醬香型白酒二輪次堆積酒醅微生物群落與理化指標(biāo)相關(guān)性研究

張春林，楊 亮，李 喆，甘廣東，何珺珺

（茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564501）

堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)的獨(dú)特工藝，高粱經(jīng)過蒸煮后，加入高溫大曲，在生產(chǎn)場(chǎng)地堆積發(fā)酵，再進(jìn)入窖池發(fā)酵，堆積時(shí)間根據(jù)季節(jié)、氣溫和工藝要求實(shí)時(shí)調(diào)整，最長可達(dá)到10 d以上。該工藝一方面是對(duì)酒曲中微生物擴(kuò)增，并網(wǎng)羅場(chǎng)地和空氣中的微生物，為后續(xù)的窖內(nèi)發(fā)酵工藝富集微生物，另一方面在多種微生物和酶類的共同作用下堆積酒醅產(chǎn)生了醬香型白酒的酒體風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體物質(zhì)，因此該過程也被稱之為“二次制曲”，對(duì)醬香風(fēng)味物質(zhì)的生成及酒精發(fā)酵至關(guān)重要[1-2]。

醬香型白酒的堆積的核心是微生物的富集和增殖。隨著技術(shù)的進(jìn)步，高通量測(cè)序技術(shù)已逐步成熟，并廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物群落的研究，包括醬油[3]、食醋[4]、黃酒[5]、濃香型[6]和清香型白酒[7]等。王鵬等[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)確定了白酒發(fā)酵過程中的核心微生物，揭示了環(huán)境因子與核心微生物群的相互關(guān)系。黃蘊(yùn)利等[9]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了傳統(tǒng)醬香型白酒堆積和窖池酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)酒醅中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬。WANG H等[10]采用高通量測(cè)序方法對(duì)醬香型白酒堆積酒醅一至七輪次130個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，鑒定真菌7個(gè)門158個(gè)屬，細(xì)菌27個(gè)門658個(gè)屬，不同輪次之間微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

在釀造過程中，溫度、酸度、水分、淀粉、還原糖等理化指標(biāo)對(duì)釀造微生物群落的豐度及變化規(guī)律有重要影響，如溫度因素通過調(diào)控大曲發(fā)酵前期微生物群落的演替規(guī)律而影響成品曲中微生物群落的組成[11]；窖池的水分、酒精和淀粉含量對(duì)于微生物群落有著調(diào)控作用，同時(shí)會(huì)影響最終酒體風(fēng)味[12]。二輪次作為取三輪次酒的前置輪次，酒醅內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)及理化特性將對(duì)后續(xù)輪次的發(fā)酵有直接影響，解析二輪次堆積發(fā)酵酒醅內(nèi)微生物群落及其與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，將為調(diào)控下一個(gè)輪次發(fā)酵、提高醬香型白酒產(chǎn)量及品質(zhì)起著重要作用。

本研究以醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵酒醅為研究對(duì)象，通過高通量測(cè)序技術(shù)解析堆積發(fā)酵過程中的酒醅微生物群落組成，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析揭示酒醅理化特性對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響。以期為醬香型白酒的釀造機(jī)理解析及發(fā)酵過程控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：樣品采集于茅臺(tái)某酒企1號(hào)車間的二輪次堆積發(fā)酵酒醅。堆積酒醅的采集時(shí)間為堆積發(fā)酵的第1～7天，即分別取堆積酒醅的上層樣品A為1號(hào)取樣點(diǎn)（堆積酒醅上層），中層樣品B由2、3取樣點(diǎn)混合后樣品（堆積酒醅中層），下層樣品C由4、5取樣點(diǎn)混合后樣品（堆積酒醅下層），再將A、B、C三個(gè)樣品混合形成一個(gè)樣品，置于-70 ℃條件下保存，分別記為D1、D2…D7[13]。

Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖、斐林試劑、次甲基藍(lán)指示劑、無水乙醇、濃鹽酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 2100生物分析儀：美國安捷倫公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司；DH-20008高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：上海德洋意邦儀器有限公司；ME204TE分析天平：梅特勒-托利多集團(tuán)；D-78224超聲波清洗儀：德國Elma公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅微生物多樣性檢測(cè)

酒醅樣本基因組提取采用試劑盒，取質(zhì)量合格的基因組樣品及對(duì)應(yīng)的融合引物配制反應(yīng)體系，開展聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，使用試劑盒磁珠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液，完成建庫。使用Agilent 2100 生物分析儀對(duì)片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。提取酒醅微生物總基因組后，分別對(duì)基因組16S V4區(qū)和ITS1區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序分析[16-17]。

