傳染性造血器官壞死病疫苗的研究進展

陳桂花，盧彤巖，趙景壯，林婧楠，任廣明，徐黎明

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

傳染性造血器官壞死病（Infectious hematopoietic necrosis,IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）引起的一種導致鮭科幼魚高死亡率的病毒病[1,2]，死亡率可高達100%。世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）將此病列為必須申報的動物疫病，我國將此病列為二類疫病[3]。IHNV 屬彈狀病毒科Rhabdoviridae，諾拉彈狀病毒屬Novirhabdovirus，基因組為單股負鏈RNA，全長約11 kb，依次編碼六種蛋白，分別為核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）、磷酸蛋白（Phosphoprotein，P）、基質蛋白（Matrix protein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）、非結構蛋白（Nonvirion protein，NV）和RNA 聚合酶蛋白（RNAdependent RNA polymerase protein，L）[4]。該病首次于20 世紀50 年代在美國暴發(fā)，80 年代傳入中國，現(xiàn)已廣泛分布于全球許多國家，對鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失和威脅[5]。目前僅加拿大有IHN 疫苗上市，其他國家仍無疫苗可用。因此研發(fā)一種安全、高效的疫苗對預防該病尤為重要。

迄今為止，已報道的IHN 疫苗主要有滅活疫苗[6]、減毒活疫苗[7]和重組疫苗，其中重組疫苗包括亞單位疫苗[8]、合成肽疫苗[9]及核酸疫苗[10]。本文通過概述不同類型IHN 疫苗的研究現(xiàn)狀，以期為水產動物疾病疫苗研發(fā)提供參考。

1 滅活疫苗

IHN 滅活疫苗是指將細胞培養(yǎng)獲得的IHNV，經物理或化學方法滅活制成的疫苗。目前，已研究的IHNV 物理滅活方法為高溫加熱法。Anderson等[6]將100℃和50℃下滅活的IHNV 注射免疫虹鱒Oncorhynchus mykiss 后，能引起虹鱒產生免疫應答，但攻毒后免疫保護力低。IHNV 化學滅活方法常用甲醛、β-丙內酯（C3H4O2，BPL）和二元乙烯亞胺（BEI）等滅活劑滅活。甲醛價格低廉易獲得，是最早用于滅活IHNV 的滅活劑。甲醛在滅活病毒時不僅能與含氨基的核苷酸結合破壞病毒核酸結構，還能與病毒蛋白質的氨基結合使其變性[11]。滅活溫度對甲醛滅活IHNV 的滅活時間和免疫保護效果均有影響，隨著滅活溫度的升高，滅活時間縮短，免疫保護效果更有效。如Nishimura 等[12]以0.2%甲醛在4℃滅活IHNV 6 d，免疫虹鱒后保護率為20%～30%；Tang 等[13]和高欣等[14]用0.2%的甲醛分別在25℃和37℃滅活24 h，免疫虹鱒后相對保護率分別為79.1%和85%。相對于甲醛，BPL 和BEI 在滅活病毒時主要作用于病毒的核酸堿基，故病毒蛋白質不被破壞，不損壞病毒的免疫原性[15]。近年來，BPL 被廣泛應用于IHN 滅活疫苗的研制中。BPL 濃度影響B(tài)PL 滅活IHNV 的免疫效果。魏文燕等[16]分別用0.08%BPL、0.09%BPL 和0.1%BPL 滅活IHNV 免疫虹鱒后，BPL 終濃度為0.1%時相對保護率為68%，免疫效果最佳。Anderson 等[6]和Tang 等[13]分別用2.7 mmol/L 和0.01%BPL 滅活IHNV 24 h 后免疫虹鱒，相對保護率均高于90%，且免疫保護性可持續(xù)56 d。迄今為止，關于BEI 滅活IHNV 的研究較少，僅有Anderson 等[6]和Tang 等[13]分別在0.02%BEI 32℃48 h 和1.5 mmol/LBEI 37℃48 h 的滅活條件下滅活IHNV，免疫虹鱒后相對保護率為83.33%和80%。綜上可見，這三種滅活劑滅活IHNV 時，BPL滅活苗的免疫效果較好，免疫保護率較高。

