吳茱萸致肝毒性部位在大鼠體內(nèi)的多樣性分析

孫向明，胡 揚(yáng)，溫 靜，宋 輝，李文蘭，丁振鐸

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

吳茱萸是傳統(tǒng)的溫里中藥，用于散寒止痛，助陽(yáng)止瀉，降逆止嘔。據(jù)文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道，其主要的化學(xué)成分為生物堿、苦味素、揮發(fā)油和黃酮等?，F(xiàn)代藥理研究表明[3-7]，吳茱萸主要活性成分具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)胃黏膜、血管舒張、強(qiáng)心等作用。隨著對(duì)吳茱萸藥理作用和臨床研究的不斷深入，其肝毒性的相關(guān)研究受到廣泛關(guān)注[8-11]。對(duì)于傳統(tǒng)口服給藥方式的中藥，發(fā)揮作用的直接物質(zhì)都存在于體內(nèi)，受到胃腸道微生物、酸堿性、代謝酶等的影響，常會(huì)使其化學(xué)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，體內(nèi)不僅有原型成分，也可能存在代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)都有可能是其發(fā)揮藥效或毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在本課題組前期研究中，已經(jīng)證實(shí)吳茱萸的50%乙醇提取物是致肝毒性部位[12]，并揭示了其在大鼠血清中的代謝情況[13]。然而，中藥的體內(nèi)代謝往往是多途徑的，對(duì)中藥成分的體內(nèi)代謝行為進(jìn)行多樣性分析，有助于深入了解中藥原型成分和代謝產(chǎn)物之間的質(zhì)變代謝規(guī)律和體內(nèi)作用過(guò)程。

本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)技術(shù)全面表征吳茱萸肝毒性部位經(jīng)灌胃進(jìn)入大鼠膽汁、尿液、糞便中的成分，通過(guò)分析大鼠體內(nèi)運(yùn)載的吳茱萸代謝產(chǎn)物信息，逆向追蹤原型成分，推測(cè)各代謝產(chǎn)物可能的代謝途徑。通過(guò)進(jìn)一步比較原型成分及代謝產(chǎn)物在不同生物樣品中的分布情況，以期全面分析吳茱萸在體內(nèi)的代謝和排泄過(guò)程，為闡明肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考和佐證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

ACQUITY UPLC I-Class液相系統(tǒng)、Xevo G2-S QTOF質(zhì)譜系統(tǒng)、UNIFI 1.7軟件：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與材料

吳茱萸：購(gòu)自哈爾濱三棵樹(shù)藥材市場(chǎng)，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)張德連教授鑒定為吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.；ProElut PLS 固相萃取小柱(60 mg，3 mL)：北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈和甲酸：色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

雄性Wistar大鼠(合格證號(hào)SCXK-(吉))：質(zhì)量為(230±20) g，購(gòu)自長(zhǎng)春國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。單次實(shí)驗(yàn)所用的大鼠均為同一批次，自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3 灌胃藥液的制備與給藥

取適量吳茱萸粗粉，用50%乙醇浸泡過(guò)夜，熱回流法提取2次，分別為8倍量溶劑提取120 min、7倍量溶劑提取90 min，將2次提取液減壓濃縮至無(wú)醇味呈浸膏狀，給藥前以蒸餾水制成約1.4 g生藥材/mL的灌胃藥液。

將大鼠分為給藥組和空白組，每組6只。給藥前稱取大鼠體重，按照35 g/(kg·d)(以生藥計(jì))的劑量灌胃給藥，每天1次，空白組每天給予25 mL/kg蒸餾水，連續(xù)給藥14天(本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)連續(xù)灌胃14天可致大鼠出現(xiàn)肝毒性[12])。

1.4 生物樣品的采集和預(yù)處理

1.4.1生物樣品的采集 于第13天給藥后將大鼠放回代謝籠中，禁食不禁水，收集0～24 h內(nèi)的尿液和糞便。末次給藥后立即用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，在十二指腸的腸系膜上找到具有韌性的白色膽管，用聚氯乙烯管向肝臟方向穿入，醫(yī)用縫合線進(jìn)行線結(jié)扎固定，收集4 h內(nèi)流出的膽汁。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用生理鹽水紗布覆蓋創(chuàng)面，并保持濕潤(rùn)。

1.4.2生物樣品的預(yù)處理 分別取3 mL含藥和空白膽汁樣品，加入12 mL甲醇，于離心管中充分渦旋混勻1 min，再以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

將空白及含藥尿液以3 000 r/min離心15 min，分別取3 mL離心后上清液活化平衡后的固相萃取小柱。先用蒸餾水淋洗，洗去強(qiáng)極性的雜質(zhì)，棄去淋洗液；再分別用3 mL 50%甲醇、乙腈洗脫，收集、合并洗脫液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

