心血管內(nèi)皮細胞放射性損傷機制的研究進展

王夢迪 李敏 曹璐 許赪 歐丹 王舒蓓 陳佳藝

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院放射治療科，上海 200025)

放射性心臟疾病(radiation-induced heart diseases，RIHD)是指放射線引起的一系列早期或晚期的心血管并發(fā)癥，它抵消了由放射治療(放療)產(chǎn)生的部分生存獲益，已成為胸部放療患者非腫瘤性死亡的主要原因之一[1]。近年來，隨著放療技術的改進，心臟的輻射劑量和受照射體積顯著降低，但仍無法避免RIHD。潛伏期較長的慢性RIHD受到了越來越多研究者的關注[2-3]。

心血管內(nèi)皮細胞對放射線的敏感性高于高度分化的心肌細胞，與蒽環(huán)類化療藥物直接造成心肌損傷不同，RIHD主要為繼發(fā)于微血管損傷的結果[4]。心血管內(nèi)皮細胞損傷是RIHD的始動環(huán)節(jié)，長期或反復照射可誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，形成微血栓并堵塞管腔，進而毛細血管密度進行性降低，最終心肌組織局灶性缺血缺氧并啟動促纖維化進程[5]。研究心血管內(nèi)皮細胞放射性損傷作用機制，對于早期預防RIHD、改善胸部放療患者預后具有重要的臨床價值?，F(xiàn)重點綜述RIHD中心血管內(nèi)皮細胞損傷機制及潛在的保護策略。

1 炎癥反應損傷機制

1.1 高劑量輻射誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生無菌性的炎癥損傷

多項研究表明，大于2 Gy的高劑量輻射即可誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生無菌性的炎癥反應[6-8]?？赡艿脑蚴禽椛湟饍?nèi)皮細胞DNA雙鏈斷裂、活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成和損傷相關分子模式的釋放，共同激活了核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)相關信號通路。進而以時間和劑量依賴的方式上調內(nèi)皮細胞表面的黏附分子[細胞間黏附分子(intercelluar adhesion molecule,ICAM)-1、ICAM-2、E選擇素和血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)]的表達和各種促炎細胞因子[白介素(IL)-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、γ干擾素、C-C趨化因子配體2、C-C趨化因子配體5和單核細胞趨化蛋白-1]的釋放，影響了內(nèi)皮細胞與白細胞之間的相互作用，最終破壞了血管屏障的完整性和通透性[6-10]。

過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)是內(nèi)皮細胞脂質代謝的關鍵調節(jié)因子，參與內(nèi)皮細胞炎癥信號轉導。伴隨著輻射誘導的黏附分子表達上調，糖原合成酶激酶-3β的活性也隨之增加?；罨奶窃铣擅讣っ?3β通過磷酸化修飾PPARα，使PPARα泛素化增加，不僅抑制了PPARα的表達，還間接激活了NF-κB信號通路，進一步加劇了輻射誘導的炎癥反應[3，11]。

1.2 低劑量輻射誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生部分抗炎保護作用

與高劑量輻射誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生促炎反應相反，低劑量輻射可誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生抗炎效果，原因可能是低劑量放射線激活了內(nèi)皮細胞的抗炎保護系統(tǒng)。研究表明在0.3 Gy和1 Gy的低劑量照射下，內(nèi)皮細胞表面的黏附分子(ICAM-1和E選擇素)的表達減少，降低了內(nèi)皮與單核細胞之間的黏附性[12-13]。另一項研究也報道了經(jīng)0.025～0.5 Gy的低劑量照射的ApoE-/-小鼠，3或6個月后檢測其心臟組織及血漿標本中的促炎標志物(ICAM-1、VCAM-1、E選擇素和Thy1)的表達均降低。這些研究結果均提示可能存在某個劑量閾值，使得經(jīng)低于該閾值劑量照射的內(nèi)皮細胞免受炎癥反應損傷[7]。

1.3 內(nèi)皮細胞炎癥反應促進心肌纖維化

輻射后血管內(nèi)皮細胞釋放的促炎因子TGF-β通過旁分泌的方式，進一步激活心肌細胞內(nèi)經(jīng)典的Smad依賴型信號通路，促進心肌纖維化。具體表現(xiàn)為Smad2和Smad3的磷酸化增強以及Smad4水平的增加。此外，TGF-β還可通過磷酸化TGF-β激活激酶1，觸發(fā)一系列的絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應，如磷酸化胞外信號調節(jié)激酶、p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和Jun激酶后激活非Smad依賴型信號通路[14-15]，最終導致心肌細胞凋亡，成纖維細胞增殖和膠原蛋白沉積增多，加快了心肌纖維化的進程。

