循環(huán)漿細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進(jìn)展

左依凡 陳兵

1 多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)概述

MM是一種多發(fā)于>60歲人群的漿細(xì)胞惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤10%～15%[1]，是血液系統(tǒng)第二大常見惡性腫瘤。典型特征是在骨髓(bone morrow，BM)內(nèi)漿細(xì)胞的惡性增殖[2]，伴或不伴有外周血和(或)其他髓外組織，如骨、軟組織或皮膚的浸潤(rùn)[3]。已有研究表明,意義未明的單克隆丙種球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)是MM的前體階段[4]。MGUS是最常見的漿細(xì)胞腫瘤，每年約有1%的MGUS病人發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[4]。MM病人也可能發(fā)展為最具侵襲性的漿細(xì)胞腫瘤亞型，即漿細(xì)胞白血病(plasma cell leukemia, PCL)，其特征是血液中循環(huán)漿細(xì)胞(circulating plasma cell, CPC)>2×109/L。在這種情況下，惡性漿細(xì)胞不再依賴于骨髓基質(zhì)而是在外周血中循環(huán)。

目前，MM仍不可治愈。在過去的十年中，隨著蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitors, PIs)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulatory drugs, IMiDs)及單克隆抗體等新藥的臨床應(yīng)用，MM病人的總體生存率明顯提高，但生存率存在顯著差異。因此，我們需要重視和加強(qiáng)對(duì)疾病的監(jiān)測(cè)與管理。傳統(tǒng)的外周血/尿免疫球蛋白、游離輕鏈、骨髓異常漿細(xì)胞、影像學(xué)檢查等檢測(cè)手段已難以滿足MM復(fù)雜的預(yù)后判斷。新的檢測(cè)項(xiàng)目和方法，對(duì)MM預(yù)后因素和危險(xiǎn)分層的評(píng)估、確定治療策略、治療效果以及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要意義。本文將對(duì)CPC在MM中的意義和檢測(cè)現(xiàn)狀做一綜述。

2 CPC

在實(shí)體瘤和大多數(shù)血液惡性腫瘤(包括漿細(xì)胞腫瘤)中，腫瘤擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的方式是釋放腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤部位釋放到循環(huán)中的細(xì)胞，其也在漿細(xì)胞腫瘤中被發(fā)現(xiàn), 流式細(xì)胞術(shù)可通過其表面標(biāo)記物對(duì)其檢測(cè)。CPC很早就在PCL病人的血液中被檢測(cè)到，也在相當(dāng)一部分MM病人中被檢測(cè)到，在MGUS病人中檢測(cè)到的較少[5]。惡性漿細(xì)胞會(huì)離開BM，通過循環(huán)進(jìn)入外周血，然后再特異性歸巢到BM壁龕或其他某些器官或組織，形成局部微轉(zhuǎn)移灶，以一種“轉(zhuǎn)移/擴(kuò)散”方式將疾病擴(kuò)散到整個(gè)BM及髓外組織[6]。

1962年，Ginsberg 研究團(tuán)隊(duì)首次證實(shí)CPC在MM病人中存在[7]，此后大量相關(guān)研究陸續(xù)開展。2013年P(guān)aiva等[8]進(jìn)一步研究了CPC表型、細(xì)胞遺傳學(xué)和功能特征以及晝夜分布。結(jié)果表明，CPC代表了BM克隆漿細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群，其特征是整合素(CD11a/CD11c/CD29/CD49d/CD49e)、黏附(CD33/CD56/CD117/CD138)和激活分子(CD28/CD38/CD81)的下調(diào)。此外，將CPC與BM基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，其大多處于靜止?fàn)顟B(tài)，且具有較高的克隆發(fā)生潛能。MM病人每日外周血中CPC絕對(duì)數(shù)量有顯著波動(dòng)，在凌晨4:00～12:00達(dá)到峰值，下午16:00～24:00達(dá)到最低點(diǎn)。這表明在MM病人中，CPC 在休息期間可能會(huì)流出至外周血以定植/轉(zhuǎn)移至除BM的其他部位。

