肝癌細(xì)胞免疫治療進(jìn)展

楊 帆(綜述)，張 琪陳規(guī)劃(審校)

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院生物治療中心，廣州 510630;2.肝臟疾病生物治療臨床轉(zhuǎn)化廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510630;3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝臟外科，廣州 510630

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(肝癌，hepatocellular cell carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，目前主要治療方法有手術(shù)治療、放療、化療及綜合治療等。由于肝癌起病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，確診時(shí)已達(dá)晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使是手術(shù)切除后也容易復(fù)發(fā)，缺乏有效的治療藥物和手段，總的治療效果并不理想。生物治療作為繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第四種模式，已顯示出了良好的應(yīng)用前景。目前生物治療主要包括腫瘤非特異性小分子化合物免疫治療、過繼免疫治療、腫瘤疫苗治療、腫瘤單克隆抗體的免疫治療、分子靶向治療和基因治療等［2］。細(xì)胞免疫治療是指根據(jù)免疫學(xué)原理，利用細(xì)胞治療肝癌，它是生物治療的重要組成部分，受到越來越多的關(guān)注。細(xì)胞免疫治療按其作用機(jī)制又分為兩類:(1)給患者回輸經(jīng)過體外激活和擴(kuò)增至一定數(shù)量后具有內(nèi)在抗腫瘤活性的自體免疫細(xì)胞，在體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤，ACT 的治療方法屬于被動(dòng)細(xì)胞免疫治療;(2)給患者回輸能在體內(nèi)激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞如回輸樹突狀細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞，屬于主動(dòng)細(xì)胞免疫治療。本文就肝癌常用的細(xì)胞免疫治療研究現(xiàn)狀和進(jìn)展作一概述。

1 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)

CIK 細(xì)胞是人單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型分析發(fā)現(xiàn)CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞較多，尤其是CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞。CIK 細(xì)胞同時(shí)具有T細(xì)胞和NK 細(xì)胞的標(biāo)志［3］。Schmidt-Wolf［4］實(shí)驗(yàn)證明，CIK 細(xì)胞起源于CD3+T 細(xì)胞而非CD56+NK 細(xì)胞。該細(xì)胞群是在多種細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ 及某些單克隆抗體(Anti-CD3McAb)的刺激下，由從外周血、骨髓或臍血中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增而成，具有廣泛的非MHC 限制的、極強(qiáng)的溶瘤活性［5］。由于CIK 細(xì)胞具有高增殖能力和高細(xì)胞毒力且對正常骨髓細(xì)胞抑制輕微，可用于惡性腫瘤的細(xì)胞過繼免疫治療和自體造血干細(xì)胞移植時(shí)微小殘留病的凈化。

Huang 等［6］比較CIK 聯(lián)合經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)及射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)，與單獨(dú)序貫使用TACE 及RFA 對于肝癌的治療效果，HCC患者分為兩組，85 名患者接受TACE +RFA +CIK聯(lián)合治療，89 名患者接受TACE +RFA 治療，總體有效率分別為76.5%及79.8%。疾病控制率分別是95.3%及88.8%，結(jié)果并沒有顯著的差異，然而Kaplan-Meier 分析顯示TACE +RFA +CIK 組比起TACE+RFA 組有更長的生存期(分別是56個(gè)月及31個(gè)月，P=0.001)，CIK 細(xì)胞治療組患者沒有發(fā)生嚴(yán)重的副作用。因此，作者認(rèn)為CIK 細(xì)胞治療是HCC 患者TACE 及RFA 之后防治肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)重要的治療手段，它能夠有效地提高患者的生活質(zhì)量。Cui 等［7］對比了HCC 患者RFA 治療及聯(lián)合使用CIK 治療，同樣提示CIK 治療是一種安全有效的治療方式，能夠防止RFA 治療后HCC 的復(fù)發(fā)。Ma 等［8］為了探討CIK 對于肝癌患者的作用，對一系列CIK 隨機(jī)的臨床Ⅱ、Ⅲ期試驗(yàn)利用肝癌和CIK 細(xì)胞作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，分析結(jié)果表明CIK細(xì)胞治療對于肝癌有明顯的生存受益，對比CIK 及未進(jìn)行CIK 組，CIK 治療組顯示出更長的無疾病進(jìn)展生存，更好的疾病控制率和總反應(yīng)率;同時(shí)CIK治療組病人顯示出更好的生活質(zhì)量，HBV-DNA 的病毒載量及AFP 水平有明顯下降，另外對比了周圍血T 淋巴細(xì)胞的亞型，發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+、CD4+CD8+及CD3+CD4+T 細(xì)胞均高于未進(jìn)行CIK 細(xì)胞治療組。