2 減毒活疫苗

IHN 減毒活疫苗指用IHNV 毒力減弱的毒株制成的一類可誘導魚體產生細胞免疫抵抗外源IHNV感染的疫苗[17]。目前，IHNV 減毒株主要通過細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)、應用單克隆抗體篩選和基因重組構建等方法獲得。如Tebbit 等[7]、Sandra 等[18]和Ristow等[19]通過連續(xù)細胞傳代分離純化獲得IHNV 弱毒株，用其免疫虹鱒均能抵抗IHNV 的感染，免疫后120 d 仍對魚體具有保護作用，且血清中和抗體效價最大值可達1280。Roberti 等[20]利用IHNV 的中和性單克隆抗體分離篩選出兩株弱毒突變體RB-1 和193-110-4，免疫虹鱒14 d 后用同源野生毒株攻毒，相對保護率為12%～65%。隨著分子免疫學與基因工程技術的迅猛發(fā)展，利用基因重組技術研發(fā)出了新型減毒活疫苗[21]。Romero 等[22]應用反向遺傳學方法獲得重組減毒株rIHNV-Gvhsv-GFP，可同時誘導產生抗IHNV 和病毒性出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）的保護性反應。Rouxel 等[23]通過調整IHNV N 基因和G 基因在整個基因組的次序構建了8 個重組減毒株，僅有N2G3、N2G4、N3G4 和N4G1 的毒力明顯減弱，其中用N2G3 免疫虹鱒后可誘導產生高水平抗體，相對保護率可達86%。吳洋等[24]應用反向遺傳學技術對IHNV NV 蛋白的第32～35 位氨基酸進行重組，拯救出兩種減毒株rIHNV-NVQ32-35 和rIHNV-NVT32-35，其復制能力均低于野生型毒株，免疫虹鱒后，累計死亡率分別為60%和55%。Chen 等[25,26]利用IHNV G 基因和載體（pBlueScript II-IHNV-HLJ-09）成功構建了重組二價IHNV 減毒株（rIHNV-N438AΔNV-VP2），免疫虹鱒后能抵抗同源IHNV 毒株和sp 血清型IPNV 毒株的感染，相對保護率分別為84.6%和88.9%。

傳統(tǒng)IHN 減毒疫苗和新型IHN 疫苗均具有減毒活疫苗的特點，即擁有較好的免疫原性、免疫周期長和恢復原始毒力的潛在可能[27]。相較于傳統(tǒng)IHN 減毒疫苗，新型減毒疫苗制備周期短且在自然條件下毒力穩(wěn)定，故近年來，隨著對IHN 預防的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了一個新的研究熱點：應用反向遺傳學的方法重組構建IHNV 減毒株，促進了減毒疫苗向多價減毒疫苗發(fā)展。

3 重組疫苗

3.1 亞單位疫苗

IHN 亞單位疫苗指將IHNV 的抗原基因在不同表達系統(tǒng)中表達所獲得的特定蛋白質制成的疫苗[28]。Engelking 等[29]用一種野生型IHNV 毒株RB1 的G蛋白免疫虹鱒，可抵抗同源性或異源性IHNV 毒株的感染。Oberg 等[30]利用大腸桿菌E.coli 表達含有IHNV N 蛋白的trpE 融合蛋白免疫虹鱒后，無法誘導機體產生免疫保護反應。將該融合蛋白與含G 蛋白的細菌裂解液共同免疫虹鱒時，免疫保護反應明顯增強，證明了IHNV G 蛋白可誘導魚體產生免疫保護反應。此后，關于IHN 亞單位疫苗的研究多以表達G 蛋白為基礎，利用不同的表達載體制備IHN亞單位疫苗。Cain 等[31]利用昆蟲細胞SF9 表達的重組IHNV G 蛋白，可誘導虹鱒產生低水平的中和抗體，在一段時間內保護虹鱒免受IHNV 的感染。Simon 等[8]用新月柄桿菌Caulobacter crescentus 表達的含IHNV 截短G 蛋白的融合蛋白，免疫虹鱒后相對免疫保護率可達26%～34%。Verjan 等[32]利用大腸桿菌表達獲得了可溶性重組IHNV G 蛋白，該蛋白可誘導虹鱒產生以IFNs 介導的先天性免疫反應，相對保護率為70%。Zhao[33]等利用酵母表面展示技術成功地將IHNV G 蛋白展示在釀酒細胞表面制成口服疫苗，誘導魚體產生粘膜免疫反應，相關免疫因子表達上調，相對保護率為45.8%。代靜等[34]成功獲得了一種攜帶有IHNV G 基因的轉基因萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，灌胃免疫小鼠后，可刺激小鼠體內的CD4+、CD8+T 淋巴細胞增加，以期通過后期進一步研究制成一種安全、有效的口服疫苗。

目前，已報道的用于IHN 亞單位疫苗生產的表達系統(tǒng)有大腸桿菌、昆蟲細胞SF9、新月柄桿菌、釀酒酵母細胞等。用它們表達的重組G 蛋白免疫后，均能誘導虹鱒產生免疫保護性反應，但保護效果偏低。未來可通過添加適當的佐劑來增強其免疫原性，以達到更優(yōu)的免疫效果。

