美國伯樂公司），Toppette單道可調(diào)式移液槍（大龍興創(chuàng)有限公司），多通道手動可調(diào)移液器（法國吉爾森公司），DG160C型一斤裝中藥材粉碎機（浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠），恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Binder公司），SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），KXQ-LS高壓滅菌儀（上海博訊有限公司），XSB-1A生物倒置顯微鏡（深圳星明光學(xué)儀器有限公司），KL04A臺式高性能低速離心機（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），Medium-Q去離子超純水機（上海和泰儀器有限公司）等。

1.2 試劑與材料

干柿子葉（產(chǎn)自于山西，經(jīng)井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)系梁兆昌教授鑒定），甘油（美國阿拉丁工業(yè)公司)，二甲亞砜（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純 AR），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司），Trypsin (+EDTA)（北京全式金生物技術(shù)有限公），TransDetect Cell Counting Kit (CCK) (北京全式金生物技術(shù)有限公司，6×5 mL)，DMEM/HIGH GLUCOSE( HyClone公司)，F(xiàn)etal Bovine Serum (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，Phosphate Buffered Saline (PBS) ( 北京全式金生物技術(shù)有限公司)，Hela (人宮頸癌細(xì)胞）、293（人腎上皮細(xì)胞）、A549（肺癌細(xì)胞）均由延邊大學(xué)藥學(xué)院全哲山教授課題組贈送提供。

1.3 方法

1.3.1 柿子葉初步提取物的制備

干柿子葉粉碎成80目粉末，精密稱取50 g用70% 的乙醇加熱回流連續(xù)提取3次，溶劑用量按質(zhì)量體積比依次為8倍、8倍和6倍，提取時間分別依次為2、1、1 h。將3次所得濾液合并減壓旋干，得粗提物浸膏，稱重后取200 mg備用，余下的用于下一步的梯度萃取。

1.3.2 對柿子葉初提物進(jìn)行梯度萃取

將初提物浸膏先用少量水溶解（m/v = 1 : 15），再依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種溶液按等體積比進(jìn)行梯度萃取，每種溶劑分別萃取3次。將4種萃取液包括最后水層在40 ～ 70 ℃下減壓旋干，得到相應(yīng)的五種浸膏，分別稱重并計算萃取率。

1.3.3 不同濃度待測物的配制

將待測物即初提物、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水相六種浸膏用分析天平各自精密稱取200 mg，溶解于1 mL DMSO中，如果化合物不易溶解可超聲微熱助溶，全部配置成200 mg/mL的初始濃度，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 細(xì)胞毒性實驗

采用CCK-8法測定各相浸膏的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代后，使用含體積比為 10 %的牛胎兒血清和 100 U/mL 的雙抗（青霉素-鏈霉素混合物）的 DMEM 高糖培養(yǎng)基。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用消化液胰蛋白酶（0.25 % in PBS; pH 7.4）消化 2 min，加入 DMEM 培養(yǎng)基 5 mL 終止消化, 離心，移取上層液，加入 15 mL DMEM 培養(yǎng)基，置 37°C，5% CO2孵育，每 24 h換1次培養(yǎng)基。

細(xì)胞長滿后計數(shù)，制成 1×104/mL的細(xì)胞懸液, 接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37 ℃，5% CO2孵育 24 h后，棄去原培養(yǎng)液。設(shè)空白對照和供試品組，每組 8復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL。供試品組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL和10 μL不同濃度的待測藥液, 使藥液終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16mg/mL，置 37 ℃，5% CO2孵育12～24 h。然后向每個小孔加入 20 μL CCK-8 溶液，置 37 ℃，5 % CO2孵育 3 h。使用酶標(biāo)儀在 450 nm 下測其光密度，對于高度渾濁的細(xì)胞懸液可以設(shè)定600 nm或以上作為參比波長，進(jìn)行雙波長測定。最后根據(jù)不同濃度藥液對細(xì)胞的生長抑制率，計算其半抑制濃度 IC50值。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 不同極性溶劑的萃取率比較

50 g干燥柿子葉乙醇提取得12.16 g黑褐色初提物浸膏，出膏率為24.32 %。將初提物水溶后，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水相殘留最多，石油醚相最少，說明醇提物中，大極性物質(zhì)更多，小極性的組分較少。各相的萃取率見表1。