2 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)

1986年Rosenberg 等［9］描述了一類從腫瘤組織中分離出來的具有殺腫瘤細(xì)胞特性的淋巴細(xì)胞，為CD3+CD56－CD8+的免疫表型，具有抗癌活性的T 淋巴細(xì)胞，并命名為腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。TIL 細(xì)胞是從手術(shù)切下腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結(jié)、癌性胸腹水中獲得淋巴細(xì)胞，經(jīng)加IL-2 培養(yǎng)后，具有高效、特異、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，對腫瘤細(xì)胞的殺傷有MHC 限制性，殺傷活性較淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokine-activated killer cells，LAK 細(xì)胞)強(qiáng)［10］。國內(nèi)外學(xué)者一系列研究表明HCC 患者TIL 浸潤的預(yù)后明顯優(yōu)于沒有明顯TIL 浸潤［11］。HCC 術(shù)后易于復(fù)發(fā)，為了探討術(shù)后的TIL 免疫治療是否降低癌癥的復(fù)發(fā)，Takayama T 等［12］通過對150 名手術(shù)切除HCC 患者進(jìn)行過繼免疫治療，研究結(jié)果表明免疫治療明顯延長患者的生存期，同時(shí)減少HCC 復(fù)發(fā)。

提高TIL 殺傷功能的方法主要通過對T 細(xì)胞進(jìn)行改造，具體方法有如下兩種。第一種方法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對T 細(xì)胞進(jìn)行改造，克隆抗原特異性TCR 基因，通過病毒轉(zhuǎn)染使其在T 細(xì)胞表面高表達(dá)，改變抗原特異性T 細(xì)胞受體的α 及β 鏈，可有效提高其識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。Gehring等［13］為了研究是否TCR 基因的改變能夠重新建立慢性HBV 患者的特異性的T 細(xì)胞免疫，同時(shí)探討HBV-DNA 整合的HCC 細(xì)胞能否被基因改造的T細(xì)胞識別。應(yīng)用載體介導(dǎo)的，HBV 特異性的TCR插入到T 細(xì)胞表面，研究結(jié)果表明經(jīng)過改造的T 細(xì)胞能夠靶向殺傷HBV 相關(guān)性HCC。由于利用病毒載體來插入外源性的HBV 特異性的TCR 到T 細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中比較復(fù)雜且昂貴，同時(shí)對于HBV 持續(xù)感染的患者有插入突變及潛在毒性的風(fēng)險(xiǎn)。Koh等［14］研發(fā)出一種更加安全實(shí)用的方法來治療HCC，他們利用電轉(zhuǎn)染編碼抗HBV 的TCR 的mRNA，24 h 后，80%的CD8+T 細(xì)胞表達(dá)出HBV 的TCR，表達(dá)的效率明顯高于通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(18%)。在HCC 異種移植物模型中，TCR 電轉(zhuǎn)的T 細(xì)胞有效的防止腫瘤的增殖及抑制腫瘤的生長。