1.4 針對炎癥反應損傷的潛在保護策略

抑制輻射后內(nèi)皮細胞黏附分子的表達及促炎因子的釋放是緩解炎癥反應損傷的關鍵路徑之一。Soroush等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制炎癥反應關鍵調節(jié)因子蛋白激酶C-δ的活性，則能有效下調輻射誘導的黏附分子(P選擇素、ICAM-1和VCAM-1)的過表達，顯著減少中性粒細胞與內(nèi)皮細胞之間的相互作用，改善輻射引起的血管內(nèi)皮細胞的通透性增加。Christersdottir等[17]研究表明對胸部放療后的ApoE-/-小鼠，隨即腹腔注射連續(xù)兩周的IL-1受體拮抗劑——Anakinra，在放療結束第10周時，小鼠主動脈中的促炎因子C-C趨化因子配體2和C-C趨化因子配體5的mRNA水平以及I-Ab MHC-Ⅱ類抗原水平發(fā)生顯著下調。說明放療后早期應用Anakinra可減少輻射誘導的炎癥介質的持續(xù)表達，從而可能降低長期慢性炎癥反應誘發(fā)的晚期心血管疾病的風險。

2 氧化應激損傷機制

放射線誘導過量的ROS產(chǎn)生引發(fā)內(nèi)皮細胞的氧化應激損傷一直是研究的熱點問題。ROS既能激活細胞的氧化還原反應敏感性轉錄因子激活蛋白-1和NF-κB，間接參與內(nèi)皮細胞的炎癥和氧化反應，ROS還能激活抗氧化系統(tǒng)的關鍵轉錄因子，從而啟動細胞的抗氧化防御機制[18]。因此，輻射誘發(fā)內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的原因是細胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，使其向著氧化反應的方向發(fā)展[11]。

2.1 ROS降低NO的生物利用度

NO的生物利用度降低是輻射誘導的內(nèi)皮依賴性血管功能障礙的主要原因之一。一方面，ROS使NO快速失活，形成過氧亞硝酸鹽等活性氮，該過程遠遠超過超氧化物歧化酶產(chǎn)生超氧化物的速度，增加了ROS的促炎癥負荷[3，19]。另一方面，ROS的過量釋放使NO生成減少。主要與ROS誘導內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)解偶聯(lián)，eNOS的重要輔因子四氫生物喋呤含量減少，以及eNOS的上游PI3K-Akt-mTOR信號通路失活導致有關eNOS激活障礙[11，20-21]。在輻射早期，NO的釋放量有一過性增加的現(xiàn)象[9]，原因可能是eNOS活性可被輻射誘導的DNA損傷反應信號通路所激活，但照射后24 h內(nèi)大多數(shù)內(nèi)皮細胞的DNA損傷信號通路終止反應[9-10]，eNOS活性又隨之降低，最終發(fā)生血管不可逆的功能障礙[22]。由于內(nèi)皮釋放的NO能擴散至心肌細胞，具有調節(jié)心肌收縮的功能，因此，內(nèi)皮細胞NO生物利用度降低還可間接損傷心肌細胞[23]。

2.2 ROS通過p38 MAPK/核仁磷蛋白/蛋白磷酸酶2A復合體誘導內(nèi)皮細胞DNA損傷

p38 MAPK級聯(lián)通路是介導輻射誘導的氧化應激反應的重要信號通路之一。核仁磷蛋白(nucleophosmin，NPM)是一種對ROS信號敏感的能發(fā)揮多種細胞學功能的核糖核蛋白，其磷酸化狀態(tài)受ROS濃度的影響。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是常存在于胞質中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的成員，能使NPM的第199位上的蘇氨酸殘基(T199)發(fā)生去磷酸化。正常情況下，p38 MAPK/NPM/PP2A是以復合體形式存在于內(nèi)皮細胞質中，該復合體對急性氧化應激反應具有很高的敏感性。當內(nèi)皮細胞的ROS濃度異常升高時，PP2A將被激活，使NPM發(fā)生去磷酸化，隨后NPM從p38 MAPK/NPM/PP2A復合體中解離，并迅速移位到細胞核以轉錄因子的形式誘發(fā)DNA損傷。其可能的機制是T199位去磷酸化的NPM通過轉錄調控抑制了毛細血管擴張性共濟失調突變基因的表達，及其下游的DNA依賴蛋白激酶催化亞基的磷酸化，進而使DNA損傷修復通路受損，最終斷裂的DNA雙鏈發(fā)生不可逆的損傷。此外，ROS還能使該復合體中的p38 MAPK發(fā)生磷酸化，進一步激活p38 MAPK的下游效應元件，發(fā)揮肌動蛋白重塑以及細胞凋亡和衰老等生物效應[24]。