3.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗指將具有免疫保護力的人工合成肽與適當的載體結合后，加入佐劑制成的疫苗[21]。目前，關于IHN 合成肽疫苗的研究較少。Emmenegger 等[9]根據IHNV G 基因的核苷酸序列合成了三種肽（P27、P226 和P268），將其分別與BSA 和MAP8載體偶聯(lián)制成六種合成肽疫苗，免疫虹鱒后，均能識別IHNV，但識別率低，僅用P286+MAP8 免疫后血清具有中和IHNV 的作用。研究表明：肽段與IHNV 的重新編碼率較低，僅有少量的抗體結合。迄今為止，IHN 合成肽疫苗仍處于實驗研究階段，需進一步探討其免疫機制和構建機理。

3.3 DNA 疫苗

G 基因是IHNV 的主要抗原表位基因，能誘導機體產生中和抗體，刺激細胞免疫應答，能有效免疫保護鮭鱒魚[35,36]。目前IHN DNA 疫苗主要通過將IHNV G 基因導入不同載體構建成重組質粒。根據具有的抗原基因種類，IHN DNA 疫苗可分為單價DNA 疫苗和多價DNA 疫苗。

3.3.1 單價DNA 疫苗

近些年，IHNV DNA 疫苗研究已取得了突破性的進展，根據其免疫接種方式可分為注射疫苗和口服疫苗。

注射疫苗：1996 年，Anderson 等[37]首次構建了以CMV 為啟動子的IHNV DNA 疫苗。Corbeil 等[35]利用IHNV WRAC 株的G 基因構建了pIHNVw-G疫苗。從1999 年開始，在此基礎上進行了大量研究。LaPatra 等[38]和Purcell 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，用低劑量的DNA 疫苗可保護體質量2～160 g 的虹鱒免受IHNV 的危害。Kurath 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，用該疫苗免疫虹鱒3 個月仍能在血清中檢測到中和性抗體，且免疫保護率高達100%。Corbeil 等[41]發(fā)現(xiàn)，肌肉注射和皮內基因槍注射免疫虹鱒的保護效果明顯優(yōu)于浸泡和口服等免疫方式。2005 年加拿大批準該疫苗商品化，成為第一個上市的IHN DNA 疫苗[42]。2011 年Pe?aranda 等[43]分別用U、M基因型IHNV 毒株的G基因構建成DNA 疫苗（PM、PU），免疫虹鱒后均能抵抗這兩種基因型毒株的交叉感染和單獨感染。隨著對IHN DNA 疫苗的廣泛研究，其引發(fā)的潛在安全性問題也備受關注，并進行了相應改良的研究。Alonso 等[44]于2003 年首次構建了含虹鱒自身干擾素調節(jié)因子1A（IRF1A）啟動子的特殊表達載體（pIRF1A-G），用其免疫虹鱒后較pCMV-G 更安全。隨后，Alonso 等[45]將可誘導宿主細胞程序性死亡的M 基因[43,44]分別克隆到pIRF1A-G 和pCMV-G 質粒上構建成新型自殺性DNA 疫苗。該類疫苗的獨特性是具有IRF1A 和MT 2 個啟動子，其中MT 可誘導M基因的表達，使含DNA 疫苗的細胞調亡，消除殘留的疫苗。這些研究消除了消費者對使用疫苗后的魚體的擔憂，同時開啟了核酸疫苗的安全性的新思路。

近年來，我國對IHN DNA 疫苗也進行了大量研究。徐黎明等[10]于2017 年將中國流行株的G 基因連接到優(yōu)化后的pcDNA3.1 真核表達載體構建成DNA 疫苗（pIHNch-G）[46]，免疫60 d 后仍能產生保護反應，相對保護率可達90%以上。李淵等[47,48]在此基礎上對該疫苗免疫的虹鱒和養(yǎng)殖水環(huán)境進行長期監(jiān)測，結果表明：該疫苗對魚體和養(yǎng)殖環(huán)境安全。何琦瑤等[49]于2019 年在真核表達載體pVAX1 上構建了IHN 核酸疫苗（pVAX1-G）。用該疫苗注射免疫虹鱒21 d 后谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）活性等血清生化指標與對照組明顯不同，表明該疫苗可減輕IHNV 對虹鱒的肝臟、腎臟和肌肉組織的損壞程度，免疫保護率可達78%。