分別稱取1 g搗碎后的含藥和空白糞便樣品，加入9 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，做勻漿處理。再用水飽和正丁醇萃取3次，每次加入10 mL，收集萃出液，以3 000 r/min離心15 min，取上清液減壓濃縮后，氮?dú)獯蹈?。在進(jìn)行UPLC-Q-TOF MS分析前，用0.5 mL 50%甲醇充分溶解上述生物樣品的氮吹殘留物，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除去雜質(zhì)。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

色譜和質(zhì)譜分析條件與參考文獻(xiàn)[13]一致。采用HSS T3色譜柱(1.8 μm×100 mm×2.1 mm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～0.3 min(1%B)，0.3～2 min(1%～15%B)，2～4 min(15%～25%B)，4～6 min(25%～55%B)，6～8 min(55%～70%B)，8～12 min(70%～99%B)；流速：0.5 mL/min。采用大氣壓電噴霧離子掃描；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；源溫度：120 ℃；霧化氣溫度：500 ℃；霧化氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：10 L/h；采集模式：MSE；采集質(zhì)量范圍：m/z50～1 200；低碰撞能量：4.0 eV；高碰撞能量：20.0～45.0 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠膽汁、尿液和糞便中吳茱萸原型成分分析

采用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)對(duì)灌胃吳茱萸肝毒性部位后的大鼠體內(nèi)樣品進(jìn)行正、負(fù)離子模式掃描，比較樣品的基峰離子(BPI)色譜圖，結(jié)果表明，在正離子模式下信號(hào)響應(yīng)更強(qiáng)，因此選取正離子模式進(jìn)行分析。

空白膽汁與含藥膽汁、空白尿液與含藥尿液、空白糞便與含藥糞便的BPI色譜圖示于圖1，共檢測(cè)到10個(gè)排入膽汁的成分，20個(gè)進(jìn)入尿液的成分，26個(gè)進(jìn)入糞便的成分。進(jìn)一步與吳茱萸肝毒性部位各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)[13]比對(duì)，發(fā)現(xiàn)膽汁中4個(gè)成分為原型成分(1～4號(hào)峰)，尿液中15個(gè)成分為原型成分(2～16號(hào)峰)，糞便中22個(gè)成分為原型成分(1～5、7～23號(hào)峰)，結(jié)果列于表1。有關(guān)原型成分的解析過(guò)程已在文獻(xiàn)[13]中做了詳細(xì)闡述，本文不再贅述。

注：a～j峰為代謝產(chǎn)物峰，1～23為原型成分峰圖1 含藥膽汁與空白膽汁(a)，含藥尿液與空白尿液(b)，含藥糞便與和空白糞便(c)的基峰離子色譜圖Fig.1 Base-peak ion chromatograms of medicated bile and blank bile (a), medicated urine and blank urine (b), medicated feces and blank feces (c)

2.2 大鼠膽汁、尿液和糞便中吳茱萸的代謝產(chǎn)物分析

由圖1和表2可見(jiàn)，在膽汁中檢測(cè)到6個(gè)代謝產(chǎn)物(a～f號(hào)峰)，在尿液中檢測(cè)到5個(gè)代謝產(chǎn)物(a,c,e,g,h號(hào)峰)，在糞便中檢測(cè)到4個(gè)代謝產(chǎn)物(b,c,i,j號(hào)峰)。其中，代謝產(chǎn)物b、c、e、h、j也是吳茱萸肝毒性部位在血中的代謝產(chǎn)物，分別對(duì)應(yīng)喹諾酮類生物堿代謝物Ⅰ、羥基去氫吳茱萸堿、去甲基去氫吳茱萸堿、羥基吳茱萸堿和14-甲?；鋮擒镙谴螇A[13]。由于代謝物b的結(jié)構(gòu)未知，但其二級(jí)碎片離子m/z173.083 9、186.091 6是喹諾酮類生物堿的特征碎片離子[14]，提示其為喹諾酮類生物堿，但因缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，故在本文中將其暫定為

