乳源乳桿菌的益生特性及抗氧化活性研究

葉望娟，雷文平，周杏榮，周佳豪，汪鎮(zhèn)南，劉成國，周 輝*

（1.湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南科賽安生物科技有限公司，湖南 長沙 410014）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產生乳酸的細菌。目前發(fā)現(xiàn)LAB主要有包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、歧桿菌屬及片球菌屬等[1]。益生菌在拉丁文中指“對生命有益”，而LAB是益生菌的一個重要來源[2]。益生菌具有如下特點：抗逆性強[3-4]，數(shù)量多，黏附能力強[5]，能發(fā)揮理化作用和生物學作用來抑制致病菌生長[6]，具有安全性[7]，具有促進健康的作用，如免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇等[8-10]。當給予足夠量的益生菌時，其會以足夠的數(shù)量到達腸道，從而為宿主帶來健康益處[11]。

益生菌發(fā)揮抗氧化作用主要通過以下幾種方式：清除細胞周圍活性氧自由基、鰲合金屬離子以緩解脂質過氧化、自身抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用、下調產生活性氧的酶活性、上調宿主的抗氧化酶活性、益生菌產生抗氧化代謝物、調節(jié)相關信號通路、增加了宿主的抗氧化代謝物水平、調節(jié)腸道微生物群[12]。WANG B G等[13]的研究表明，口服雙歧桿菌ATCC 29521對小鼠有顯著影響，能顯著提高小鼠谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛水平。CUEVAS-GONZáLE P F等[14]研究表明，特定乳桿菌菌株具有抗氧化特性的代謝物，這可能有助于減輕丙烯酰胺誘導的人紅細胞的氧化應激。

本研究選用實驗室從鮮乳中分離保存的5株乳桿菌，通過對菌株的抗逆性、抗生素敏感性、抑菌能力、黏附性進行測定評估其益生菌潛力；并通過體外抗氧化測定，篩選出具高抗氧化活性的菌株，以期為后續(xù)實驗提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）12E、植物乳桿菌（L.plantarum）15E、短乳桿菌（L.brevis）24E、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）260、干酪乳桿菌（L.casei）83：由湖南農業(yè)大學食品科技學院乳品加工實驗室分離保存；大腸桿菌（Escherichiacoli）CGMCC9181、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG（ATCC 53103）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115：本實驗室保存；Caco-2細胞（ATCC HTB-37）：長沙隆和化玻實驗用品有限公司。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶（酶活50 000 U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；抗生素試劑盒（20種）：杭州微生物試劑有限公司；胎牛血清、磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）：以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司。

1.2 儀器與設備

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱：韶關市廣智科技設備有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HR/T16M臺式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)和樣品制備

受試菌株在-80 ℃保藏于甘油管中，試驗開始前，將甘油管中的菌種接種于1 mL的MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，活化兩代后待用。

菌懸液的制備：活化兩代后的菌株以106CFU/mL接種量接種至5 mL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌兩次后重懸，調整菌體濃度為1×108CFU/mL。

菌株發(fā)酵上清液：發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，轉移至新離心管中。

1.3.2 耐酸能力測定

根據(jù)AZHAR M A等[15]的方法稍作修改，將菌株以106CFU/mL接種量分別接種至pH 2和3的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0 h和6 h時測定菌液在波長600 nm處的OD600nm值，并計算ΔOD600nm。每個實驗重復3次。公式如下：

ΔOD600nm=OD600nm（6 h）-OD600nm（0 h）

1.3.3 耐膽鹽能力測定

將菌株以106CFU/mL接種量，接種至牛膽鹽含量分別為0、0.1%、0.3%、0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中，調整培養(yǎng)基pH至6.8，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在0 h和6 h測定菌液在波長600 nm處OD600nm值的變化，并計算ΔOD600nm。每個實驗重復3次。公式同1.3.2。

1.3.4 模擬胃腸液耐受能力測定

0.5 mL菌懸液加入4.5 mL模擬胃液或腸液[16]中，混合均勻，于37 ℃條件下孵育3 h，分別計數(shù)0 h及3 h時混合液中的活菌數(shù)量，以菌株存活率評估菌株對模擬胃腸液的耐受能力（以鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG為陽性對照）。菌株存活率計算公式如下：

1.3.5 抑菌活性測定

將指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）活化3代后，以105CFU/mL接種量接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注平板待其凝固后放置牛津杯，將試驗菌株發(fā)酵上清液200 μL加至牛津杯中，4 ℃靜置4 h后在37 ℃條件下培養(yǎng)10 h，量取抑菌圈直徑。

1.3.6 抗生素敏感性測定

菌株以106CFU/mL接種量接種于無菌MRS瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后傾注平板。待凝后將20種抗生素藥敏試紙貼于平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)，2 d后測定其抑制圈直徑。