第二種方法為嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾TCR，將T 細(xì)胞表面TCR 改造為CAR。CAR 技術(shù)的基本原理是通過基因工程技術(shù)將識別腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的單鏈抗體(scFv)和T 細(xì)胞的活化序列在體外進(jìn)行基因重組，形成重組質(zhì)粒，在體外通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)染經(jīng)純化與大規(guī)模擴(kuò)增后的T 細(xì)胞，稱之為CAR-T 細(xì)胞，使淋巴細(xì)胞能通過非MHC 限制性的方式識別特定抗原，增強(qiáng)其識別和殺傷腫瘤的能力。CAR 的基本骨架包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3 部分，胞外區(qū)主要是單克隆抗體的單鏈可變區(qū)序列(scFv)，抑或激素的信號肽細(xì)胞因子膜受體的胞外區(qū)等;胞內(nèi)區(qū)為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分，主要是T 細(xì)胞受體(TCR)/CD3 的鏈免疫球蛋白Fc 受體Fc R I 的鏈或CD3-鏈;而跨膜區(qū)可來源于同一分子或?yàn)? 型跨膜蛋白，如CD4，CD8 或CD28［15］。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，CAR 現(xiàn)已有三代，第一代CAR 并不能延長T 細(xì)胞的生存時(shí)間;第二代CAR 增加了共刺激信號如CD28、CD137(41-BB)、CD134(OX40)、ICOS 等，以刺激T 細(xì)胞的增殖，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明第二代CAR-T 細(xì)胞的功能較第一代明顯增強(qiáng);第三代CAR 整合了2個(gè)以上的共刺激分子以期望能進(jìn)一步增強(qiáng)T 細(xì)胞的活化［16，17］為了研究表達(dá)有乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)特異性受體的T 細(xì)胞能否直接殺傷HBV 病毒，將CD8+T 細(xì)胞表面TCR 改造成連有HBV 膜蛋白嵌合抗原受體，并將改造后的CD8+細(xì)胞回輸HBV 感染小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠很好地抑制HBV 的復(fù)制，同時(shí)對于小鼠肝臟的損傷小，這種CAR 改造的T細(xì)胞能夠不僅僅能有效清除HBV，同時(shí)有助于防止肝癌的進(jìn)展。

3 自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞

NK 是細(xì)胞瑞典免疫學(xué)家Kiessling 在20 世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一類大顆粒淋巴細(xì)胞，它是天然免疫的主要細(xì)胞，具有抗腫瘤，抗感染和免疫調(diào)節(jié)等功能。人的NK 細(xì)胞是CD3－CD56+淋巴細(xì)胞。目前有關(guān)NK 細(xì)胞在腫瘤免疫治療的研究主要集中在自體NK 細(xì)胞過繼免疫治療、異體NK 細(xì)胞過繼免疫治療及基因修飾NK 細(xì)胞免疫治療等［18］。

自體NK 細(xì)胞輸注安全，對治療腫瘤也取得了一定的療效，但NK 細(xì)胞短期活化對細(xì)胞表型和功能的恢復(fù)不夠，自體NK 細(xì)胞輸注要發(fā)揮臨床作用可能需要長期的體外活化，發(fā)現(xiàn)長期活化NK 細(xì)胞對自身腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯高于短期活化，應(yīng)進(jìn)一步完善與提高NK 細(xì)胞體外活化和擴(kuò)增技術(shù)［19］。異體NK 細(xì)胞過繼免疫治療是NK 細(xì)胞來源于異體臍帶血、NK 細(xì)胞系或異體去淋巴細(xì)胞液在體外分離出NK 細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)。異體NK 細(xì)胞，有利于殺傷表達(dá)有自身MHCI 分子的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)為了防止移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生，供體一般要預(yù)先把T 淋巴細(xì)胞去除，僅留下NK 細(xì)胞［20］?；蛐揎桸K 細(xì)胞免疫治療就是利用分子生物學(xué)技術(shù)對NK 細(xì)胞進(jìn)行改造，增強(qiáng)其殺傷腫瘤的功能。Jiang 等［21］利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將IFN-α 基因轉(zhuǎn)入NK 細(xì)胞系中，并觀察在體內(nèi)外經(jīng)過IFN-α 修飾的NK 細(xì)胞對于HCC 的效應(yīng)，結(jié)果表明經(jīng)過修飾過的NK 細(xì)胞中細(xì)胞毒性相關(guān)的一些基因如穿孔素、粒酶B、Fas 配體上調(diào)。細(xì)胞分泌的TNF-α 及IFN-γ 能夠增加Fas 的表達(dá)以攻擊HCC 細(xì)胞，同時(shí)增加NK 細(xì)胞介導(dǎo)的HCC 細(xì)胞溶解作用，在異種移植瘤模型中IFN-α 修飾的NK 細(xì)胞能夠有效的延長種植有HCC 移植瘤裸鼠的生存期。因此，作者認(rèn)為IFN-α 修飾的NK 細(xì)胞能有望成為將來肝癌免疫治療的重要方法。