1.3.2 酒醅理化指標(biāo)的檢測(cè)

每隔12 h（0 h、12 h、24 h、36 h…168 h）采集堆積酒醅上、中、下混合樣品測(cè)定酒醅理化指標(biāo)。水分、酸度、淀粉、還原糖測(cè)定：參考DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》[14]；酒醅溫度、粗蛋白測(cè)定：參照《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[15]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行理化指標(biāo)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅發(fā)酵過程中真菌微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.1.1 真菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

如表1所示，按照相似性將得到的樣品所對(duì)應(yīng)的分類序列條數(shù)歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中，OTU數(shù)量最多的是堆積發(fā)酵3 d的酒醅，共78個(gè)。所有樣品共有的真菌OTU數(shù)量為21。堆積發(fā)酵過程中酒醅樣品的物種豐富度的指標(biāo)（Chao 1指數(shù)）在42～82之間；物種多樣性指標(biāo)（Shannon指數(shù)）在1.43～1.91之間，堆積發(fā)酵5 d的Shannon指數(shù)達(dá)到最高值1.91。所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.999 7～0.999 9之間，測(cè)序結(jié)果能完整反映二輪次堆積發(fā)酵真菌菌群組成信息。

表1 酒醅真菌菌落測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of fungal community sequencing data of fermented grains

2.1.2 發(fā)酵過程中真菌群落的演替規(guī)律

如圖1所示，在醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵酒醅中共檢出4個(gè)門，包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和壺菌門（Chytridiomycota），其中子囊菌門相對(duì)豐度達(dá)94%以上，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。而擔(dān)子菌門在醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵酒醅中相對(duì)豐度為0.16%～5.55%。接合菌門含量較低，相對(duì)豐度約為0.03%～0.65%。壺菌門只在個(gè)別樣品中檢出。

圖1 門水平真菌群落結(jié)構(gòu)組成分布Fig.1 Distribution of fungal community structure at phylum level

二輪次堆積酒醅中共檢測(cè)出46個(gè)屬的真菌微生物，真菌微生物屬水平的群落組成如圖2所示，豐度＞1%的有8個(gè)屬，包括曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、裸胞殼屬（Emericella）、畢赤酵母屬（Pichia）、紅曲霉屬（Monascus）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。其中曲霉屬和紅曲霉屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，曲霉屬相對(duì)豐度為2.70%～50.02%，發(fā)酵前期繁殖迅速，成為優(yōu)勢(shì)菌，在第2天相對(duì)豐度最高。隨著溫度升高，曲霉屬相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵后期豐度逐漸降低。紅曲霉屬相對(duì)豐度為15.08%～52.47%，在第5天相對(duì)豐度達(dá)到峰值。假絲酵母屬相對(duì)豐度為0.01%～67.25%，在堆積發(fā)酵過程中其相對(duì)豐度持續(xù)增加，假絲酵母屬是醬香型白酒中的主要功能微生物，是醬香型白酒堆積發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌，在酒醅和大曲中均有檢出[18]。畢赤酵母屬相對(duì)豐度為0.26%～2.09%，在堆積發(fā)酵中期波動(dòng)增加，畢赤酵母屬屬于耐高溫酵母菌，是酒醅發(fā)酵過程中產(chǎn)乙醇和產(chǎn)酯的功能菌，雖有報(bào)道稱堆積發(fā)酵過程中酒醅中的畢赤酵母屬來自發(fā)酵環(huán)境[19]，但大曲中也存在畢赤酵母屬[20]，其具體來源還需進(jìn)一步探索。

圖2 屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)組成分布Fig.2 Distribution of fungal community structure at genus level

2.2 酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

酒醅細(xì)菌菌群測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見表2。由表2可知，其中堆積發(fā)酵6 d的酒醅中細(xì)菌的OTU數(shù)最多為243，所有樣品共有的細(xì)菌OTU數(shù)為65。堆積發(fā)酵過程中酒醅樣本的Chao 1指數(shù)在115～206之間；Shannon指數(shù)在2.40～2.80之間，堆積發(fā)酵第3天的Shannon指數(shù)最高，說明二輪次堆積3 d可使酒醅內(nèi)微生物多樣性達(dá)到最高。所有樣本的覆蓋率在0.999 2～0.999 7之間，測(cè)序結(jié)果能完整反映二輪次堆積發(fā)酵細(xì)菌菌群組成信息。

