間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)眼部疾病的治療作用

王亞鵬，李江偉，彭 俊，周亞莎，龍 達(dá)，彭清華,

0引言

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群具有多向細(xì)胞分化潛能和自我細(xì)胞更新的多能干細(xì)胞，可從多種組織如胎盤(pán)、臍帶、脂肪、骨髓、肌肉和牙髓等中獲取[1]。MSCs具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、多向細(xì)胞分化、抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)和促進(jìn)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)MSCs的功能與其旁分泌機(jī)制(尤其是外泌體)有著密切的聯(lián)系。MSCs來(lái)源的外泌體(mesenchymal stem cells-derived exosomes，MSC-Exo)是MSCs旁分泌作用的主要物質(zhì)，是一種包括信使RNA、微小非編碼RNA(miRNA)、雙層脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡小體，其大小均一，直徑為30～150nm，密度為1.13～1.18g/mL，其傳遞是通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷而形成多泡內(nèi)涵體并與細(xì)胞膜融合而釋放[2]，可避免其攜帶的特異蛋白質(zhì)和mRNA在分泌到細(xì)胞外后被迅速吸收降解，從而可在整個(gè)細(xì)胞外保持穩(wěn)定的機(jī)體生物學(xué)活性，到達(dá)機(jī)體遠(yuǎn)端發(fā)揮作用，并可長(zhǎng)時(shí)間保持有效生物學(xué)功能[3]。研究表明，MSC-Exo通過(guò)傳遞蛋白質(zhì)和RNA完成細(xì)胞間的通訊，可實(shí)現(xiàn)介導(dǎo)MSCs的促進(jìn)修復(fù)、保護(hù)神經(jīng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等功能[4-5]。MSC-Exo在肝腎肺臟損傷修復(fù)，骨骼肌、軟骨、神經(jīng)組織、口腔組織、心血管再生和皮膚創(chuàng)口愈合等多種疾病中具有重要的治療作用[6]，相比較MSCs而言，外泌體更加穩(wěn)定，易于修飾，且不具有成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于外泌體的納米級(jí)尺寸和雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，可以很容易地通過(guò)人體生物屏障進(jìn)入靶向免疫器官和細(xì)胞發(fā)揮治療作用。研究表明，MSC-Exo對(duì)各種眼部疾病如干眼、抑制角膜移植排斥反應(yīng)、視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性、青光眼、自身免疫性葡萄膜炎等具有治療潛能[7-8]?，F(xiàn)就MCS-Exo在眼部疾病中的作用及臨床應(yīng)用前景進(jìn)行討論。

1對(duì)干眼的治療作用

干眼(dry eye，DED)是一種以淚膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失為特征的眼表多因素疾病，伴有淚膜穩(wěn)定性差、淚液高滲性、眼表炎癥等[9]，目前該病的患病率不斷提高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。國(guó)際淚膜和眼表協(xié)會(huì)(Tear Film and Ocular Surface Society,TFOS)與國(guó)際干眼研討會(huì)(International Dry Eye Workshop，DEWS)一致認(rèn)為，淚液高滲性和淚膜不穩(wěn)定性是DED的核心病因，眾多學(xué)者認(rèn)為DED發(fā)生的關(guān)鍵因素是淚液滲透壓增高誘導(dǎo)的眼表炎癥。有研究表明，DED患者及動(dòng)物模型中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α呈現(xiàn)高表達(dá)，這對(duì)眼表炎癥的發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，且表達(dá)水平與DED的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。目前，DED無(wú)法治愈，目前主要的治療方法為采用人造眼淚、抗炎滴眼液和局部免疫抑制，目的是改善慢性角膜炎癥的癥狀[10]。