1.3.7 表面特性研究

根據(jù)SOPHATHA B等[17]的方法稍作修改。取2 mL菌懸液，分別加入等體積的正十六烷或乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min，37 ℃靜置30 min后取水相測其波長600 nm處的吸光度值，以鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG為陽性對照菌。通過以下公式進行計算：

式中：A1為靜置30 min后水相的吸光度值；A0為初始菌懸液的吸光度值。

1.3.8 黏附性測定

根據(jù)ZIELIN′SKA D[18]稍作修改。細胞培養(yǎng)：將復蘇后Caco-2轉入細胞瓶中，使用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d換液，待細胞貼壁生長為單層細胞后進行傳代，傳代5次后進行試驗。黏附試驗前細胞傳代，調整細胞濃度為1×106CFU/mL并接種1 mL至6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長為單層細胞后用于黏附試驗研究。菌懸液制備：菌株經無菌PBS洗滌兩次后，重懸于10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，并調整菌懸液的濃度為1×108CFU/mL（V0）。

乳酸菌對Caco-2細胞的黏附計數(shù)：向6孔板中添加菌懸液之前，用無菌PBS緩沖液洗滌6孔板中單層Caco-2細胞兩次，向每孔加入1 mL濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，將6孔板轉移至5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后；用PBS溶液洗滌3次，去除未黏附的菌體；然后加入1 mL PBS，用細胞刮獲取細胞，平板計數(shù)法計算黏附細菌數(shù)（V1）。計算公式如下：

1.3.9 抗氧化活性測定

菌株總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-TOC）與羥自由基清除能力：根據(jù)檢測試劑盒的說明書進行；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力：參照張香美等[19]的方法并稍作修改，將發(fā)酵上清液用無水乙醇稀釋適應倍數(shù)后取0.5 mL，加入1 mL的濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基無水乙醇溶液，混勻后在室溫條件下避光反應30 min，并10 000 r/min 離心1 min，取上清液在波長517 nm處測定吸光度值?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。

式中：A0為對照吸光度值；A1為樣品組吸光度值；A2為空白組吸光度值。

1.3.10 活菌數(shù)的測定

菌株的活菌數(shù)參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行測定。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析，以SPSSStatistics21進行方差分析（analysisofvariance，ANOVA）和LSD多重比較，顯著水平P≤0.05；使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 耐酸能力測定

由圖1可知，所有菌株均能在pH=2、pH=3環(huán)境下生長。其中菌株12E在pH=3時對酸的耐受性顯著高于其他菌株（P＜0.05）；在pH=2時對酸的耐受性與其他菌株差異不顯著（P＞0.05）。菌株15E在pH=3時對酸的耐受性顯著高于菌株83、260、24E（P＜0.05），顯著低于菌株12E（P＜0.05），與對照菌株LGG差異不顯著（P＞0.05）；在pH=2時對酸的耐受性顯著高于菌株24E（P＜0.05），與其他菌株差異不顯著（P＞0.05）。在耐酸能力上菌株12E、15E優(yōu)于其他試驗菌株，這可能是由于植物乳桿菌與其他菌相比，生長快并且活菌數(shù)比較高，同時產酸能力更強的原因。因此，對酸脅迫抵抗能力更強[20]。

圖1 不同乳酸菌對酸性環(huán)境的耐受性Fig.1 Tolerance of different lactic acid bacteria to acidic environment

2.2 耐膽鹽能力測定

由表1可知，隨著膽鹽含量的增加，對菌株生長抑制作用增加，但所有菌株在不同膽鹽含量環(huán)境中均能生長。且所有菌株ΔOD600nm均顯著高于對照菌株LGG（P＜0.05），表明菌株83、260、12E、15E和24E對膽鹽耐受性均優(yōu)于對照菌株LGG。

表1 不同乳酸菌對膽鹽的耐受性Table 1 Tolerance of different lactic acid bacteria to bile salts

2.3 模擬胃腸液耐受能力測定

由圖2可知，經模擬胃液與腸液消化3 h后，除在模擬腸液中菌株12E（70.56±0.07）%和15E（59.38±0.88）%存活率較低以外，其他菌株存活率均高于90%。說明試驗菌株均具有一定在腸液和胃液中存活的能力，使其以活菌形式進入腸道并且定殖發(fā)揮益生功效成為可能。

圖2 不同乳酸菌對模擬胃腸液的耐受性Fig.2 Tolerance of different lactic acid bacteria to simulated gastrointestinal fluid

2.4 抗生素敏感性測定

由表2可知，所有菌株對青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類均具有敏感性，大部分對氨基糖苷類抗生素不敏感，這是由于氨基糖苷類抗生素對大多數(shù)厭氧菌以及兼性厭氧菌無效且在酸性環(huán)境中抗菌活性較弱[21-22]。菌株12E、15E和24E對于青霉素類抗生素敏感性要略高于對照菌株LGG，其他菌株對于青霉素類抗生素敏感性與對照菌株LGG差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同乳酸菌抗生素敏感性比較Table 2 Comparison of antibiotic sensitivity of different lactic acid bacteria