喹諾酮類生物堿代謝物Ⅰ。利用UNIFI 1.7軟件數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與人工解析相結(jié)合，進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，參考化合物的裂解規(guī)律、各級(jí)質(zhì)譜信息和已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其他代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析[15-20]：代謝物a的[M+H]+峰為m/z494.156 3，推斷其分子式為C25H23N3O8，誤差為0.01×10-6。碎片離子m/z318.124 2與母離子相差176.032 1 u，為母離子失去1分子葡萄糖醛酸(GlcA)產(chǎn)生的[M+H-C6H8O6]+，同時(shí)出現(xiàn)丟失葡萄糖醛酸苷(OGlcA)產(chǎn)生的m/z302.100 1碎片離子，因此推測(cè)代謝物a為去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物。代謝物d的[M+H]+峰為m/z274.144 2，代謝物i的[M+H]+峰為m/z302.175 9，二者的碎片離子中都包含m/z173、186等喹諾酮類生物堿的特征碎片離子，由于結(jié)構(gòu)未知，缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，分別暫定為喹諾酮類生物堿代謝物Ⅱ和喹諾酮類生物堿代謝物Ⅲ。代謝物f的[M+H]+峰為m/z520.339 8，有碎片離子m/z184.073 8、104.107 4，其結(jié)構(gòu)未知。代謝物g的[M+H]+峰為m/z398.320 4，推斷其分子式為C19H15N3O5S，誤差為2.26×10-6，碎片離子m/z318.124 4與母離子相差80.195 7 u，為母離子丟失1分子磺酸基(SO3)產(chǎn)生的[M+H-SO3]+，碎片離子m/z302.129 1與母離子相差96.191 3 u，為母離子失去1分子硫酸基(SO4)形成的[M+H-SO4]+，推測(cè)g為去氫吳茱萸堿硫酸結(jié)合物。各代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。

2.3 代謝產(chǎn)物的代謝途徑分析

本研究在大鼠的膽汁、尿液和糞便樣品中共檢測(cè)出10個(gè)代謝產(chǎn)物，其中4個(gè)代謝物結(jié)構(gòu)未得到鑒定，6個(gè)代謝產(chǎn)物推測(cè)由4個(gè)原型成分通過(guò)葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、甲?；娶蛳啻x以及羥基化、去甲基化等Ⅰ相代謝途徑轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，具體的代謝途徑示于圖3[15-16,18]。推測(cè)代謝物a(去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物)、代謝物c(羥基去氫吳茱萸堿)、代謝物e(去甲基去氫吳茱萸堿)、代謝物g(去氫吳茱萸堿硫酸結(jié)合物)分別是由原型成分去氫吳茱萸堿與體內(nèi)葡萄糖醛酸結(jié)合、發(fā)生羥基化、脫甲基反應(yīng)、與體內(nèi)硫酸基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物；代謝物h(羥基吳茱萸堿)可能為羥基吳茱萸堿在體內(nèi)發(fā)生羥基化的代謝產(chǎn)物；代謝物j(14-甲?；鋮擒镙谴螇A)可能為二氫吳茱萸次堿在體內(nèi)發(fā)生甲酰化后的代謝產(chǎn)物。

2.4 血清、膽汁、尿液、糞便中吳茱萸肝毒性部位的代謝比較

結(jié)合吳茱萸肝毒性部位入血成分分析結(jié)果[13]，比較吳茱萸肝毒性部位的原型成分和代謝產(chǎn)物在不同生物樣品中的分布情況和代謝途徑，有助于了解藥物的體內(nèi)作用過(guò)程和代謝規(guī)律。

注：a.去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物；b.羥基去氫吳茱萸堿；c.去甲基去氫吳茱萸堿；d.去氫吳茱萸堿硫酸結(jié)合物；e.羥基吳茱萸堿；f.14-甲?；鋮擒镙谴螇A圖2 代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary mass spectra of metabolites

圖3 吳茱萸肝毒性部位在大鼠膽汁、尿液和糞便中的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of Euodiae Fructus hepatotoxic part in rat bile, urine and feces

吳茱萸的主要成分類型為生物堿類，極性較小，易以原型物形式被直接吸收。在大鼠體內(nèi)共檢測(cè)到23個(gè)吳茱萸肝毒性部位的原型成分，且多數(shù)成分的排泄途徑呈多樣性。就原型藥物而言，腎排泄是主要消除途徑，有些藥物具有肝腸循環(huán)的特點(diǎn)，其代謝物經(jīng)膽汁進(jìn)入小腸，釋放出原型藥物，最終通過(guò)糞便排出。在血清中發(fā)現(xiàn)的15個(gè)原型成分會(huì)同時(shí)在尿液、膽汁或糞便中被檢測(cè)到，推測(cè)這些原型成分經(jīng)胃腸道被吸收入血后，通過(guò)肝門靜脈進(jìn)入肝臟，一部分進(jìn)入體循環(huán)，最終隨尿液排出體外，成為血清和尿液樣品的共有成分，一部分被排泄到膽汁，經(jīng)膽管到達(dá)小腸，直接由糞便排出，因此血清、膽汁、糞便中均能檢出；一些成分未被完全吸收，則隨腸道糞便排出，可在血清和糞便中同時(shí)檢測(cè)到。另外，有7個(gè)原型成分未在血清中檢測(cè)到，其中一個(gè)原因可能是由于藥物含量甚微，現(xiàn)有的條件無(wú)法檢測(cè)到，而尿液和糞便是累計(jì)收集24 h的樣品，藥物濃度一般高于血中，故在尿液和糞便中可以被檢測(cè)到；另一個(gè)原因可能是該原型成分未被吸收入血，直接經(jīng)腸道隨糞便排出體外。