3 CPC與MM關(guān)系

CPC的存在在單克隆免疫球蛋白疾病的各階段都是高危標(biāo)志，其對(duì)疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)具有預(yù)測(cè)作用。研究顯示，外周血中CPC的存在與MGUS[9]和冒煙型骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)[10]惡性轉(zhuǎn)化為有癥狀MM的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Kumar等[9]對(duì)325例診斷為MGUS病人的外周血CPC進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示與無CPC病人相比，有CPC病人進(jìn)展為另一種漿細(xì)胞疾病(最常見的是MM)的可能性是前者2倍(OR=2.1,P=0.03)。Bianchi等[10]使用免疫熒光法對(duì)91例SMM病人外周血CPC進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，伴有高水平CPC(定義為外周血漿細(xì)胞>5%)SMM病人在診斷后2～3年內(nèi)進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)增高。Gonsalves等[11]也對(duì)100例SMM病人外周血CPC通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示CPC的存在與更短的進(jìn)展時(shí)間(time to progression，TTP)相關(guān)[10個(gè)月vs未達(dá)到(P<0.001)]。有研究表明，血液中CPC的數(shù)量從MGUS(CPC中位數(shù)為0.008/μL)到SMM(中位數(shù)為0.16/μL)和MM(中位數(shù)為1.9/μL)逐漸增加[12]。王晶等[13]對(duì)17例MM病人[髓外漿細(xì)胞瘤(extramedullary plasmacytoma,EMP)陰性者8例，EMP陽(yáng)性者9例]采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CPC進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示EMP陽(yáng)性組CPC陽(yáng)性率明顯高于EMP陰性組(88.9%比25.0%，P=0.008)，這對(duì)病人是否有髓外轉(zhuǎn)移具有重要的提示作用。

外周血中CPC可能與侵襲性生物學(xué)(較高的增殖率、較高的細(xì)胞遺傳異常發(fā)生率和血管生成增加)相關(guān)[14]。CPC被認(rèn)為是干細(xì)胞樣腫瘤漿細(xì)胞，血液中CPC數(shù)量的增加可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤更快、更廣泛地?cái)U(kuò)散到整個(gè)BM及髓外部位，這就可以解釋血液中較高的CPC計(jì)數(shù)與該病侵襲性特征之間的關(guān)聯(lián)[12]。Nowakowski等[15]的研究也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。然而，Gonsalves等[16]認(rèn)為CPC可能與腫瘤負(fù)荷存在正相關(guān)性。無論采用形態(tài)學(xué)還是流式細(xì)胞術(shù)方法，血液中CPC水平高的MM病人BM漿細(xì)胞比例都較高。未來還需要更大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證CPC與腫瘤負(fù)荷確切的相關(guān)性。

