桑黃提取物的制備工藝及凍干粉抗氧化、抑菌活性的研究

龔蘭敏，劉剛*，白杰，劉德龍，何揚(yáng)航

（1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,食品功能及加工應(yīng)用研究所，四川 成都 610101；2.成都市益康堂藥業(yè)有限公司，四川 成都 610509）

桑黃（Phellinus igniarius）是一類大型的珍稀藥用真菌，屬于銹革孔菌科木層孔菌屬，主要寄生于闊葉樹(shù)樹(shù)種，常分布于中國(guó)、韓國(guó)和日本[1]，據(jù)《中藥大辭典》記載“桑黃可用于痢疾、閉經(jīng)、瀉血、血崩、淋病等疾病的治療”，具有悠久的中醫(yī)應(yīng)用歷史[2]，享有“森林黃金”美稱，功能多樣。桑黃富含生物活性成分，如糖類、萜類、黃酮類、氨基酸等，目前研究表明桑黃具有抗腫瘤[3]、降低血糖濃度、預(yù)防糖尿病[4]、提高免疫力[5]等作用，其中桑黃多糖和總?cè)瞥煞志哂辛己玫目寡趸痆6]、抗菌[7]、抗癌等作用[8-10]，具有較好的藥用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。

可食用酵素是以新鮮果蔬、谷物、中草藥等為原料，在多種有益菌的自然條件下發(fā)酵產(chǎn)出的含有豐富的有機(jī)酸、維生素、萜類物等功能成分的混合發(fā)酵液，可催化新陳代謝、養(yǎng)分和能量轉(zhuǎn)化等作用，但不會(huì)使其物質(zhì)及生化反應(yīng)造成改變，酵素具有解酒護(hù)肝、提高免疫力、抗氧化等功能[11]。

酵素起源于日本，在日本發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)成熟，在歐洲、加拿大等地也開(kāi)始盛行，而在中國(guó)仍處于低潮期[12]。目前關(guān)于桑黃液態(tài)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)主是中藥發(fā)酵與藥酒生產(chǎn)，而通過(guò)添加酵素制備桑黃口服液是一種較新的思路?；诖耍驹囼?yàn)以桑黃為原材料，采用諾麗果酵素和木瓜酵素發(fā)酵，研究桑黃功效成分的最佳提取條件，測(cè)定不同提取條件下桑黃提取液核酸、總?cè)?、多糖等含量，研究其水提和醇提物的抗氧化和抑菌活性，使桑黃有效成分得到更好的開(kāi)發(fā)利用，有望成為促進(jìn)人類健康的新型功能性食品。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃、諾麗果酵素、木瓜酵素：成都益康堂公司；黃酒：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器

乙酸乙酯、乙醇、高氯酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、香草醛、冰醋酸、無(wú)水葡萄糖（均為分析純）：成都市科隆化工試劑廠；硫酸（分析純）：四川西隴化工有限公司；三氯乙酸（分析純）、白樺酯醇標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-nitro-henylhydrazine，DPPH）（純度 99%）：成都碩博研創(chuàng)公司；牛肉膏蛋白胨（LB）培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司。

FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)：江蘇天翎儀器有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠制造；HKC-40A型超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司；BioMate 3S型紫外分光光度計(jì)：Thermo公司；JA5003型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黃提取液的制備

參考文獻(xiàn)[13]，進(jìn)行桑黃功效成分的提取。稱取6份過(guò)100目篩的桑黃粉末500 g，分為兩組，料液比1∶6（g/mL）。一組樣品進(jìn)行水提，一組樣品進(jìn)行醇提（黃酒）。水提直接使用煎煮法進(jìn)行桑黃成分的提取。醇提使用黃酒進(jìn)行提取。