前期研究已知MSCs顯示出具有角膜上皮前體細(xì)胞的形態(tài)特征，可檢測(cè)出Integrin D1、Cx43、Pax6和P63等角膜上皮前體細(xì)胞的標(biāo)志，說(shuō)明適宜條件下MSCs能誘導(dǎo)分化為角膜上皮前體細(xì)胞[11]。蔡麗萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)滴眼組及眼眶注射組均可有效降低眼表炎癥指數(shù)、降低熒光素染色評(píng)分(corneal fluorescein staining，F(xiàn)LS)、延長(zhǎng)淚膜破裂時(shí)間(tear break-up time，BUT)、修復(fù)角膜上皮，表明其對(duì)DED有一定的治療作用。王希蓮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)或兔脂肪來(lái)源的MSCs能有效緩解兔自身免疫性干眼的病情進(jìn)展，且在發(fā)病前預(yù)防性輸注hUC-MSCs能夠取得相似的治療效果，但靜脈輸注MSCs有一定的風(fēng)險(xiǎn)，故臨床應(yīng)用有局限性。

李娟等[14]用MSC-Exo處理小鼠干眼模型后，進(jìn)行小鼠淚膜功能相關(guān)檢查，包括淚液分泌試驗(yàn)(SchirmerⅠtest，SⅠt)、BUT、FLS測(cè)定，發(fā)現(xiàn)MSC-Exo組BUT延長(zhǎng)，SⅠt增加，F(xiàn)LS評(píng)分降低，組織病理學(xué)結(jié)果顯示小鼠角結(jié)膜中浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞減少，角膜上皮細(xì)胞形態(tài)更加規(guī)整，微絨毛濃密，治療效果明顯。相關(guān)研究表明[15]MSC-Exo能夠降低炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄，說(shuō)明MSC-Exo可以減輕DED小鼠角膜上皮的損傷。

李娜等[16]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在兔自身免疫性干眼模型的淚腺組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)顯著增加，而抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)下調(diào)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體(hUC-MSC-Exo)可誘導(dǎo)外周血中單核巨噬細(xì)胞向抗炎性M2表型極化，從而有效促進(jìn)IL-10、TGF-β分泌，抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子如TNF-α和IL-1β分泌，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的效果。

2對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的免疫抑制作用

角膜病是世界上最常見(jiàn)的與失明相關(guān)的眼病之一，是我國(guó)第二大致盲眼病，臨床證實(shí)其可靠、有效的復(fù)明手段為角膜移植手術(shù)。正常生理情況下，角膜屬于自體免疫特殊區(qū)域，但由于是同種異體移植，移植的角膜可引起移植體內(nèi)抗原抗體反應(yīng)，致使角膜植片混濁、功能喪失，甚至失明，從而導(dǎo)致角膜移植失敗[17]。角膜移植后排斥反應(yīng)是多種細(xì)胞(如T、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等)和免疫分子參與的免疫排斥反應(yīng)[18]。在角膜移植排斥反應(yīng)的高?；颊咧?，減少或防治角膜排斥反應(yīng)是提高手術(shù)成功率及患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵[19]。目前臨床主要用糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A滴眼液等，但長(zhǎng)期使用可誘發(fā)青光眼、白內(nèi)障、肝腎毒性等疾病及不良反應(yīng)，故優(yōu)化治療尤為重要。

Jia等[20]前期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠結(jié)膜下注射MSCs或尾靜脈注射MSCs可抑制炎癥反應(yīng)和上調(diào)Th2細(xì)胞因子，在對(duì)MSCs進(jìn)行示蹤觀(guān)察后，發(fā)現(xiàn)結(jié)膜下注射MSCs后72h，結(jié)膜囊中存在大量MSCs，但前房以及角膜組織中未見(jiàn)表達(dá)，總體效果可延長(zhǎng)角膜植片存活時(shí)間。賈喆等[21]通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，比較結(jié)膜下注射MSCs和MSC-Exo后角膜植片存活時(shí)間，發(fā)現(xiàn)24h后結(jié)膜囊、角膜組織中以及前房?jī)?nèi)均可見(jiàn)外泌體的定位表達(dá)；72h后發(fā)現(xiàn)結(jié)膜囊中外泌體存在量極少，最終MSCs-Exo治療組角膜植片的存活時(shí)間更長(zhǎng)。因此得出結(jié)論：MSCs-Exo可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并促進(jìn)免疫組織修復(fù)，抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答、改變Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡以及上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，可以克服體內(nèi)生物屏障到達(dá)角膜以及前房從而發(fā)揮生物學(xué)功能，對(duì)抑制角膜移植術(shù)后細(xì)胞排斥反應(yīng)有一定作用。

