綠原酸對(duì)仔豬腹瀉的調(diào)控作用及機(jī)理

謝凱桓，張?jiān)坡?，張龍林，李思明，賀 喜，范志勇*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.飼料安全與高效利用教育部工程研究中心，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌 330200）

仔豬健康是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的重要問題，消化道、免疫、環(huán)境、日糧和病原體等諸多內(nèi)外因素均可對(duì)仔豬的健康和生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響[1]。仔豬腹瀉主要是由于消化道和免疫功能發(fā)育不完善，外來不可抗力對(duì)仔豬內(nèi)環(huán)境進(jìn)行侵襲，多發(fā)于仔豬幼齡階段。為治療仔豬腹瀉，抗生素在養(yǎng)豬業(yè)中曾被大量使用，但抗生素殘留、耐藥性的產(chǎn)生以及環(huán)境污染對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)和人類健康帶來威脅，因此新型替抗產(chǎn)品的研究成為熱點(diǎn)。

綠原酸（Chlorogenic Acid，CGA）又被稱為5-O-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）或3-CQA[2]，是羥基肉桂酸家族的酚類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由咖啡酸部分和奎寧酸部分組成。CGA 廣泛存在于杜仲、菊花、金銀花及苦丁茶等植物中，其具有抑菌和抗氧化等多種生物活性，對(duì)仔豬腹瀉有一定治療效果，已被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[3-7]。因此，本文就仔豬腹瀉的可能誘因、CGA 在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用及其緩解仔豬腹瀉的可能機(jī)制進(jìn)行綜述，為CGA 的進(jìn)一步研究提供參考。

1 仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的腹瀉

仔豬腹瀉多發(fā)生于斷奶后，斷奶過渡期是仔豬生長(zhǎng)周期的關(guān)鍵。早期斷奶策略縮短了豬的屠宰周期，提高了母豬的繁殖性能，已廣泛應(yīng)用于豬生產(chǎn)中[8]。但仔豬失去母乳哺乳后，日糧結(jié)構(gòu)和環(huán)境的突然轉(zhuǎn)變均可引起仔豬發(fā)生斷奶應(yīng)激，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)性能及腸道健康，導(dǎo)致仔豬腹瀉率，增加了仔豬死亡率，并降低生長(zhǎng)性能[9-10]。此外，細(xì)菌、病毒和寄生蟲等許多因素也會(huì)引發(fā)豬的腸道功能障礙問題[11-13]，其中，大腸桿菌是導(dǎo)致仔豬腹瀉的一種常見細(xì)菌。Wu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）菌株可引起人和動(dòng)物腸道功能障礙和損傷，并造成仔豬腹瀉。Mohamed 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬感染ETEC 后會(huì)發(fā)生腹瀉，導(dǎo)致其脫水、發(fā)育遲緩甚至死亡，其病理性特征是產(chǎn)生腸毒素和黏附素。ETEC 攻毒后仔豬絨毛高度縮短，隱窩深度加深，空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，回腸中緊密連接蛋白claudin-1 的mRNA 表達(dá)量下降，而淋巴細(xì)胞百分比、血漿白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、回腸黏膜中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及回腸組織中先天免疫相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)量上升[16]。此外，ETEC 感染仔豬后會(huì)使其腸道微生物區(qū)系和腸道微生物失調(diào)[17]。López 等[18]用鼠傷寒沙門氏菌或ETEC 對(duì)仔豬進(jìn)行攻毒后發(fā)現(xiàn)，仔豬出現(xiàn)輕度至重度腹瀉，并且使得腸脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）、豬主要急性期蛋白（Pig-MAP）和TNF-α上升。研究表明，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒A（PRV-A）、豬曲布病毒（PKV）和豬三角冠狀病毒（PDCoV）是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要病毒，大多數(shù)屬于RNA 病毒，其中輪狀病毒是引起新生仔豬腹瀉的主要病原體[19-21]。豬中常見的艾美耳球蟲、等孢球蟲和隱孢子蟲等寄生蟲是仔豬腹瀉的誘因之一，該病常在哺乳期仔豬中出現(xiàn)且在其他階段均有分布，可導(dǎo)致7～21日齡仔豬腸絨毛萎縮，輕度吸收不良以及腹瀉[13,22]。