水提、乙醇提組內(nèi)合并濾液各得1000mL，不同提取方式的桑黃濾液各取6個(gè)100 mL樣品，3個(gè)樣品中分別加入木瓜酵素30 mL、3個(gè)樣品中分別加入諾麗果酵素30mL（按照3kg桑黃，加入180 mL酵素計(jì)算），得4種配方桑黃提取液（計(jì)算提取液得率）[13]。

以抽真空的方式使樣品中水分直接升華，進(jìn)而濃縮桑黃提取液，分別于冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，稱量記錄（計(jì)算凍干粉得率）。計(jì)算提取液和凍干粉的得率公式如下。

1.3.2 桑黃提取液多糖含量的測(cè)定

桑黃提取液的多糖含量是其總糖含量與還原糖含量的差值，按下列方法測(cè)定總糖、還原糖的含量。

用硫酸-苯酚法[14-15]測(cè)定總糖的含量：準(zhǔn)確稱取烘干后無(wú)水葡萄糖50 mg置于500 mL容量瓶，蒸餾水溶解、定容，搖勻。加蒸餾水配制成濃度梯度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，各加5%的苯酚1 mL，并迅速加入5 mL濃H2SO4，25℃靜置10 min后搖勻，再放置30 min，于490 nm處測(cè)定OD值，作總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為y=10.364x+0.089 4，R2=0.997 2，線性關(guān)系良好，可用于測(cè)定總糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 測(cè)定桑黃總糖、還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Determination of the standard curve of P.igniarius total sugar and reducing sugar

用3，5-二硝基水楊酸法[16]測(cè)定還原糖的含量：準(zhǔn)確稱取烘干后無(wú)水葡萄糖1 g于1 000 mL容量瓶，定容后搖勻。分別取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于6支試管中，補(bǔ)蒸餾水至0.5 mL，分別加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，5 min沸水浴后立即用冷水冷卻，加蒸餾水至6 mL，混勻，在540 nm處測(cè)吸光度值，作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 y=3.866 5x+0.004 4，R2=0.990 8，線性關(guān)系良好，可用于測(cè)定還原糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.3.3 桑黃提取液總?cè)坪康臏y(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[17]，測(cè)定桑黃提取液總?cè)频暮浚壕芊Q取白樺酯醇標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g，95%乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻即得濃度0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別置于編號(hào)為0～6的10 mL離心管中，70℃水浴蒸干。加0.20 mL新配制的5%香草醛冰醋酸溶液，再加入高氯酸0.80 mL，搖勻，70℃恒溫水浴20 min，立即冷水冷卻，用乙酸乙酯定容至5 mL，搖勻，在551 nm處測(cè)定OD值。以0號(hào)管為對(duì)照，繪制總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為y=11.726x+0.015 5，R2=0.995，線性關(guān)系良好，可以用于測(cè)定口服液的總?cè)坪?。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 測(cè)定總?cè)坪康臉?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of total triterpenes

1.3.4 桑黃提取液核酸含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]，用朗伯-比爾光吸收定律測(cè)定桑黃提取液的核酸的含量：核酸嘌呤和嘧啶間的共軛雙鍵，在260 nm處具有最大的吸收峰，測(cè)定產(chǎn)品中的核酸含量。

1.3.5 桑黃凍干粉DPPH自由基清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]，測(cè)定清除DPPH自由基的能力。分別精密吸取水提、醇提的桑黃提取液各0.1 mL，加95%乙醇至3 mL，混勻后加3 mL DPPH自由基溶液，搖勻，25℃避光放置30 min，在517 nm處測(cè)定OD值（Ai）。分別精密吸取水提、醇提的桑黃提取液各0.1mL，加95%乙醇至6 mL，搖勻，于室溫（25℃）避光放置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定OD值（Aj）。精密吸取3 mL 95%乙醇溶液和3 mL DPPH溶液置于試管，25℃避光放置30 min，在517 nm處測(cè)定OD（Ae）值。每組試驗(yàn)3個(gè)平行，DPPH自由基清除率（I）的計(jì)算公式如下。