口服疫苗：口服免疫方便、不受魚體大小的限制且免疫后魚體應激反應小[50]，近年來，IHN 口服疫苗越來越熱門。目前，已報道的IHN 口服疫苗的來源有PLGA、藻酸鹽微球。Adomako 等[51]將質粒pCDNA-G 和PLGA 混合制成納米顆粒（PLGA-PCDNA-G），投喂虹鱒后，第96 h 時即可在魚后腸上皮細胞中檢測到這種納米顆粒，相對保護率為11%～22%。Ballesteros[52]等將pIRF1A-G DNA 質粒包埋于藻酸鹽微球中制成口服疫苗，高劑量投喂虹鱒，在免疫30 d 后的相對保護率為56%。

3.3.2 多價DNA 疫苗

Einer-Jensen 等[53]研究發(fā)現(xiàn)：對虹鱒同時注射免疫VHSV 和IHNV DNA 疫苗，接種后可抵抗單一病毒感染和兩種病毒聯(lián)合感染，這一發(fā)現(xiàn)開啟了IHN 多價DNA 疫苗研究的新章程。隨著生物學技術的發(fā)展，Xu 等[54]于2017 年成功構建了抗IHN 和傳染性胰臟壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis,IPN）的二價核酸疫苗（pCh-IHN/IPN）。用1.0 μg 該疫苗肌肉注射免疫虹鱒可抵抗高毒力IHNV 毒株的感染（RPS＞90%），明顯降低頭腎中IPNV 的病毒載重。最重要的是，該疫苗對IHNV 和IPNV 交叉感染具有顯著的保護作用，累積死亡率低于6.67%。IHN 多價DNA 疫苗經一次注射免疫后可同時抵抗兩種或兩種以上病毒的感染，減少了多次注射免疫對魚體的傷害，并便捷用于生產實踐。IHNV、VHSV 和IPNV三種病毒的聯(lián)合感染使全球鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大損失，研發(fā)多價DNA 疫苗對鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展極為重要。

目前，用于構建IHN DNA 疫苗的啟動子有CMV 和IRF1A，表達載體有pcDNA3.1 和pVAX1。其中最常見的是用CMV 和pcDNA3.1 構建IHN DNA 疫苗，但含IRF1A 啟動子的疫苗更為安全。對比發(fā)現(xiàn)：注射性疫苗的保護效果明顯優(yōu)于口服疫苗，但口服疫苗對虹鱒幼魚更有實際意義。綜上所述，IHN DNA 疫苗具有安全、高效、成本低廉、易于批量生產及免疫劑量少等優(yōu)點，但DNA 疫苗在生產實踐中推廣仍存在爭議。

3.4 活載體疫苗

IHN 活載體疫苗是將IHNV G 基因重組到無毒力的細菌或病毒基因上，再接種到魚體表達重組蛋白，誘發(fā)機體產生特異性免疫反應。Noonan Brian等[55]將含有VHSV 及IHNV 的抗原表位基因G 穿梭質粒轉入殺鮭氣單胞菌Aeromonas salraonicida的無毒株A440 中，用活菌苗免疫虹鱒后，可增強其對VHSV 及IHNV 免疫保護作用。李守湖等[56,57]成功構建了含IHNV G 基因的重組腺病毒質粒，與牛奶-海藻糖凍干保護劑1∶1 混合凍干后制成活載體疫苗。研究發(fā)現(xiàn)該疫苗安全，浸泡免疫虹鱒后，魚體內的免疫因子明顯上調，保護率可達100%，免疫期可持續(xù)6 個月。

綜上所述，用殺鮭氣單胞菌和腺病毒構建的IHN 活載體疫苗免疫虹鱒后均可同時誘導魚體產生體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫。未來，針對IHN活載體疫苗，可圍繞應用不同的無毒或弱毒載體構建活載體疫苗及其免疫效果和安全性評價進行研究。

4 展望

近年來，IHN 的暴發(fā)嚴重制約了鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了有效防控IHN 的暴發(fā)，進行了大量關于IHN 疫苗的研究。盡管如此，大多數IHN 疫苗研究目前仍停留在實驗室水平，并沒有商業(yè)化投入市場，僅有IHN DNA 疫苗（Apex-IHN）在加拿大被批準上市。徐黎明等[5]構建的IHN DNA 疫苗（pIHNch-G）在黑龍江省已完成中間試驗，提交了環(huán)境釋放申報材料。IHN 核酸疫苗的注射免疫方式的可操作性較低，特別是對小魚的免疫，費時費力。因此，應加強魚用口服疫苗的研究，解決魚用疫苗免疫難的問題。為了保證免疫效果，開發(fā)不同疫苗產品，采用兩種及兩種以上的疫苗來聯(lián)合應用，如在早期進行口服疫苗，然后再進行注射免疫，實現(xiàn)IHN 的全面防控，為鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)綠色生態(tài)、健康可持續(xù)發(fā)展提供保障。