3對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞及視神經(jīng)損傷的保護(hù)作用

損傷、感染或局部缺血引起的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷會(huì)觸發(fā)鄰近神經(jīng)細(xì)胞的變性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜形態(tài)和功能的損傷以及不可逆的視力損害[22]。目前干細(xì)胞移植、抗炎藥、信號(hào)通路抑制劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等在各種視網(wǎng)膜疾病模型中均顯示出神經(jīng)保護(hù)作用[23]。既往研究證明，靜脈注射MSCs可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來(lái)挽救視網(wǎng)膜激光損傷[24]。王寧等[25]通過(guò)在大鼠視網(wǎng)膜下移植BMSCs，推測(cè)BMSCs的作用機(jī)制可能與其分泌細(xì)胞因子bFGF而起到營(yíng)養(yǎng)支持和多向分化的潛在功能有關(guān)，其可通過(guò)改善視網(wǎng)膜微環(huán)境而起到保護(hù)光感受器細(xì)胞的作用。

Yu等[26]在激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷小鼠模型中，通過(guò)在玻璃體腔注射MSC-Exo，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)明顯下調(diào)，熱損傷后的視網(wǎng)膜細(xì)胞中的MCP-1 mRNA表達(dá)也明顯下調(diào)。這些結(jié)果表明，玻璃體腔注射MSC-Exo可通過(guò)下調(diào)MCP-1減少視網(wǎng)膜損傷，抑制細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能。Mead等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)死亡和軸突變性為特征的大鼠視神經(jīng)擠壓(ONC)模型中，BMSC-Exo中的miRNA展現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生作用。因而推測(cè)，BMSC-Exo可以有效促進(jìn)視網(wǎng)膜創(chuàng)傷修復(fù)，抑制炎癥和免疫，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)功能，具有較好的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)是視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與色素上皮層的物理分離，是最常見(jiàn)的威脅視力的疾病之一。馬明明[28]研究表明，MSC-Exo含有抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡的蛋白效果，可以減輕RD對(duì)光感受器細(xì)胞變性的影響，能抑制炎癥因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)光感受器細(xì)胞的自噬，減少凋亡，發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜的功能[29]，從而對(duì)RD誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷具有治療作用。

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種多因素的進(jìn)行性致盲眼病，是50歲以上人群不可逆性視力下降的首要原因[30]。已知脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是ARMD的主要病理改變，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是促進(jìn)CNV形成的主要生長(zhǎng)因子，其中VEGF-A與眼內(nèi)新生血管生成密切關(guān)聯(lián)。何廣輝[31]將hUC-MSC-Exo按照不同作用濃度注射到動(dòng)物眼球中，通過(guò)熒光造影檢查和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CNV動(dòng)物模型的滲漏情況較對(duì)照組好轉(zhuǎn)，并下調(diào)CNV形成處VEGF-A蛋白的表達(dá)，表明hUC-MSC-Exo能夠改善光損傷所致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，且與作用濃度和作用時(shí)間呈正比。

糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)是老年人視力喪失的主要原因之一，視網(wǎng)膜中炎性細(xì)胞因子的增加與DR中的視網(wǎng)膜病變程度密切相關(guān)。Zhang等[32]和Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo中miR-126在調(diào)節(jié)高血糖誘發(fā)的視網(wǎng)膜炎癥因子的表達(dá)中起關(guān)鍵作用，過(guò)表達(dá)miR-126的MSC-Exo在糖尿病大鼠中顯著降低了視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)和NLRP3炎性小體的活性，從而改善了糖尿病大鼠的高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥。