根據(jù)不同提取物的濃度與清除率間關(guān)系，計(jì)算出IC50值，比較該值的大小。IC50值越低，抗氧化劑的DPPH自由基清除能力越強(qiáng)，抗氧化性就越好。

1.3.6 桑黃凍干粉Fe3+還原活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20-21]，測(cè)定還原能力，精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 的 0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入95%乙醇至1mL，再依次加入2.5 mL磷酸緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后封口，置50℃水浴20 min；然后快速冷卻，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，4 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，于700 nm測(cè)定OD值。作還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為y=0.810 1x+0.221 5，R2=0.998 6，線性關(guān)系良好，可用于測(cè)定桑黃產(chǎn)品的還原能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 測(cè)定還原能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve for determination of reduction capacity

再根據(jù)不同提取物的濃度與還原能力關(guān)系，計(jì)算出IC50值，比較該值的大小。IC50值越低，抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)。

1.3.7 桑黃凍干粉抑菌作用的測(cè)定

菌種的活化及菌懸液的制備，參考張倩等[22]、魏思敏等[23]的方法稍加改進(jìn)。分別取100 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌低溫保存菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，于35℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化。再分別取活化的菌液5 mL于離心管，4℃、12 000 r/min條件下離心2 min得到菌體沉淀。然后加無(wú)菌生理鹽水懸浮，最后稀釋得到107CFU/mL～108CFU/mL的菌懸液，振蕩均勻備用。

參考最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定方法[24-25]：將 pH7 的 LB 液體培養(yǎng)基分裝24支試管，每管各3 mL，高壓蒸氣121℃滅菌20 min。以二倍稀釋法進(jìn)行無(wú)菌操作，每3根試管為一組，分別加入20 mg/mL的桑黃凍干粉樣品液3 mL，搖勻，平行吸取3 mL于下一組試管，依次類推，至第6組試管棄去3 mL液體，每組2根試管中加入0.2 mL菌液，1根試管加0.2 mL液體（水提組加無(wú)菌水，醇提組加95%乙醇）作為組內(nèi)空白。第7組試管加0.2 mL液體（水提組加無(wú)菌水，醇提組加95%乙醇）作為試驗(yàn)空白組，第8組加入0.2 mL菌液作為陰性對(duì)照。將試管充分搖勻，置于35℃培養(yǎng)24 h，觀察濁度并于600 nm處測(cè)定OD值。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 25.0軟件先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性的進(jìn)行方差分析，圖用Origin 9、Excel繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備工藝對(duì)桑黃提取液得率和凍干粉得率的影響

比較4種制備方法桑黃口服液得率、凍干粉得率的不同影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，得到各組的P＞0.05，符合正態(tài)性，可選擇單因素方差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異性的比較用法，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 桑黃提取液得率的比較（n=3）Table 1Yield of P.igniarius extract（n=3）

如表1所示，4種不同提取方式對(duì)桑黃提取液得率無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。提取液凍干后，各組間凍干粉的得率有極顯著性差異性（P≤0.01），其中，“醇提桑黃+木瓜酵素”凍干粉得率最高為（2.07±0.002）%，“桑黃+諾麗果酵素”水提液的得率最低為（0.21±0.002）%。

2.2 制備工藝對(duì)桑黃提取液液多糖含量的影響

測(cè)定4種不同提取工藝制備的樣品溶液OD490nm值，根據(jù)建立的回歸方程得到各樣品的多糖含量。各組經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，均有P＞0.05，符合正態(tài)性，因此可選擇單因素方差分析，比較各組間多糖含量差異的顯著性用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 桑黃提取液的多糖含量（n=3）Table 2 Extract of polysaccharide from P.igniarius（n=3）