3.1 新診斷多發(fā)性骨髓瘤(newly diagnosed multiple myeloma，NDMM) 在NDMM病人中，約75%的病人外周血中檢測(cè)到CPC，CPC的數(shù)量被證明是整體生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[15]。即使流式細(xì)胞術(shù)或免疫熒光檢測(cè)到非常少的CPC，對(duì)于NDMM病人，其預(yù)后也較差[14]。Nowakowski等[15]研究結(jié)果表明，CPC>10個(gè)的病人中位總生存期(overall survival，OS)明顯少于CPC<10個(gè)的病人(37.3個(gè)月比58.7個(gè)月,P=0.001)。在新藥治療時(shí)代，Gonsalves等[16]對(duì)157例NDMM病人(96%病人采用PIs/IMiDs為主的新藥誘導(dǎo)治療)的外周血CPC采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)估結(jié)果顯示，CPC≥400個(gè)組和CPC<400個(gè)組病人的中位至下次治療時(shí)間(time to next treatment，TTNT)分別為14個(gè)月和26個(gè)月(P<0.001)，2組對(duì)應(yīng)的中位OS分別為32個(gè)月和未達(dá)到(P<0.001),且CPC≥400個(gè)組病人的國(guó)際分期系統(tǒng)(international staging system,ISS)分期、肌酐水平、漿細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)、骨髓漿細(xì)胞百分比、存在熒光原位雜交法(FISH)高危因素病人比例均高于CPC<400個(gè)組病人。在多變量分析中，CPC≥400個(gè)對(duì)OS及TTNT的負(fù)面影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在新藥時(shí)代，CPC的檢測(cè)不僅可以評(píng)估NDMM病人預(yù)后，也可以預(yù)測(cè)自體造血干細(xì)胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)后的早期復(fù)發(fā)[14]。Chakraborty等[17]分析了247例新藥誘導(dǎo)治療后早期行ASCT的NDMM病人，分別在診斷時(shí)和移植前用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其CPC進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，診斷時(shí)CPC陽(yáng)性的病人中，誘導(dǎo)治療后CPC轉(zhuǎn)陰與移植后無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和OS的顯著改善有關(guān)。然而，與在診斷時(shí)和ASCT前沒有檢測(cè)到CPC的病人相比，他們的生存率仍然較低。移植后嚴(yán)格意義的完全緩解(stringent complete response，sCR)在CPC-/-組為32%，在CPC+/-組為30%，在CPC+/+或-/+組為12%(P=0.018)。ASCT后3組的中位PFS分別為30、24和14個(gè)月，5年總生存率分別為83%、70%和43%(P<0.001)。 Gonsalves等[18]的另一項(xiàng)研究對(duì)556例NDMM病人外周血CPC進(jìn)行分析，將那些≥5 CPCs/μL且修訂的國(guó)際分期系統(tǒng)(Revised International Staging System, R-ISS)Ⅰ期或Ⅱ期的病人重新分類為R-ISS ⅡB期。在診斷時(shí)，有、無CPC的病人中位TTNT和OS分別為25個(gè)月比43個(gè)月(P<0.001)和54個(gè)月比89個(gè)月(P<0.001)。診斷時(shí)≥5 CPCs/μL的病人，其TTNT和OS如下：R-ISS Ⅰ期為40個(gè)月和未達(dá)到； R-ISSⅡ期為30個(gè)月和72個(gè)月；R-ISSⅡB期為21個(gè)月和45個(gè)月，R-ISS Ⅲ為20個(gè)月和47個(gè)月?？梢奟-ISS ⅡB期的病人TNNT和OS與R-ISS Ⅲ期相似。由此表明，將CPC數(shù)量納入目前R-ISS分期系統(tǒng)能使NDMM病人的預(yù)后評(píng)估更準(zhǔn)確。

3.2 復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤(relapsed or refractory multiple myeloma，RRMM) 對(duì)于RRMM病人，復(fù)發(fā)后需要重新分層指導(dǎo)治療。RRMM的不良預(yù)后包括初診已經(jīng)存在或新近獲得的高危細(xì)胞遺傳學(xué)異常、高β2微球蛋白和(或)低血清白蛋白(即ISS Ⅲ期)、異常乳酸脫氫酶、輕鏈或IgA型、腎功能不全和髓外疾病[19]。緩解時(shí)間短、進(jìn)展快、既往治療較多也是不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素[20]。Gonsalves等[21]將上述因素納入647例接受連續(xù)治療的RRMM病人中進(jìn)行研究，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其外周血CPC進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，CPC在完全緩解(complete response，CR)病人中均陰性。在疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)病人中，CPC的存在預(yù)示中位生存期較差(22個(gè)月比未達(dá)到;P=0.004)，在疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)病人中，CPC≥100個(gè)(流式細(xì)胞儀收集150 000個(gè)細(xì)胞時(shí))預(yù)示生存期較差(12個(gè)月比33個(gè)月;P<0.001)。該研究強(qiáng)調(diào)CPC檢測(cè)在疾病處于CR或SD病人中的重要性。Rawstron等[22]報(bào)道了治療后CPC數(shù)量下降的趨勢(shì)，RRMM的早期CPC狀態(tài)可能具有預(yù)后價(jià)值，并有助于識(shí)別最終對(duì)挽救治療有反應(yīng)或失敗的病人。RRMM病人在第一個(gè)治療周期后CPC不降低可能有助于早期識(shí)別對(duì)該治療有耐藥性的病人[23]。目前對(duì)RRMM病人CPC的研究較少。