表2 酒醅細(xì)菌菌落測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of bacteria community sequencing data of fermented grains

2.2.2 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律

如圖3所示，二輪次醬香型白酒堆積酒醅中共檢出11個(gè)細(xì)菌門，包括放線菌門（Actinobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、泉古菌門（Crenarchaeota）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

圖3 門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure at phylum level

二輪次醬香型白酒堆積酒醅中共檢測(cè)出125個(gè)細(xì)菌屬微生物。如圖4所示，其中相對(duì)豐度＞1%的有7個(gè)屬，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、光岡菌屬（Mitsuokella）。其中，有3個(gè)屬豐度較高，是二輪次的主導(dǎo)菌屬，分別是芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬。其中高溫放線菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度為12.48%～30.64%，且隨著堆積發(fā)酵時(shí)間的延長，豐度逐漸增加。海洋芽孢桿菌屬相對(duì)豐度為10.04%～30.88%，豐度呈現(xiàn)先上升后下降最后穩(wěn)定的趨勢(shì)，相對(duì)豐度從最初的13.24%增加至30.88%，從第3天開始逐漸下降，后期相對(duì)豐度保持在10%左右。芽孢桿菌屬相對(duì)豐度為5.90%左右。

圖4 屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分布Fig.4 Distribution of bacterial community structure at genus level

芽孢桿菌屬是醬香白酒中醬香風(fēng)味物質(zhì)的主要代謝菌屬，能分泌蛋白酶、淀粉酶等水解酶類，分解原料形成豐富的發(fā)酵前體物質(zhì)，有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[21]。如熱乳桿菌具有分解蛋白質(zhì)和水解淀粉的能力，可產(chǎn)酸、增香、增加酒體的綿甜感。地衣芽孢桿菌能生成如吡嗪類、芳香類、酸類及酚類化合物等風(fēng)味物質(zhì)[22]，賦予了醬香型白酒獨(dú)特的風(fēng)格及健康因子。海洋芽孢桿菌屬屬于芽孢桿菌科，該屬主要分布于深海環(huán)境、發(fā)酵食品環(huán)境[23]，某些物種可用于氧化酶、淀粉酶、過氧化氫酶、酯酶和脲酶等工業(yè)酶制劑生產(chǎn)[24]。該菌屬是醬香型白酒高溫大曲制曲過程中第二次翻曲階段的功能微生物，但具體的釀造功能未見報(bào)道[25]。

2.3 堆積發(fā)酵過程中理化指標(biāo)分析

在醬香型白酒酒醅堆積過程中，水分、溫度、總酸、蛋白質(zhì)、淀粉含量、還原糖等理化指標(biāo)隨著堆積時(shí)間發(fā)生變化，并影響微生物的代謝和風(fēng)味物質(zhì)的形成。

水分是醬香型白酒生產(chǎn)過程中重點(diǎn)控制的工藝參數(shù)[26]。水分過高，堆積酒醅透氣性差，好氧性微生物生長受到抑制，厭氧菌含量增加，導(dǎo)致酒醅酸敗[27]。水分過低，微生物的代謝受抑制，影響酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。如圖5所示，二輪次酒醅在堆積過程中水分含量在47%～50%之間，在0～84 h其呈下降趨勢(shì)，在84～168 h呈上升趨勢(shì)，前期隨著發(fā)酵溫度的升高，水分蒸發(fā)速度增加，水分含量下降，后期伴隨著微生物的大量繁殖和淀粉降解，水分含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。

圖5 二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)變化情況Fig.5 Changes of physical and chemical indexes of fermented grains during the second rounds stacking fermentation

蛋白質(zhì)是釀造過程中微生物的主要氮物質(zhì)來源，具有形成風(fēng)味物質(zhì)、促進(jìn)美拉德反應(yīng)以及酒體風(fēng)味特征形成等功能[28]。在二輪次堆積發(fā)酵過程中，酒醅中的粗蛋白呈上升的趨勢(shì)，含量從6.16%增加至6.99%。

淀粉是釀造過程中微生物生長繁殖的能量來源，淀粉含量高低與出酒率成正比。由圖5可知，在二輪次堆積發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酒醅中淀粉含量逐漸下降，從27.88%下降至24.73%，淀粉逐漸被微生物分解。

由淀粉等多糖物質(zhì)水解可形成還原糖。酒醅中還原糖含量的變化情況基本上反映了糖化與發(fā)酵速度的平衡與協(xié)調(diào)。如圖5所示，還原糖含量在二輪次堆積過程中呈明顯的上升趨勢(shì)，含量從0.65%上升至1.00%。