表1 六種浸膏的萃取率或出膏率*

Table 1 Extraction rate or extraction rate of six extracts

萃取相重量(g)萃取率（%） 乙醇初提物12.1624.32 石油醚相0.420.84 二氯甲烷相1.743.48 乙酸乙酯相1.492.98 正丁醇相2.354.70 水相3.066.12

*萃取率或出膏率：單一溶劑提取所得浸膏的干重g / 柿子葉重量g * 100%

2.2 六種浸膏對Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的抑制活性比較

表2是柿子葉六種浸膏對Hela細(xì)胞的抑制率。如表2所示，粗提物在0.5 mg/mL濃度時對Hela細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增大，抑制率逐步提升，在最大測試濃度16 mg/mL下顯示出93.58%的抑制率。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取相和水相均對Hela細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，在16 mg/mL濃度下均顯示出了90%以上的抑制率。

表2 柿子葉六種浸膏對Hela細(xì)胞的抑制率

Table 2 Inhibition rate of six extracts from persimmon leaves on Hela cells

對Hela細(xì)胞的抑制率（%） 濃度(mg/mL)初提物石油醚二氯甲烷乙酸乙酯正丁醇水相 0.1253.44-45.328.5841.088.85 0.256.67-49.1734.7547.0017.00 0.526.08-64.8335.2562.7519.92 148.178.4267.0845.1765.2527.25 257.9225.7570.0066.5869.0055.92 465.0841.6776.9270.7581.3373.50 872.0846.9288.2578.5084.1778.08 1693.5894.2597.3394.7591.4294.92

表3是柿子葉六種浸膏對A549細(xì)胞的抑制率。如表2所示，粗提物在0.5 mg/mL濃度時對A549細(xì)胞的抑制率為23.26%，隨著濃度的增大，抑制率逐步提升，在最大測試濃度16 mg/mL下顯示出91.82%的抑制率。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取相和水相也對A549細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。但在16 mg/mL濃度下，只有乙酸乙酯相表現(xiàn)出90%以上的抑制率，其他幾相的抑制率在58.26%～75.78%。

表3 柿子葉六種浸膏對A549細(xì)胞的抑制率

Table 3 Inhibition rate of six extracts from persimmon leaves on A549 cells

對A549細(xì)胞的抑制率（%） 濃度(mg/mL)初提物石油醚二氯甲烷乙酸乙酯正丁醇水相 0.1257.04-25.1553.94-7.45 0.2514.804.5039.7458.663.6017.11 0.523.2624.7643.5767.0920.3725.67 131.3125.1546.2469.0334.6734.85 256.1433.7949.1670.3761.2941.12 467.2738.5861.2172.0861.9944.79 883.7043.6566.1089.7663.2352.53 1691.8258.2375.7895.9467.0662.48

為了比較各種浸膏對Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的抑制活性高低，采用GraphPad Prism 5.0軟件對抑制率進(jìn)行了非線性擬合，得到了各萃取相抗腫瘤活性的IC50值。如表4所示，乙醇粗提物對Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的IC50分別為1.67、1.75 mg/mL，石油醚相活性最差，IC50值分別為5.53、11.11 mg/mL，其次是水相，IC50值分別為1.85、6.02 mg/mL。值得一提的是乙酸乙酯相對A549細(xì)胞的抑制活性十分優(yōu)越，其IC50低至0.03 mg/mL。

表4 六種浸膏抑制Hela 和A549細(xì)胞生長的IC值

Table 4 IC50 of six extracts from persimmon leaves inhibited the growth of Hela and A549 cells

IC50 （mg / mL） HelaA549 乙醇初提物1.67 ± 0.051.75 ± 0.03 石油醚相5.53± 0.0511.11± 0.09 二氯甲烷相0.26 ± 0.081.23± 0.05 乙酸乙酯相1.35 ± 0.040.03± 0.28 正丁醇相0.28 ± 0.052.30± 0.09 水相1.85 ± 0.036.02± 0.05

2.3 六種浸膏對正常細(xì)胞293的細(xì)胞毒性比較

六種浸膏對293細(xì)胞的IC50值見表5。乙醇初提物對正常細(xì)胞的IC50為2.04 mg/mL，該值與癌細(xì)胞的IC50值相比略有偏高，但相差不大，各萃取相對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的抑制程度也相差不大，這說明柿子葉提取物的抗癌細(xì)胞活性沒有選擇性，對正常細(xì)胞同樣顯示出抑制作用。此外從表5可以看出，石油醚相對正常細(xì)胞的抑制活性也是最低的，說明石油醚相中含有抗腫瘤有效成分相對較少。