4 CPC作為新生標(biāo)志物

CPC的臨床意義及其隨時(shí)可及性為疾病的診斷和評(píng)估帶來了新視角，有望將CPC納入新的危險(xiǎn)分層標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估病情、指導(dǎo)治療。Abe等[24]研究了PET-CT結(jié)合定量CPC對(duì)MM病人的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果表明，除了腫瘤負(fù)荷外，這2個(gè)參數(shù)可能反映骨髓瘤略微不同的生物學(xué)特征，并且它們作為預(yù)后標(biāo)記可能相互補(bǔ)充。PET-CT結(jié)合定量CPC系統(tǒng)的預(yù)后表現(xiàn)獨(dú)立于高危的細(xì)胞遺傳異常狀態(tài)(CAs)或R-ISS(這是已知最強(qiáng)大的預(yù)后因素)，提示該系統(tǒng)可以用來補(bǔ)充和改進(jìn)已建立的分層策略。未來對(duì)更多病人的CPC及其對(duì)應(yīng)的骨髓漿細(xì)胞的橫向、縱向基因組和免疫表型研究將進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制和在疾病進(jìn)展中的作用。

由于CPC在MM病人外周血中數(shù)量較少，因此其檢測(cè)一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)是檢測(cè)MM病人血液中存在大量CPC的一種簡(jiǎn)便、快速的方法，但由于評(píng)估的有核細(xì)胞數(shù)量有限和它們的形態(tài)相似性，通常不能準(zhǔn)確地將其從正常/反應(yīng)漿細(xì)胞中區(qū)分出來，特別是在CPC數(shù)量較低的病人中。因此，免疫熒光顯微技術(shù)隨后被采用。它可以更靈敏、準(zhǔn)確地評(píng)估MM病人血液中的CPC[9]。這項(xiàng)技術(shù)可以檢測(cè)10 000個(gè)單核細(xì)胞中的1個(gè)克隆漿細(xì)胞(靈敏度為10-4)，從而提高了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)的靈敏度。但該技術(shù)存在靈敏度相對(duì)有限、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、CPC純度低等局限性，阻礙了其在許多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)應(yīng)用[25]。流式細(xì)胞術(shù)作為一種簡(jiǎn)單、快速(<4 h)、經(jīng)濟(jì)和通用的方法，已被廣泛用于鑒定、表征和計(jì)數(shù)MM病人血液中的CPC[25]。通過流式細(xì)胞儀可以識(shí)別出50%～75%NDMM病人中的CPC，具體取決于標(biāo)記物和使用的特異性抗體組的數(shù)量，分析的細(xì)胞數(shù)以及樣品制備方案[26]。但目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的方案(抗體選擇及每個(gè)樣品分析的細(xì)胞數(shù)量的異質(zhì)性)，檢測(cè)CPC的靈敏度水平不穩(wěn)定，以及對(duì)新鮮樣品(<24～48 h)的需求也限制了結(jié)果的可重復(fù)性，也因此限制了其更廣泛的用途和適用性。下一代流式細(xì)胞術(shù)(next-generation flow cytometry, NGF)與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)(8～10色)相比，靈敏度和可重復(fù)性更高[27]。最近NGF也被用于檢測(cè)MM病人血液中CPC[12]。近年來，Allele-specific oligonucleotide定量聚合酶鏈反應(yīng)(ASO-qPCR)和下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)等分子技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生。它們是用于檢測(cè)和定量CPC的高特異性和靈敏性(<10-5～10-6)的分子方法[28]。與ASO-qPCR相比，NGS是一種更靈敏、適用度更廣的分子技術(shù)。ASO-qPCR和NGS等分子技術(shù)不需要新鮮樣品，因?yàn)樗鼈兛梢允褂么鎯?chǔ)的血液衍生核酸來評(píng)估CPC[29]。但其檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無法及時(shí)反映CPC狀態(tài)，且其對(duì)CPC及MM病人的相關(guān)性仍需進(jìn)行大量研究。綜上，流式細(xì)胞術(shù)是目前在臨床及科研領(lǐng)域應(yīng)用檢測(cè) CPC的最佳方法。

5 存在問題及展望

綜上所述，CPC作為一個(gè)新的預(yù)后生物標(biāo)志物，其存在與疾病進(jìn)展、不良的細(xì)胞遺傳學(xué)、較低的總生存率和較高的復(fù)發(fā)率有關(guān)，同時(shí)可預(yù)測(cè)侵襲性疾病進(jìn)展，在評(píng)估NDMM和RRMM病人的預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)CPC的生物學(xué)特征和病理生理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。