2.3 ROS誘發(fā)線粒體功能障礙

細胞中ROS的主要生成部位在線粒體，是氧化磷酸化代謝的副產(chǎn)物。少量的ROS可充當信號分子維持細胞正常的代謝功能，但隨著輻射劑量的增高，氧化應激持續(xù)增強，產(chǎn)生大量的ROS則會充當炎性介質，破壞線粒體正常結構。Lafargue等[25]發(fā)現(xiàn)15 Gy X射線可誘導產(chǎn)生持續(xù)性的氧化應激，導致線粒體功能障礙和內(nèi)皮細胞早衰；Azimzadeh等[11]用8 Gy和16 Gy X射線照射C57BL/6小鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞后，發(fā)現(xiàn)與線粒體功能障礙相關的蛋白表達上調。Hu等[26]發(fā)現(xiàn)γ射線劑量為5～20 Gy時，可誘導ROS水平呈劑量依賴性增加，線粒體活性隨之降低。

2.4 針對氧化應激損傷的潛在保護策略

外泌體是生物體內(nèi)傳遞信息的載體。缺氧處理后，處于氧化應激狀態(tài)的心肌細胞能釋放轉運多種生物活性物質的外泌體，促進內(nèi)皮細胞的增殖存活及血管新生[27-28]，這啟發(fā)筆者電離輻射背景下也可能誘導類似的心肌細胞來源外泌體對內(nèi)皮細胞的保護。Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激環(huán)境下，心肌細胞能分泌高表達環(huán)狀RNA circHIPK3(circular RNA HIPK3，circHIPK3)的外泌體，經(jīng)細胞膜融合、細胞內(nèi)吞等途徑將circHIPK3傳遞至心臟微血管內(nèi)皮細胞中。circHIPK3通過“海綿樣”吸附血管生成抑制因子miR-29a，使miR-29a不能與下游靶基因胰島素樣生長因子1結合，減弱了miR-29a對胰島素樣生長因子1的抑制作用，從而有效緩解了氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞功能障礙。

3 內(nèi)皮細胞衰老損傷機制

數(shù)天到數(shù)周出現(xiàn)的急性輻射效應與細胞的凋亡密切相關，而數(shù)月到數(shù)年顯現(xiàn)的慢性輻射效應則主要與細胞的衰老相關[30]。在當今放療技術顯著改進的背景下，慢性輻射損傷更為常見，因此，內(nèi)皮細胞衰老損傷更具探討價值。輻射誘導內(nèi)皮細胞衰老的機制尚未闡明，目前已知放射線可通過多種途徑促進內(nèi)皮細胞的衰老，例如：DNA的損傷、持續(xù)的炎癥狀態(tài)、線粒體的氧化應激、端粒的縮短和p53的激活等[9，25]。

3.1 輻射對內(nèi)皮細胞衰老的直接影響

Azimzadeh等用8 Gy或16 Gy高劑量X射線照射小鼠心臟后，檢測到一系列血管內(nèi)皮細胞衰老相關事件的增多。如：衰老標志物(p21、p16和p53)，黏附分子(ICAM-1、ICAM-2和VCAM-1)，血清中促炎細胞因子(腫瘤壞死因子-α、IL-1和IL-6)呈現(xiàn)劑量-時間依賴性升高。此外，該研究團隊在兩項研究中均證實了輻射誘導的內(nèi)皮細胞衰老與PI3K-Akt-mTOR信號通路的級聯(lián)失活有關。該通路的失活將下調其下游的Rho GDI通路活性，上調p53-p21通路活性，進而導致細胞骨架紊亂以及細胞生長抑制[11，31]。Baselet等用0.05 Gy低劑量X射線單次照射體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，14 d后觀察到β-乳糖苷酶染色活性增強和胰島素樣生長因子結合蛋白7分泌增加等過早衰老跡象。一個可能的機制為輻射誘導的DNA損傷激活了Nemo/NF-κB信號通路，促進了IL-6的表達和p53的激活，從而驅動了細胞周期阻滯的發(fā)生及促炎微環(huán)境的形成[10，32]。然而，現(xiàn)有研究仍無法證實是否存在誘導內(nèi)皮細胞衰老效應的最低閾值劑量，但可以肯定的是內(nèi)皮細胞衰老的程度與速率具有劑量-時間依賴性。

3.2 輻射對內(nèi)皮細胞衰老的間接影響

衰老的內(nèi)皮細胞盡管喪失了復制潛能，但仍處于代謝活躍的狀態(tài)。它們可分泌出由促炎細胞因子、趨化因子、生長因子和蛋白酶組成的衰老相關分泌表型，間接影響鄰近的未受照射的細胞和組織，誘發(fā)更多的細胞衰老反應和組織炎癥損傷，該過程也被稱為輻射的旁觀者效應。用10 Gy X射線照射體外培養(yǎng)的人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCECest2)14 d后，將其產(chǎn)生的外泌體與未受照射的HCECest2進行共培養(yǎng)24 h。觀察到未受照射的HCECest2細胞表現(xiàn)出同受照射HCECest2細胞相似的炎癥反應?？赡艿臋C制是受照射細胞外泌體中高表達的IL-6介導了未受照射HCECest2細胞內(nèi)發(fā)生Ⅰ型干擾素反應及通過p38 MAPK激活了信號轉導及轉錄激活蛋白3信號通路[33]。

