人類免疫缺陷病毒解剖學(xué)病毒儲存庫與檢測方法的研究進展

賴菁貞，張洪，梁浩，寧傳藝

1. 廣西艾滋病防治研究重點實驗室， 廣西壯族自治區(qū) 南寧 530021； 2. 廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530021； 3. 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530021； 4. 廣西醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530021

自20世紀(jì)90年代提出高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染由一種高致死性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)榭煽氐穆愿腥拘约膊?。目前只要HIV感染者堅持服用HAART藥物，其體內(nèi)的病毒復(fù)制基本可被抑制，這意味著病毒對感染者免疫功能的破壞可暫時被終止，感染者免疫力能夠逐步恢復(fù)[1-2]。維持一定水平血藥濃度的抗病毒藥物雖能長期抑制病毒復(fù)制，但HAART不能徹底清除體內(nèi)病毒，最主要原因是HIV感染者體內(nèi)病毒潛伏感染于細胞中形成的病毒儲存庫，這些潛伏感染的病毒能夠躲避人體免疫系統(tǒng)的識別[3-4]。鑒于此，本文對HIV解剖學(xué)儲存庫及其檢測方法進行綜述，期望為獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)防治工作提供資料。

1 HIV儲存庫

潛伏病毒是指整合在宿主DNA上的前病毒，它們平時不產(chǎn)生病毒，但是在合適的信號刺激下能夠釋放病毒顆粒。潛伏感染細胞是潛伏病毒的載體細胞，是病毒儲存庫的最小實體，這個定義僅限于靜息感染細胞[5]。盡管HAART在抑制HIV復(fù)制方面非常有效，但在治療期間，病毒仍然能潛伏于作為宿主的靜息CD4+T細胞中，一旦停止HAART，病毒復(fù)制便會迅速反彈。多個研究表明，在長期接受HAART(10～30個月)的HIV感染者體內(nèi)仍然存在能夠產(chǎn)生病毒的HIV儲存庫，即使其血漿病毒載量已經(jīng)低于檢測閾值[6-8]。

HIV感染者體內(nèi)的病毒儲存庫在感染早期即可形成，主要以兩種形式存在：一種是未整合進入人類基因組的HIV DNA，主要是游離于細胞核內(nèi)的1-長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)環(huán)和2-LTR環(huán)[9-10]，能進行穩(wěn)定的低水平復(fù)制，然而其尚未整合進入宿主DNA，故存在的半衰期僅為數(shù)周，無法形成長期存在的儲存庫；另一種是完全整合進入宿主基因組的HIV前病毒，其有較高的穩(wěn)定性和隱蔽性，能夠長期存在于宿主靜息細胞DNA內(nèi)，是清除HIV感染的主要障礙，也是病毒儲存庫形成的主要原因。Brodin 等[11]使用隊列研究設(shè)計和深度測序的方法， 選取10例HIV感染者，在其確診后5年提取血漿病毒RNA(尚未開始抗病毒治療)，并在其抗病毒治療成功抑制HIV至少2年后從其外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中分離出前病毒DNA，對其中的p17gag序列進行縱向檢測和比較，經(jīng)系統(tǒng)進化分析后發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療后的DNA序列中約60%與抗病毒治療開始前血漿中的RNA變異是相似的。Abrahams 等[12]也比較了9名接受治療的HIV感染者外周血CD4+T細胞中可復(fù)制的活性病毒序列和治療前血液中循環(huán)的病毒序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從系統(tǒng)進化樹上來看，治療后潛伏期誘發(fā)的特定病毒與治療開始前的病毒在遺傳上大約有71%的序列是相似的。這些研究說明病毒儲存庫在患者體內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，且不易被清除。

2 HIV解剖學(xué)儲存庫

HIV儲存庫不僅指某些特定的細胞類型，還包括具體組織、器官等生理解剖學(xué)儲存庫，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、生殖系統(tǒng)、消化道相關(guān)淋巴組織、腎等[13-14]。解剖學(xué)病毒儲存庫的存在導(dǎo)致這些組織、器官由于持續(xù)存在低水平病毒復(fù)制而產(chǎn)生炎癥或者容易誘發(fā)機會性感染。

2.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)

HIV在CNS中的感染機制仍未明確。HIV可通過感染單核細胞或CD4+T細胞后隨血液遷移至CNS，或因為炎癥前細胞因子和病毒蛋白的分泌改變血-腦屏障上皮細胞的通透性，促進HIV進入CNS，或利用受感染的上皮細胞，通過轉(zhuǎn)胞吞作用到達另一側(cè)，或利用反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)上皮細胞凋亡，通過釋放病毒蛋白來改變血-腦屏障的通透性[15]。最終，HIV可在CNS內(nèi)的血管旁巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和星狀細胞形成潛伏感染，構(gòu)成CNS病毒庫[16-17]。其中，小膠質(zhì)細胞是存活時間較長的細胞，可存活數(shù)年，可致其成為主要的CNS病毒潛伏庫[17-18]。同時，相對于其他解剖學(xué)儲存庫，血-腦屏障的存在使得抗病毒藥物很難進入CNS，從而無法清除CNS中的游離HIV。對病毒準(zhǔn)種的遺傳分析揭示了HIV在CNS中存在區(qū)室化復(fù)制特點[19-21]。