在堆積發(fā)酵過程中，酸物質(zhì)含量呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。如圖5所示，在堆積發(fā)酵前期細(xì)菌大量生長繁殖并分泌有機(jī)酸，酒醅酸度緩慢上升。酒醅堆積48 h后，由于堆積溫度的上升，產(chǎn)酸微生物代謝活動(dòng)被抑制，且有機(jī)酸在酯類等風(fēng)味物質(zhì)的合成過程中被消耗，在堆積后期酒醅中酸度呈下降趨勢(shì)。

溫度是評(píng)價(jià)高溫堆積成效的重要指標(biāo)之一[29]，當(dāng)堆積酒醅頂溫達(dá)到50 ℃左右進(jìn)入窖池發(fā)酵，適宜的溫度有助于酒體風(fēng)味的形成和質(zhì)量的提高。如圖5所示，在二輪次堆積發(fā)酵過程中，伴隨著微生物的大量生長代謝所釋放的熱量使堆溫持續(xù)升高，頂溫達(dá)到50 ℃以上。

2.4 理化指標(biāo)與微生物群落相關(guān)性分析

為了探究堆積發(fā)酵過程中微生物之間相互作用關(guān)系，以及酒醅理化指標(biāo)對(duì)酒醅微生物多樣性的影響，利用SPSS軟件對(duì)酒醅優(yōu)勢(shì)微生物屬（相對(duì)豐度＞1%）和酒醅樣品的理化指標(biāo)（水分、粗蛋白、淀粉、總酸、溫度和還原糖）進(jìn)行斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)性分析并計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 堆積發(fā)酵酒醅中理化指標(biāo)與優(yōu)勢(shì)微生物屬的相關(guān)性Table 3 Correlation between physicochemical parameters and dominant microbial genera in fermented grains during stacking fermentation

結(jié)果表明，粗蛋白含量與裸胞殼屬、畢赤酵母屬的豐度呈負(fù)相關(guān)，與假絲酵母屬的豐度呈正相關(guān)，其中粗蛋白含量與裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。淀粉、總酸含量與海洋芽孢桿菌屬、曲霉屬、裸胞殼屬、畢赤酵母屬、節(jié)擔(dān)菌屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，其中淀粉含量與曲霉屬、裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），總酸含量與海洋芽孢桿菌屬、曲霉屬、裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。溫度與假絲酵母屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，與裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，其中溫度與裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。還原糖含量與海洋芽孢桿菌屬、假絲酵母屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，與裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，其中還原糖含量與裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。在堆積過程，水分、粗蛋白、淀粉、總酸、溫度、還原糖等指標(biāo)都在發(fā)生變化，影響著微生物的繁殖和代謝，同時(shí)這些條件也受到微生物繁殖和代謝的影響。通過研究分析，將微生物群落與理化指標(biāo)變化規(guī)律相關(guān)聯(lián)，對(duì)闡明堆積工藝的釀造機(jī)理，提高醬香型白酒品質(zhì)和發(fā)酵效率具有重要意義。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序法分析醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品中的微生物組成，并采用多元統(tǒng)計(jì)分析探討了理化因子對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的影響。共檢測(cè)出171個(gè)屬微生物，其中包括125個(gè)屬細(xì)菌，46個(gè)屬真菌。發(fā)酵過程中真菌以曲霉屬，假絲酵母屬，裸胞殼屬，畢赤酵母屬，紅曲霉屬，毛孢子菌屬，節(jié)擔(dān)菌屬，威克漢姆酵母屬等為主；細(xì)菌以芽孢桿菌屬，乳桿菌屬，海洋芽孢桿菌屬，高溫放線菌屬，枝芽孢菌屬、片球菌屬，光岡菌屬等為主。相關(guān)性分析結(jié)果表明，粗蛋白含量與裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），淀粉含量與曲霉屬、裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），總酸含量與海洋芽孢桿菌屬、曲霉屬、裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），溫度與裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，還原糖含量與裸胞殼屬的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），水分含量與微生物多樣性之間相關(guān)性不顯著。本研究初步推斷了環(huán)境因子對(duì)群落驅(qū)動(dòng)作用，后續(xù)將從功能層面，采用多組學(xué)技術(shù)，揭示堆積發(fā)酵過程中微生物的功能貢獻(xiàn)，為關(guān)鍵功能菌的挖掘及堆積發(fā)酵的調(diào)控提供理論依據(jù)。