在大鼠的4種生物樣品中共檢測(cè)到12個(gè)代謝產(chǎn)物，其中4個(gè)成分結(jié)構(gòu)未知。吳茱萸的代謝途徑多樣，在血清、尿液、糞便和膽汁中均能發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物，且Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝均會(huì)發(fā)生。去氫吳茱萸堿在大鼠體內(nèi)發(fā)生了葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、羥基化和去甲基化等多種代謝反應(yīng)，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物主要出現(xiàn)在膽汁和尿液樣品中，可能以肝代謝為主，代謝產(chǎn)物極性增加，水溶性增強(qiáng)，主要排泄途徑為腎和膽排泄。一般情況下，膽汁排泄是藥物代謝物尤其是水溶性大的代謝物的主要排泄途徑，分子質(zhì)量<300的化合物從尿液排泄，分子質(zhì)量300～500的化合物從膽汁和尿液排泄，分子質(zhì)量大于500的化合物主要從膽汁排泄。此外，某些藥物的膽汁排泄具有肝腸循環(huán)現(xiàn)象，膽汁分泌后又被小腸重新吸收，或者代謝物被分泌入膽汁，然后又在小腸轉(zhuǎn)化為藥物被重新吸收。在本研究中，以去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物為例，分子質(zhì)量為493，由表2可知，其主要排泄途徑是尿液和膽汁，而且很可能自膽汁流入腸腔，在腸道菌群或酶的作用下轉(zhuǎn)化為去氫吳茱萸堿原型，部分被小腸重新吸收入血進(jìn)入體循環(huán)，呈現(xiàn)肝腸循環(huán)現(xiàn)象，部分隨糞便排出。在糞便樣品中也檢測(cè)到了去氫吳茱萸堿原型，并且在另一項(xiàng)研究中，通過(guò)繪制去氫吳茱萸堿的“血藥濃度-時(shí)間”擬合曲線，發(fā)現(xiàn)去氫吳茱萸堿出現(xiàn)了明顯的雙峰，進(jìn)一步印證了上述推測(cè)。在血清和糞便樣品中，同時(shí)檢測(cè)到14-甲酰基二氫吳茱萸次堿，推測(cè)為原型成分二氫吳茱萸次堿水解和甲?；a(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，該原型成分在血清和糞便中均被檢測(cè)到，推測(cè)一部分原型成分被直接吸收入血，另一部分原型成分在腸道內(nèi)發(fā)生代謝，代謝產(chǎn)物入血，并通過(guò)膽汁排泄，進(jìn)入腸道后隨糞便排出。吳茱萸次堿發(fā)生羥基化反應(yīng)，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物羥基吳茱萸次堿，僅在血清中被檢測(cè)到，推測(cè)入血后在體內(nèi)被進(jìn)一步代謝，以其他代謝產(chǎn)物形式排泄。吳茱萸堿在體內(nèi)發(fā)生羥基化反應(yīng)，在血清和尿液中可檢測(cè)到其代謝產(chǎn)物羥基吳茱萸堿，推測(cè)尿液是其唯一的排泄途徑。

對(duì)于口服藥物毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，進(jìn)入血液中的原型成分和代謝產(chǎn)物是研究重點(diǎn)，在血清、膽汁、尿液、糞便中共存的成分更有研究意義[21-23]。目前，對(duì)中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定，往往局限于有文獻(xiàn)報(bào)道和先驗(yàn)知識(shí)的代謝產(chǎn)物，且僅通過(guò)色譜和質(zhì)譜手段進(jìn)行分析，結(jié)果的可靠性有待驗(yàn)證，還需要在未來(lái)的研究中以核磁共振等方法對(duì)有意義的代謝物進(jìn)行驗(yàn)證，得到確切結(jié)論。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用UPLC-Q-TOF MS/MS技術(shù)對(duì)灌胃吳茱萸肝毒性部位后進(jìn)入大鼠膽汁、尿液、糞便中的吳茱萸原型成分及代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面的定性分析及代謝途徑解析。在膽汁中檢測(cè)到4個(gè)原型成分和6個(gè)代謝產(chǎn)物；在尿液中檢測(cè)到15個(gè)原型成分和5個(gè)代謝產(chǎn)物；在糞便中檢測(cè)到22個(gè)原型成分和4個(gè)代謝產(chǎn)物。在對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步推測(cè)了吳茱萸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑，包括葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、甲?；?、羥基化、去甲基化、水解等，并通過(guò)比較原型成分和代謝產(chǎn)物在不同生物樣本中的分布情況，進(jìn)一步探索其體內(nèi)的作用過(guò)程，為吳茱萸的肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝規(guī)律研究提供了參考依據(jù)。