如表2所示，與桑黃水提或醇提后加入諾麗果酵素比較，桑黃水提或醇提后加入木瓜酵素，提取液多糖含量的差異性極顯著（P=0.001≤0.01），桑黃水提或醇提后加入同種酵素，提取液多糖含量的差異性不顯著（P＞0.05）。即不同提取工藝，桑黃水提、乙醇的提取液中，加入木瓜酵素后的多糖含量差異性不顯著（P=0.883＞0.05），加入諾麗果酵素后的多糖含量差異性也不顯著（P=0.076＞0.05）。4種不同提取工藝中，提取液多糖含量最高的為“桑黃水提后加入木瓜酵素”，為（6.04±0.35）mg/mL，最低為“桑黃水提后加入諾麗果酵素”的（0.54±0.48）mg/mL。

2.3 生產(chǎn)工藝對(duì)提取液總?cè)坪康挠绊?/h3>

測(cè)定4種不同提取工藝制備的樣品溶液OD551nm值，根據(jù)建立的回歸方程得到各樣品的總?cè)坪俊８鹘M經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，均有P＞0.05，因此符合正態(tài)性，可選擇“單因素方差分析”分析4種提取方式桑黃提取液的總?cè)坪坑袩o(wú)顯著差異，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 桑黃提取物總?cè)频暮浚╪=3）Table 3 Extract of total triterpenoid from P.igniarius（n=3）

如表3所示，除“水提后加入木瓜酵素”和“水提加入諾麗果酵素”組間差異性不顯著（P=0.244＞0.05）外，其他組間的差異性均為極顯著（P=0.000≤0.01）。其中，“醇提后加入木瓜酵素”的桑黃提取液的總?cè)坪孔罡遊（1.77±0.061）mg/mL]，“水提后加入諾麗果酵素”的提取液，總?cè)坪孔畹蚚（0.73±0.013）mg/mL]。

2.4 制備工藝對(duì)桑黃提取液液核酸含量的影響

分析4種提取方式桑黃提取液核酸含量有無(wú)顯著差異，各組經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，均有P＞0.05，因此符合正態(tài)性，可選擇單因素方差分析，組間比較用LSD法，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 桑黃提取液的核酸含量（n=3）Table 4 Extract of nucleic acid from P.igniarius（n=3）

如表4所示，“醇提后加入諾麗果酵素”組與“水提后加入木瓜酵素”存在顯著性差異（P=0.015≤0.05），“醇提后加入諾麗果酵素”組與“水提后加入諾麗果酵素”存在顯著性差異（P=0.029≤0.05），而“醇提后加入諾麗果酵素或木瓜酵素”組間不存在差異（P=0.422＞0.05）。其中“水提后加入木瓜酵素”桑黃提取液的核酸含量最高，為（210.70±7.23）μg/mL，“醇提后加入諾麗果酵素”組桑黃提取液的核酸含量最低，為（195.81±2.20）μg/mL。

2.5 桑黃凍干粉DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基是一種以氮為中心的活潑自由基，在抗氧化劑存在時(shí)能迅速地與之配對(duì)并被其清除，是實(shí)驗(yàn)室鑒定抗氧化能力常用的研究方法之一[26]。用其測(cè)定水提、醇提的桑黃提取液凍干粉的抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 桑黃凍干粉清除DPPH自由基的活性Fig.4 Activity of DPPH free radical eliminating of P.igniarius lyophilized powder

如圖4所示，隨著樣品濃度的升高，桑黃提取液凍干粉的清除能力增強(qiáng)，濃度與清除能力均呈現(xiàn)正相關(guān)。在相同的濃度（12.50 mg/mL）下，DPPH自由基的清除率有差異，醇提的為62.10%、水提的為9.79%，因此，桑黃提取液DPPH自由基清除能力，醇提明顯高于水提，桑黃用醇提表現(xiàn)出更良好的抗氧化活性。