表5 六種浸膏抑制293細(xì)胞生長的IC值

Table 5 IC50 value of six extracts from persimmon leaves inhibiting the growth of 293 cells

IC50 （mg / mL） 乙醇初提物2.04 ± 0.44 石油醚相5.56 ± 0.51 二氯甲烷相1.17 ± 0.18 乙酸乙酯相0.93 ± 0.49 正丁醇相1.34 ± 0.54 水相0.75 ± 0.10

3 結(jié)論

在本實驗中，通過采用乙醇回流提取工藝先提取出柿子葉初提物，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種極性從小到大排列的溶劑依次進(jìn)行梯度萃取，獲得不同極性的有效成分，加上水相和初提物總共得到六種浸膏。對這六種浸膏采用CCK-8檢測法分別對人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、肺癌細(xì)胞(A549) 和人腎上皮細(xì)胞（293）的生長抑制進(jìn)行了測定。藥理實驗結(jié)果顯示，柿子葉乙醇提取物，以及不同極性組分對人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、肺癌細(xì)胞(A549) 和人腎上皮細(xì)胞（293）的生長均有較明顯的抑制作用。對于Hela細(xì)胞，各萃取相的活性順序是：二氯甲烷相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水相>石油醚相；對于A549，各萃取相的活性順序是：乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>水相>石油醚相。二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇三種浸膏的抗癌效果最好，但是它們對293細(xì)胞的細(xì)胞毒性也相對較大。

總之，本研究進(jìn)一步確定了柿子葉提取物具有顯著的抗腫瘤活性，同時對正常細(xì)胞液顯示出細(xì)胞毒性，而其細(xì)胞生長抑制的有效部位主要是二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇相，說明其有效組分屬于中等極性的化學(xué)成分。本研究為后續(xù)柿子葉中抗腫瘤化學(xué)成分和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一定依據(jù)。

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antitumor activity of effective fraction of persimmon leaves

LIU Bin1, SONG Ming-xia2,3, LI Dong-ni2, NIU Jia-xiao2,*DENG Xian-qing2,3

（1. The Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China; 2. School of Medicine, Jinggangshan University, Ji'an, Jiangxi 343009, China;（3. Research Center of Chinese Medicinal Resources and Functional Molecules of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

In this research, the active ingredient of the dried persimmon leaves as study object was extracted by alcohol reflux extraction. The crude extracts were extracted with petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetate and n-butanol in turn, and totally six kinds of dry extracts were obtained. CCK assay was used to detect the growth inhibition of six extracts on human cervical cancer cells, lung cancer cells and human renal epithelial cells. The results showed that all the six extracts had strong anti-tumor activity, with IC50of 0.24 and 0.26 mg/mL, respectively. While the A549 cells were more sensitive on the ethyl acetate phase, with IC50of 0.03 mg/mL. What’s more, the six extracts showed inhibition against the normal cells 293, expecially the ethyl acetate phase, which showed the IC50of 0.93 mg/mL against the normal cells 293. This study confirmed that persimmon leaves had obvious anti-tumor activity, and its active components were complex and distributed in each extract phases. The activities of the extract phases against the different cell lines were different. It suggested that in the follow-up activity tracking, the appropriate effective parts could be selected for research according to the research aim.

persimmon leaf; effective fraction; antitumor activity

1674-8085(2021)06-0025-05

R284.2

A

10.3669/j.issn.1674-8085.2021.06.005

2021-04-11；

2021-06-20

國家自然科學(xué)基金項目(21562028)；江西省衛(wèi)計委科技計劃項目(20185476)；江西省教育廳科技計劃項目(GJJ160761)

劉 彬(1985-)，男，河南南陽人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事惡性腫瘤研究(E-mail:zdan10@163.com)；

宋明霞(1983-)，女，山西介休人，副教授，博士，主要從事抗菌與抗腫瘤藥物研究(E-mail:freexiaoxiao83@aliyun.com)；

李東妮(2000-)，女，河北張家口人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2018級本科生(E-mail:1511459841@qq.com)；

牛佳曉(2000-)，女，寧夏銀川人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2018級本科生（E-mail:1531001189@qq.com）；

*鄧先清(1984-)，男，湖南衡陽人，副教授，博士，主要從事先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化工作(E-mail: dengxianqing1121@126.com).