2.5 抑菌活性測定

由圖3可知，所有菌株發(fā)酵上清液均具有一定的抑菌能力，抑菌圈直徑均＞10 mm。對于大腸桿菌抑菌效果較好的菌株為15E（17±0.71）mm、12E（15.5±1.41）mm；所有菌株對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑均＞20 mm，所有菌株對單增李斯特菌抑菌圈直徑均＞13 mm。

圖3 不同乳酸菌對大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of different lactic acid bacteria against Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus

2.6 表面特性研究

由圖4可知，所有菌株對不同溶劑均表現(xiàn)出一定的表面疏水性。十六烷試驗結果主要體現(xiàn)菌株表面疏水性，而乙酸乙酯試驗結果反應的是菌株表面的Lewis酸堿性[22]。其中在十六烷中表現(xiàn)出疏水性最高的為菌株83（87.88±0.25）%，其次為菌株24E（80.52±2.06）%。而所有菌株均與乙酸乙酯結合率較低，說明菌株細胞表面都具有良好的電子供體特性，這一結果與早先的報告一致[24-25]。

圖4 不同乳酸菌的疏水性比較Fig.4 Comparison of hydrophobicity of different lactic acid bacteria

2.7 黏附能力

由圖5可知，菌株黏附能力因菌株和種類的不同而不同，其中菌株24E黏附率最高（9.71±0.44）%，其次是菌株260（4.16±0.27）%，二者均高于對照菌株LGG（2±0.39）%；菌株12E和15E黏附能力較差，均低于1%。據(jù)報道，不同的乳桿菌對Caco-2細胞的粘附率在1%～14%之間，具有菌株特異性[18，24]。疏水性可以促進微生物與宿主細胞的首次接觸。然而，這種非特異性的相互作用較弱，許多研究證明疏水性與細菌粘附之間沒有相關性[12，17]。有研究表明，除了表面電荷之外，其他乳桿菌菌株可能通過不同的機制，如特定的粘附素，與相應的特異性受體相結合形成特異性黏附。這將需要進一步的研究來研究粘附素介導的特定相互作用的粘附機制。

圖5 不同乳酸菌的黏附能力比較Fig.5 Comparison of adhesion ability of different lactic acid bacteria

2.8 抗氧化能力

由表3可知，菌株對DPPH自由基、羥自由基的清除能力及總抗氧化能力三者之間并沒有必然聯(lián)系，這說明菌株抗氧化能力是多種機制的綜合作用。所有菌株發(fā)酵上清液均對DPPH自由基具有較強的清除能力，均在49%以上，與對照菌株LGG（55.32±2.55）%差異不顯著（P＞0.05）；菌株83、24E羥自由基清除率顯著低于對照菌株LGG（P＜0.05），菌株260、12E、15E羥自由基清除率與對照菌株LGG（31.34±9.83）%差異不顯著（P＞0.05）；所有菌株發(fā)酵上清液總抗氧化能力均顯著高于對照菌株LGG（4.67±1.17）μmol/mL（P＜0.05）。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵上清液抗氧化能力比較Table 3 Comparison of fermentation supernatant antioxidant capacity of different lactic acid bacteria

綜合黏附能力與抗氧化能力來看，鼠李糖乳桿菌260益生特性較優(yōu)，黏附能力較強，黏附率為4.16%；DPPH自由基清除能力56.36%、羥自由基的清除能力23.09%、總抗氧化能力（T-AOC）為5.26 μmol/mL。

3 結論

本研究通過對5株乳源性乳酸菌益生特性以及發(fā)酵上清液抗氧化活性進行評價，結果表明，5株乳桿菌均可在pH2、pH3，牛膽鹽含量0.1%～0.5%環(huán)境中生長，經模擬胃液與腸液消化3 h后，除菌株12E和15E在模擬腸液中存活率較低以外，其他菌株存活率均高于90%，對青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類抗生素均具有敏感性；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌具有一定的抑制能力，抑菌圈直徑均分別大于10 mm、20 mm、13 mm；其中鼠李糖乳桿菌260益生特性較優(yōu)，黏附能力較強，黏附率為4.16%，DPPH自由基清除能力56.36%、羥自由基的清除能力23.09%、總抗氧化能力（T-AOC）為5.26 μmol/mL，具有潛在的應用價值。由于抗氧化活性體外化學評價方法存在一定的局限性，不能全面的體現(xiàn)菌株的抗氧化活性和菌株在機體內的抗氧化作用。因此，還需要進一步對乳酸菌體內抗氧化活性進行探究。