4 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)

DC 疫苗是瘤細(xì)胞或與瘤細(xì)胞融合產(chǎn)物，或采用肽疫苗，即分離純化膜表面抗原肽或人工合成的肽，與正常人的DC 或患者自身DC 體外共培養(yǎng)，再回輸至患者體內(nèi)，重新讓DC 有效激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)?？商岣吆闪鏊拗髅庖咝?yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的毒性，誘發(fā)宿主對腫瘤特異抗原的特異性免疫應(yīng)答。

DC 能直接活化CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。DC 具有非特異性免疫效應(yīng)功能，可殺傷多種新鮮分離或培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞。DC 作為功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，因此，在以DC 為基礎(chǔ)的治療方案中，DC 的抗原遞呈是T、B 細(xì)胞發(fā)揮免疫反應(yīng)的先決條件，借助DC 高表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ類分子所遞呈的腫瘤抗原肽，聯(lián)合CD80、B86、CD40 分子共同作用，充分激活T 細(xì)胞。初始型T 細(xì)胞接受DC 遞呈的抗原后活化并增殖，促進(jìn)其在腫瘤部位聚集以執(zhí)行免疫功能［22］。DC 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療屬于腫瘤疫苗治療，由于疫苗治療具有特異性、在體內(nèi)免疫效應(yīng)維持時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為研究熱點(diǎn)。DC 疫苗在細(xì)胞治療中起著重要作用，近年來DC 疫苗在肝癌治療中顯示出良好的應(yīng)用前景。

Palmer 等［23］進(jìn)行一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)來評價(jià)靜脈輸入自體經(jīng)過肝癌細(xì)胞系(HepG2)刺激成熟的樹突狀細(xì)胞對于進(jìn)展性HCC 的安全及有效性。研究結(jié)果表明134例DC 回輸患者中沒有發(fā)現(xiàn)有明顯毒性，同時(shí)對25例進(jìn)行了3 次以上治療的患者進(jìn)行臨床評價(jià)，放射學(xué)的基本控制率為28%，其中17例患者血漿AFP ＞1000 ng/ml，經(jīng)過治療后AFP 降到小于30% 的基線水平，其中1例患者AFP 小于10%基線水平。因此，從放射學(xué)及血清學(xué)均說明樹突狀細(xì)胞疫苗對于肝癌是一種安全及可耐受的抗腫瘤治療。El Ansary 等［24］等對于30例無法接受放射治療及局部治療的患者，15例患者接受肝癌細(xì)胞系的裂解產(chǎn)物負(fù)載的DC 疫苗治療，15例患者接受一般支持治療。結(jié)果表明接受疫苗治療患者的總體生存期提高了，同樣說明了DC 疫苗對于肝癌是安全可耐受的腫瘤治療方式。Tada 等［25］為了評價(jià)腫瘤相關(guān)抗原負(fù)載的DC 對HCC 的安全，可行及有效，α-甲胎蛋白、glypican-3 及MGGE-1 重組蛋白負(fù)載DC 成熟，DC 于腹股溝淋巴結(jié)皮下注射，結(jié)果表明對于5 名試驗(yàn)者是安全可耐受的，并且都能對腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生T 細(xì)胞反應(yīng)。

5 展望

肝癌治療由單一治療發(fā)展到綜合治療是大勢所趨，免疫細(xì)胞治療配合手術(shù)切除、介入治療、射頻治療等常規(guī)肝癌治療手段，有利于提高肝癌患者生活質(zhì)量，減少復(fù)發(fā)率，延長生存期。隨著細(xì)胞治療技術(shù)不斷改進(jìn)，細(xì)胞免疫治療將充分發(fā)揮其療效好、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，在肝癌治療中將起到愈來愈重要的作用。

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