青光眼(glaucoma)是導(dǎo)致不可逆性失明的一種進(jìn)行性視神經(jīng)病變，全世界有超過(guò)7 000萬(wàn)人受到本病的影響[34]。其特征是RGC的逐漸喪失，眼內(nèi)壓升高(IOP)被認(rèn)為是導(dǎo)致青光眼RGC凋亡增加的主要原因。Harrell等[35]在青光眼動(dòng)物模型玻璃體腔注射MSCs后發(fā)現(xiàn)，注射后可產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白和免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)RGC的擴(kuò)增和再生，提供小梁網(wǎng)完整性，并減輕視網(wǎng)膜炎癥。Mathew等[36]表明MSC-Exo能夠在玻璃體內(nèi)給藥后至少停留4wk，并且由于其納米尺寸，可能會(huì)迅速到達(dá)RGC，為它們提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，最終達(dá)到保護(hù)RGC的作用。

4對(duì)自身免疫性葡萄膜炎的治療作用

自身免疫性葡萄膜炎是一種涉及葡萄膜和視網(wǎng)膜的自身免疫性疾病，是全世界視力障礙的主要原因，全身或局部給予皮質(zhì)類(lèi)固醇聯(lián)合免疫抑制藥物是自身免疫性葡萄膜炎的傳統(tǒng)治療方案[22]，但長(zhǎng)期使用會(huì)有全身性副作用以及白內(nèi)障和青光眼的風(fēng)險(xiǎn)[37]，因此優(yōu)選球周/眼內(nèi)注射藥物治療。Li等[38]既往研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型中靜脈輸注大鼠MSCs可以抑制T細(xì)胞增生，下調(diào)Th1、Th17效應(yīng)細(xì)胞，上調(diào)Th2、Treg細(xì)胞，能有效預(yù)防和治療抗原誘導(dǎo)的EAU發(fā)生發(fā)展；研究發(fā)現(xiàn)在球周注射人來(lái)源的MSC-Exo治療大鼠EAU，可顯著抑制病情，保護(hù)視網(wǎng)膜。

Bai等[39]發(fā)現(xiàn)在EAU大鼠模型局部應(yīng)用MSC-Exo，可以有效抑制炎癥細(xì)胞的遷移，并顯著降低CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+的百分比。這些發(fā)現(xiàn)表明，眼周注射MSC-Exo至少部分地通過(guò)抑制白細(xì)胞遷移而發(fā)揮有益作用,且眼周注射人MSC-Exo可通過(guò)下調(diào)MCP1/CCL21和MYD88依賴(lài)性途徑來(lái)降低白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移，減少EAU大鼠的白細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)并挽救視網(wǎng)膜功能。這些研究的結(jié)果表明，MSC-Exo可用于治療人類(lèi)自身免疫性葡萄膜炎。

5小結(jié)

目前，對(duì)外泌體的研究熱潮方興未艾，相比于MSCs在多種疾病中的直接治療，MSC-Exo具有毒性小、免疫原性低、靶向歸巢能力強(qiáng)和可包載的物質(zhì)種類(lèi)多等特點(diǎn)[40]，因此在使用、轉(zhuǎn)移過(guò)程中更安全；MSC-Exo可通過(guò)特定細(xì)胞在特定環(huán)境下的培養(yǎng)、擴(kuò)增而獲得，獲得方式更便捷，獲取成本更低，速度更快；同時(shí)，MSC-Exo還能夠修飾為特定的特異性細(xì)胞分子，更能提高治療效果；MSC-Exo是天然納米囊泡，在藥物遞送載體上具有先天優(yōu)勢(shì)?？梢?jiàn)，MSC-Exo在安全性、作用劑量、作用效果方面均優(yōu)于MSCs，更具有應(yīng)用前景與價(jià)值[41]。但目前對(duì)MSC-Exo在眼部疾病中的治療時(shí)間、治療量，以及其發(fā)揮治療作用的機(jī)制仍缺乏全面的認(rèn)知，對(duì)MSC-Exo的探究需進(jìn)一步的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究推動(dòng)發(fā)展以及研究者的共同努力。