2.6 桑黃對(duì)Fe3+還原活性的影響

桑黃提取液Fe3+還原活性，表明桑黃提取液的總還原能力，可用來(lái)表明樣品的抗氧化能力[27]。因此是實(shí)驗(yàn)室測(cè)定抗氧化能力常用的研究方法之一，用其測(cè)定水提、醇提的桑黃提取液凍干粉的抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 桑黃凍干粉Fe3+還原活性Fig.5 Activity of Fe3+reducing capacity of P.igniarius lyophilized powder

如圖5所示，隨著樣品濃度的升高，水提和醇提兩種提取方式的桑黃提取液，還原能力都增加，濃度與還原力均呈現(xiàn)正相關(guān)。在相同濃度（125.0mg/mL），F(xiàn)e3+還原活性，醇提為55.61%，水提為24.46%，醇提明顯高于水提，說(shuō)明桑黃醇提取液清除Fe3+還原活性明顯高于水提，因此，桑黃醇提比水提表現(xiàn)出更良好的抗氧化活性。

2.7 桑黃凍干粉對(duì)抑菌活性的影響

經(jīng)比濁法測(cè)定抑菌作用的方法得，水提和醇提桑黃提取液凍干粉分別測(cè)定對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同桑黃凍干粉對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌率變化Fig.6 Inhabition rate of E.coli and S.aureus of P.igniarius lyophilized powder

如圖6所示，桑黃提取液的濃度-抑菌能力呈現(xiàn)正相關(guān)。研究表明，桑黃水提物濃度（2.5 mg/mL）對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率為30%，對(duì)大腸桿菌的抑制率為31%。而桑黃醇提物濃度（2.5 mg/mL）對(duì)大腸桿菌的抑制率為100%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率為54%。證實(shí)在不同提取方式相同濃度下，醇提對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較良好的抑菌活性并且抑菌活性醇提強(qiáng)于水提。

3 結(jié)論

桑黃的藥用功效成分最早記載于《本草綱木》，具有化飲、止血、止瀉、活血等功效[28]，其良好的藥效作用被大量報(bào)道，但是，缺少工藝條件對(duì)功效成分、功能的影響研究。氧化損傷是引起衰老、細(xì)胞癌變的原因之一，天然低毒的抗氧化抑菌產(chǎn)品，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。本試驗(yàn)研究桑黃提取液的提取工藝，對(duì)功效成分、抗氧化和抑菌活性的影響，優(yōu)化桑黃提取液的提取工藝，以便在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中發(fā)揮更有效的作用。

研究結(jié)果表明，桑黃提取液的4種制備方式對(duì)提取液的得率無(wú)顯著性影響，但是，凍干粉的得率中，“醇提后加入木瓜酵素”組最高（2.07%），“水提后加入諾麗果酵素”組最低（0.21%），組間具有極顯著性差異。桑黃提取液4種制備方式中，水提后加入木瓜酵素的桑黃多糖（6.04 mg/mL）和核酸（210.70 mg/mL）含量最高，“水提后加入諾麗果酵素”多糖含量最低（0.54 mg/mL），“醇提后加入諾麗果酵素”核酸含量最低（195.81 mg/mL）?！按继岷蠹尤肽竟辖退亍钡目?cè)坪孔罡撸?.77 mg/mL），“水提后加入諾麗果酵素”總?cè)坪孔畹停?.73 mg/mL）。

研究結(jié)果表明，桑黃提取液的抗氧化和抑菌功能與工藝有關(guān)。用DPPH法和Fe3+還原活性法比較桑黃水提和醇提的抗氧化活性，結(jié)果表明，醇提DPPH自由基清除能力IC50=9.90 mg/mL，F(xiàn)e3+還原活性IC50=10.58 mg/mL，因此醇提桑黃提取物抗氧化活性顯著高于水提。用比濁法比較桑黃醇提和水提的抑菌活性，結(jié)果表明，桑黃對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均具有抑菌效果，醇提桑黃提取物抑菌活性顯著高于水提，且醇提提取物對(duì)革蘭氏陰性（大腸桿菌）抗菌活性更顯著。