2.2 肺

肺和支氣管是非常重要的HIV潛伏病毒庫[22-23]。肺也是AIDS患者發(fā)生機會性感染的重要器官之一。除了在大部分患者肺泡巨噬細胞中可以檢測到HIV以外[23]，感染動力學(xué)表明，病毒釋放的早期峰值隨著可檢測到的HIV Gag蛋白和HIV RNA的減少而降低，并達到低水平穩(wěn)定狀態(tài)，從而形成潛伏病毒庫[23]。早期研究結(jié)果表明，AIDS患者支氣管肺泡灌洗液細胞中的HIV前病毒DNA水平超出外周血白細胞的7.6倍[24]。Brenchley等[25]研究顯示，被HIV感染的支氣管肺泡灌洗細胞比例與被感染的血細胞比例相近。Costiniuk等[26]對接受HAART且體內(nèi)病毒復(fù)制被抑制的患者支氣管肺泡灌洗細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中的前病毒DNA較血液中的更加富集。對感染猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV；HIV的猿類同系病毒)的恒河猴的研究表明，肺和腸道內(nèi)的病毒血癥水平最高，僅次于淋巴結(jié)，在HAART有效抑制血液病毒期間也是如此[27]。對HIV準(zhǔn)種的分析也提示肺中嗜巨噬細胞HIV-1變異存在區(qū)室化[20]。

2.3 生殖系統(tǒng)

睪丸也被認為是接受抗病毒治療患者HIV解剖學(xué)儲存庫。早期研究報道，可從接受HAART患者的精子中分離出有復(fù)制能力的HIV-1，盡管其血漿中的HIV DNA已無法檢測到，這提示男性生殖道可能是HIV的病毒儲存庫之一[28]。近年來，Jenabian等[29]研究報道，從抗病毒抑制的所有6名研究對象的至少一個睪丸中檢測到HIV總DNA，且其中5名研究對象能檢測到整合的HIV DNA。此外，與PBMCs相比，HIV感染和未感染研究對象的睪丸組織中的效應(yīng)記憶T細胞增加，且睪丸中T細胞的趨化因子受體5(chemokine receptor 5，CCR5)表達明顯增加。有研究利用基因進化分析研究睪丸組織和血液來源的HIV的多樣性和區(qū)室化特征。隨著HIVnef完整序列的進化，60%研究對象的血液與睪丸組織中的HIV呈現(xiàn)明顯的區(qū)室化，提示睪丸可能是HIV的解剖學(xué)病毒庫[30]。

有研究對異性性傳播感染HIV-1 7個月內(nèi)的72名婦女宮頸黏膜擦拭采樣，同時采集外周血，利用二代測序技術(shù)比較宮頸和外周血樣本中的HIV-1多樣性，發(fā)現(xiàn)生殖道內(nèi)獲得的HIV-1具有更高的多樣性[31]。Cantero-Pérez等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，接受抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(anti-retroviral therapy，ART)的HIV陽性女性宮頸組織中含有高水平的病毒DNA和RNA。以上研究提示，宮頸很可能也是重要的解剖學(xué)病毒庫。

2.4 其他解剖學(xué)病毒庫

除上述3個研究較多的解剖學(xué)儲存庫以外，還有很多其他的HIV解剖學(xué)病毒庫，如淋巴結(jié)、腎臟、眼等。長期ART過程中外周血和淋巴結(jié)中持續(xù)存在的被HIV-1感染的細胞混合均勻，淋巴結(jié)中的病毒不存在區(qū)室化現(xiàn)象，且淋巴結(jié)中的HIV-1潛伏庫持續(xù)存在是因為HAART之前被感染的細胞持續(xù)增殖，而非HAART期間病毒持續(xù)復(fù)制[33]。一項關(guān)于外周濾泡輔助T(peripheral follicular helper T, pTFH)細胞的研究表明，大量累積于淋巴結(jié)的pTFH細胞是非常重要的HIV庫，其中潛伏感染X4-嗜性HIV-1的患者罹患機會性感染的風(fēng)險更大[34]。此外，Canaud等[35]的研究揭示HIV-1可感染移植腎，進而在腎臟形成潛伏庫；HIV還可以從淚液、結(jié)膜上皮細胞、角膜、視網(wǎng)膜等眼部重要分泌物/組織中分離出來[36]。

3 HIV儲存庫的檢測方法

3.1 病毒生長實驗(viral outgrowth assays, VOA)