2 CGA 對(duì)仔豬腹瀉和生產(chǎn)性能的影響

飼糧中添加CGA 能改善腸道健康、緩解仔豬斷奶后的應(yīng)激反應(yīng)并降低仔豬腹瀉率、提高仔豬的生長(zhǎng)性能和抗逆能力[23]。Chen 等[24]給斷奶仔豬分別飼喂添加0、250、500、1 000 mg/kg CGA 的基礎(chǔ)日糧，發(fā)現(xiàn)1 000 mg/kg CGA 組仔豬的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對(duì)照組，有效降低了仔豬腹瀉率，同時(shí)提高了仔豬粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分的表觀消化率，血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）活性和堿性磷酸酶（AKP）活性均顯著升高。Zhang 等[25]試驗(yàn)也證明，飼糧中添加CGA 后仔豬血清和十二指腸中GSH-Px 和CAT 活性均顯著升高，回腸丙二醛（MDA）含量降低，還能顯著降低了十二指腸隱窩深度，提高了絨毛高度和絨隱比。此外，Chen 等[26-28]給斷奶仔豬飼喂含1 000 mg/kg CGA 的基礎(chǔ)日糧，發(fā)現(xiàn)可提高仔豬空腸絨毛高度、絨隱比以及回腸絨隱比，能顯著增加仔豬小腸長(zhǎng)度，有效改善仔豬消化吸收能力，同時(shí)降低血清TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和IL-1β等抑炎因子含量，提高血清中免疫球蛋白G、空腸分泌型免疫球蛋白A 的含量和黏膜中二胺氧化酶（DAO）的活性。與此同時(shí)，CGA 還能調(diào)節(jié)腸道菌群。給斷奶仔豬飼喂含1 000 mg/kg CGA 的基礎(chǔ)日糧可顯著提高回腸消化物中的乙酸鹽濃度以及盲腸消化物中乙酸鹽、丙酸和丁酸鹽的濃度，從而提高了盲腸菌群α多樣性，特別是擬桿菌的相對(duì)豐度，還使得結(jié)腸中乳酸菌數(shù)量增加，大腸桿菌數(shù)量減少[25,28]。綜上所述，飼糧中添加CGA可以改善仔豬的生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)仔豬免疫力，促進(jìn)腸道發(fā)育并能調(diào)節(jié)其腸道微生物區(qū)系平衡，具有作為仔豬飼糧添加劑的潛力，其最佳添加劑量為1 000 mg/kg。

3 CGA 改善仔豬腹瀉的可能機(jī)制

3.1 CGA 的吸收和代謝 CGA 進(jìn)入機(jī)體后，少部分被胃和小腸吸收，大部分被大腸吸收，但CGA 在不同的部位分解會(huì)產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，吸收機(jī)制方面也存在差異。Wang 等[29]和Li 等[30]對(duì)SD 大鼠體內(nèi)CGA 代謝產(chǎn)物進(jìn)行了表征，通過水解、還原、甲基化、甘氨酸結(jié)合及葡糖醛酸結(jié)合等推導(dǎo)出18 個(gè)原型化合物和50 個(gè)代謝產(chǎn)物，主要是咖啡基奎寧酸、二咖啡?？鼘幩?、對(duì)香豆?？鼘幩岷桶⑽核?。有研究證明了CGA 可被胃、小腸、大腸吸收，并且CGA 是通過穿透胃酸屏障進(jìn)入細(xì)胞，CGA 到小腸后，小腸中的葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶使CGA 在小腸中大多以葡糖苷酸化形式吸收，而糖苷酶和酯酶可使CGA 酯鍵斷裂釋放奎尼酸和咖啡酸，但小腸中酯酶活性低，因此CGA 分解代謝少[31-33]。還有研究證明CGA 僅約1/3 能被胃及小腸吸收，意味著一部分CGA 會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)，大部分會(huì)到達(dá)結(jié)腸，經(jīng)腸道菌群作用下水解為咖啡酸和奎寧酸[34-35]，同時(shí)還能產(chǎn)生間香豆酸、苯丙酸、苯甲酸和馬尿酸衍生物等多種代謝產(chǎn)物，這些微生物代謝產(chǎn)物占CGA 攝入量的57.4%，豐富的微生物代謝產(chǎn)物表明腸道菌群對(duì)CGA 的代謝水平一定程度上決定了CGA 的生物利用度[36-37]。