3.3 針對內(nèi)皮細胞衰老的潛在保護策略

基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)主要依賴CXC家族趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)發(fā)揮抗輻射誘導的內(nèi)皮細胞衰老的作用。用重組人SDF-1蛋白處理衰老的人腦微血管內(nèi)皮細胞，通過ERK和信號轉導及轉錄激活蛋白3的激活，可顯著增加受體CXCR4以及DNA損傷修復基因(例如：NBS1、53BP1、BRCA1和Chk1)的表達，同時抑制細胞衰老相關表型的表達。此外，將CXCR4的激動劑ATI2341注射入小鼠體內(nèi)，能顯著降低輻射誘導的腦血管內(nèi)皮細胞功能障礙，保障正常的腦血流量[34]。這些結果均表明利用SDF-1和ATI2341有望成為修復放療期間受損血管內(nèi)皮細胞的潛在治療方法。

4 其他損傷機制

4.1 凝血系統(tǒng)損傷機制

放射線破壞微血管的凝血系統(tǒng)動態(tài)平衡，使其朝著促凝和促血栓方向轉變。分次或單次高劑量照射均可促使ApoE-/-模式小鼠產(chǎn)生易于出血的炎性動脈粥樣斑塊[35]。主要原因有：(1)因輻射受損的內(nèi)皮細胞減少了抗凝劑NO和前列環(huán)素的釋放，導致了促凝狀態(tài)的形成。(2)長期來看，損傷的血管內(nèi)皮細胞中凝血酶調節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)的表達呈下降趨勢，卻增加了血管性假血友病因子、纖溶酶原激活物抑制物1型(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)和血小板激活因子等的合成，促進了血小板的黏附和聚集，有利于血管促血栓狀態(tài)的形成。此外，大量釋放的促炎細胞因子則可抑制TM的活性，進一步上調組織因子、PAI-1和血管性假血友病因子的表達，加劇凝血系統(tǒng)失衡[6，8-9]。

最新研究表明普伐他汀能降低輻射后血栓形成風險。普伐他汀通過誘導照射后血管內(nèi)皮細胞中TM的表達，不僅下調了PAI-1和黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的轉錄，同時抑制了炎癥因子(IL-1、CXCL1、腫瘤壞死因子-α和單核細胞趨化蛋白-1)的釋放，達到了抗血栓形成的作用[36]。

4.2 腎素-血管緊張素-醛固酮損傷機制

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)參與多種心血管疾病的形成。例如當患有冠狀動脈粥樣硬化、高血壓或心肌纖維化等疾病時，心臟組織中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)和醛固酮的合成將會增加。同樣的，不少研究證實在RIHD中也存在著類似規(guī)律。大鼠心臟組織經(jīng)15 Gy和18 Gy射線照射后，檢測到ACE、AngⅡ、AngⅡ受體1及醛固酮水平明顯高于對照組[37-38]。Korystova等[39]實驗結果提示照射后單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附作用能促進ACE活性的升高和AngⅡ的合成，進而增多的AngⅡ可借助AngⅡ受體1信號途徑誘導內(nèi)皮功能障礙。

黃酮類(flavonoids)化合物與目前廣泛用于治療高血壓和預防動脈粥樣硬化的血管緊張素轉化酶抑制劑藥物作用機制相類似，可通過抑制輻射誘導升高的ACE活性，調節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，減輕內(nèi)皮功能障礙。黃酮類化合物具有安全無毒和副作用較小等特性，故對于一些患者來說，黃酮類治療可能取得比血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物更好的療效[40]。

5 小結

臨床研究已證實放射性心臟損傷是抵消放療生存獲益的重要因素。在精準放療技術時代，心臟受照射的劑量體積較二維放療時代有了大幅度降低，但遠未降至零水平，無法完全避免心臟局部高劑量和大面積低劑量的輻照影響。隨著胸部腫瘤放療患者的生存期不斷延長，發(fā)現(xiàn)更多有效緩解與治療RIHD的臨床方案尤為重要，而探究血管內(nèi)皮細胞的放射性損傷機制或許是一個關鍵性突破口。目前此類研究尚處于初步階段，特別是對低劑量照射后的長期慢性損傷效應機制仍缺乏關注，需進一步的研究來更好地闡明心血管內(nèi)皮細胞放射性損傷及保護機制，以期為未來轉化醫(yī)學研究提供參考。