定量病毒生長實驗(quantitative VOA, QVOA)可以檢測靜息CD4+T細胞在受到刺激時釋放活性病毒的細胞數(shù)量，被認為是確定接受抗病毒治療的HIV感染者體內(nèi)病毒儲存庫大小的金標(biāo)準(zhǔn)[37]。在實際應(yīng)用中，研究人員發(fā)現(xiàn)，QVOA不能檢測出有缺陷的前病毒，常低估具有復(fù)制能力的病毒儲存庫的大小[38]，所以研究人員進一步優(yōu)化QVOA并提出定性定量VOA(qualitative QVOA, Q2VOA)[39]和多輪刺激VOA(multiple stimulation VOA, MS-VOA)[40]。Q2VOA在QVOA的基礎(chǔ)上對檢測到病毒顆粒的培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液進行env區(qū)測序及中和實驗，在對具有復(fù)制能力的病毒進行定量檢測的同時分析其遺傳和生物多樣性[39]。MS-VOA增加了對細胞的刺激次數(shù)，使CD4+T細胞在經(jīng)過多輪植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)刺激后復(fù)制、釋放出更多病毒顆粒，可用于評估先前在T細胞激活反應(yīng)中增殖而不產(chǎn)生感染性病毒的細胞是否可以通過額外刺激釋放病毒，從而更加準(zhǔn)確地估計儲存庫的大小[40]。然而VOA所需時間較長，且需大量血液(120～180 mL)或其他組織細胞[37-38]，并須在生物安全三級實驗室中進行[41]。

3.2 TZA(TZM-bl based assay)

TZA是基于TZM-bl細胞對血液中的HIV儲存庫進行定量檢測的實驗方法[42]。使用強病毒潛伏激活劑激活從外周血分離的靜息CD4+T細胞，經(jīng)洗滌、計數(shù)后，將這些激活的細胞與TZM-bl報告細胞共培養(yǎng)，通過檢測實驗組和陰性對照組中β-半乳糖苷酶的表達量，對具有復(fù)制能力的HIV-1進行定量。TZA可用于估計可被誘導(dǎo)的潛伏病毒部分[42-43]，相比于VOA，其基于細胞系的檢測體系及對患者外周血需求量小，可以實現(xiàn)高通量的儲存庫檢測，并用于兒童及組織樣本中的儲存庫檢測[44]，但是TZA必須設(shè)立陰性對照組才能對病毒儲存庫進行估算。

3.3 微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)

ddPCR是近年來新興的一種數(shù)字PCR技術(shù)，通過將反應(yīng)體系無限稀釋至 1 000 萬份，其中每個微滴不含待檢靶病毒分子或只含一個待檢靶病毒分子[45]。經(jīng)PCR擴增后，對每個微滴逐個進行檢測，有熒光信號的微滴判為1，沒有熒光信號的微滴判為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的比例即可計算出靶病毒分子的起始拷貝數(shù)或濃度。通過ddPCR對HIV-1總DNA進行定量是臨床研究中常用的一種評估病毒儲存庫的方法[46]，可以對多種生物樣本中的HIV-1 DNA進行檢測[13,47-48]，可檢測到含量極低的病毒序列[45]，且無需標(biāo)準(zhǔn)品即可檢測出靶病毒分子的起始拷貝數(shù)或濃度[45]。但是，由于絕大多數(shù)可檢測到的HIV-1基因組不能進行復(fù)制，因此用HIV-1 DNA定量會過高估計病毒儲存庫的大小[38]。

3.4 Tat/rev誘導(dǎo)有限稀釋試驗(Tat/rev induced limiting dilution assay, TILDA)

TILDA是一種基于PCR的實驗方法，可以估計產(chǎn)生Tat/rev多重剪接RNA(multiply spliced RNA, msRNA)的HIV-1感染CD4+T細胞數(shù)[49]。該試驗將分子方法與限制稀釋試驗相結(jié)合，提高檢測的敏感性，能夠從少量血液樣本中準(zhǔn)確定量檢測臨床相關(guān)病毒儲存庫大小。但是，盡管所有釋放病毒顆粒的細胞都在產(chǎn)生tat/revmsRNA，但反過來未必正確，所以TILDA可能過度估計病毒儲存庫的大小[49]。此外，TILDA依賴于HIV基因組一個高度可變區(qū)域的擴增，實驗中使用的引物和探針可能因不能識別所有的病毒準(zhǔn)種而不能準(zhǔn)確估計病毒儲存庫大小[49]。

4 結(jié)語

HIV儲存庫的存在導(dǎo)致HIV感染至今無法被治愈，HIV感染的持續(xù)存在導(dǎo)致宿主機體特定解剖學(xué)儲存庫易發(fā)生多種機會性感染，而HIV儲存庫與機會性感染之間的關(guān)系尚不明確，因此有必要開展HIV儲存庫與機會性感染相互作用的機制研究。此外，關(guān)于HIV儲存庫檢測方法缺乏統(tǒng)一的檢測金標(biāo)準(zhǔn)，存在嚴(yán)重高估或者低估病毒儲存庫的爭論。因此，有必要開發(fā)更加準(zhǔn)確、簡便、快速的HIV儲存庫檢測技術(shù)，以進一步指導(dǎo)臨床上AIDS的治療及預(yù)后評估。