3.2 調(diào)節(jié)腸道菌群 機(jī)體攝入的CGA 大部分被大腸吸收代謝，CGA 達(dá)到大腸后可對(duì)腸道菌群進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而增加其腸道微生物區(qū)系多樣性。Charlotte 等[38]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CGA 可顯著增加人糞便微生物區(qū)系中雙歧桿菌和梭狀芽胞桿菌的含量。Zhang 等[39]在對(duì)小鼠糞便微生物群中細(xì)菌相對(duì)豐度的研究中發(fā)現(xiàn)，CGA 可逆轉(zhuǎn)葡聚糖硫酸鈉（DSS）引起的菌群多樣性下降，提高了乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度，表明CGA 能通過恢復(fù)腸道微生物多樣性來減輕DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷并維持腸道健康。此外，ETEC 感染仔豬后會(huì)使其腸道微生物區(qū)系和腸道微生物失調(diào)[17]。Song 等[40]試驗(yàn)表明，CGA預(yù)處理能改善促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）所致的抑郁大鼠糞便微生物多樣性下降，特別是脫硫弧菌、克雷伯氏菌、伯克氏桿菌和雙歧桿菌等一些關(guān)鍵細(xì)菌的相對(duì)豐度變化均受CGA 調(diào)節(jié)。鉛（Pb）被廣泛認(rèn)為是有毒的重金屬。研究發(fā)現(xiàn)，CGA 對(duì)Pb 引起的腸道微生物組分變化同樣具有顯著的逆轉(zhuǎn)作用，可使Pb 組螺桿菌屬的比例從2.95% 提高到11.24%[41]。Akkermansia是腸道中降解黏蛋白的細(xì)菌。Zhang 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，CGA 能顯著增加結(jié)腸炎小鼠中Akkermansia的比例。

3.3 保護(hù)腸道形態(tài)及屏障 腸道縮短使機(jī)體不能充分吸收其中的水分、電解質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，進(jìn)而發(fā)生腹瀉及消化吸收功能障礙等問題[43]。張柏林等[44-46]研究發(fā)現(xiàn)，DSS 可誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，引起小鼠體重下降、結(jié)腸縮短造成腹瀉；肉雞被脂多糖（LPS）刺激后其腸道也會(huì)縮短。而Zheng 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，使用CGA 可明顯緩解DSS 所致的臨床癥狀和結(jié)腸縮短等問題，還可降低LPS所致的斷奶大鼠的腸道通透性并增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，與LPS 組相比，添加CGA 可使大鼠空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度之比增加，空腸和結(jié)腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)量明顯增加。Xue 等[48]研究表明，CGA 能改善鎘（Cd）所致的大鼠絨毛損傷，逆轉(zhuǎn)對(duì)緊密連接蛋白的破壞，起到保護(hù)腸道屏障的作用。Peng 等[49]也有相似的發(fā)現(xiàn)，GCA 通過下調(diào)高脂日糧（HFD）誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中RhoA/Rho 激酶（Rock）信號(hào)通路恢復(fù)結(jié)腸緊密連接蛋白的表達(dá)，到達(dá)保護(hù)腸道屏障的目的。綜上所述，CGA 可促進(jìn)腸道形態(tài)恢復(fù)，保護(hù)腸道屏障，是減少仔豬腹瀉及提高生長(zhǎng)性能的有效措施。

3.4 提高腸道抗氧化力 新生仔豬發(fā)育尚不成熟及斷奶應(yīng)激等因素可導(dǎo)致仔豬體內(nèi)產(chǎn)生過量自由基，而自由基過量會(huì)損傷仔豬腸道，進(jìn)而誘發(fā)仔豬腹瀉[50]。CGA 具有改善腸道氧化應(yīng)激的作用。Orsolya 等[51]、Xu 等[52]證明CGA 對(duì)LPS 和脫氧雪腐烯酚（DON）誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）炎癥和氧化應(yīng)激有保護(hù)作用，能夠顯著下調(diào)炎癥細(xì)胞因子IL-6 和IL-8 的基因表達(dá)和濃度，降低了IPEC-J2 細(xì)胞中活性氧水平。Liang 等[53]研究也發(fā)現(xiàn)，CGA 能清除腸細(xì)胞內(nèi)活性氧，增加還原性及氧化性谷胱甘肽的表達(dá)，激活核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Nrf2 信號(hào)的增加導(dǎo)致其靶基因在CaCO-2 細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活了Nrf2-Keap1-ARE 信號(hào)通路。Xue 等[48]試驗(yàn)表明，經(jīng)Cd 處理的大鼠血清中CAT 和GSH-Px 活性明顯降低，MDA 水平升高，而使用CGA 和向日葵種子提取物共同處理可讓CAT 活性和MDA 水平恢復(fù)到對(duì)照組的水平，并且CGA 組大鼠GSH-Px 活性的增加明顯高于Cd 處理組。Zhou 等[54]還證明了CGA 能有效改善內(nèi)毒素所致腸損傷，增加小腸重量，降低回腸和回腸線粒體MDA 含量，提高回腸AKP、SOD、回腸線粒體β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）還原性脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性；另一方面，腸通透性與腸道線粒體損傷呈正相關(guān)，可以通過回腸線粒體MDA 水平反應(yīng)出，并且又與NADH脫氫酶活性呈負(fù)相關(guān)，由此發(fā)現(xiàn)，CGA 保護(hù)腸道損傷可能與線粒體脂質(zhì)過氧化水平降低和NADH 脫氫酶活性升高有關(guān)。該學(xué)者還通過研究CGA 對(duì)線粒體的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)CGA 預(yù)處理可減輕H2O2引起的腸道線粒體損傷，增加線粒體膜電位，降低線粒體腫脹，降低ROS 及8-羥基-2-脫氧鳥苷含量，減少細(xì)胞色素c 釋放，可知CGA 對(duì)線粒體的促進(jìn)作用伴隨著抗氧化能力和呼吸鏈復(fù)合物I、IV 和V 活性的增加[55]。CGA 作為一種線粒體靶向抗氧化劑，在對(duì)抗腸道氧化損傷方面有很好的潛力，它能通過提高仔豬的抗氧化能力促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，降低腹瀉。

3.5 改善腸道炎癥反應(yīng) 腸道炎癥反應(yīng)是腹瀉發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)，CGA 可通過減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減輕腸道損傷，特別是在結(jié)腸部位[56]。Peng 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷與CGA 組合可抑制腸源性脂多糖（LPS）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括肝LPS 結(jié)合蛋白、Toll 樣受體4、IL-1β、TNF-α和枯否細(xì)胞浸潤(rùn)。在DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，CGA 預(yù)處理2 周后可顯著降低小鼠結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分和TNF-α水平[39]。Zhang 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，CGA 可減輕2.5% DSS 引起的結(jié)腸炎，改善黏膜損傷，通過抑制活化的核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，顯著抑制干擾素γ（IFN-γ）、TNF-α和IL-6 的分泌，抑制F4/80+巨噬細(xì)胞、CD3+T 細(xì)胞和CD177+中性粒細(xì)胞的結(jié)腸浸潤(rùn)。Iva 等[45]用2.5% DSS 對(duì)小鼠灌胃7 d，CGA 可抑制磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 和2（ERK 1/2）、c-Jun 氨基末端激酶1 和2（JNK 1/2）、蛋白激酶B（Akt）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），同時(shí)促進(jìn)磷酸酶和張力素同源酶（PTEN）的表達(dá)，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、B 淋巴細(xì)胞瘤-相關(guān)X 蛋白2（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）和血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白的表達(dá)，因此CGA 能通過抑制促炎和凋亡信號(hào)通路的激活治療或減輕小鼠結(jié)腸炎。Gao 等[57]同樣發(fā)現(xiàn)，CGA 可通過降低ERK 1/2、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、p38、磷酸化P38（p-p38）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（p-JNK）蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減輕DSS 引起的小鼠結(jié)腸黏膜損傷。Hee 等[46]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CGA 可抑制經(jīng)TNF-α和H2O2刺激后Caco-2 細(xì)胞中中白細(xì)胞介素-8（IL-8）的產(chǎn)生；在體內(nèi)DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，CGA 可顯著抑制小鼠TNF-a 的mRNA 表達(dá)，其可能機(jī)制為直接抑制NF-κB 的激活，或通過抑制上游信號(hào)通路間接影響NF-κB 信號(hào)傳遞。另外，CGA 還可緩解三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，CGA 通過減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和抑制NF-κB 依賴性途徑而具有抗炎作用[58]。因此，CGA 作為一種抗炎物質(zhì)，能通過多種途徑降低仔豬腸道炎癥，特別是抑制NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而緩解仔豬腹瀉。

4 小 結(jié)

改善腸道健康是解決仔豬腹瀉的關(guān)鍵，隨著研究的不斷深入，仔豬腹瀉的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制逐漸清晰，從而能夠?qū)ψ胸i腸道進(jìn)行更加精準(zhǔn)化、動(dòng)態(tài)化和靶向性的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，以維持仔豬腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，預(yù)防或減少腹瀉等腸道疾病的發(fā)生。CGA 可以通過提高菌群豐度，降低腸道氧化損傷及炎癥等方式保護(hù)腸道形態(tài)、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)仔豬腸道健康，從而提高仔豬生長(zhǎng)性能，有作為仔豬飼料添加劑的潛力，但CGA 在仔豬階段的報(bào)道較少，在仔豬腸道中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。