微塑料聚乙烯、聚氯乙烯對(duì)大型蚤的毒性作用研究

?；哿?宋怡彤

摘要：本實(shí)驗(yàn)以大型蚤為模式生物，探討兩種微塑料對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)、繁殖及營(yíng)養(yǎng)狀況等毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，5 μm粒徑的PE和PVC對(duì)大型的LC50-96h值分別為199.99 mg·L-1和48.19 mg·L-1，兩種微塑料暴露21 d后，PE和PVC顯著抑制大型蚤的脫皮數(shù)和心率以及降低大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量.

關(guān)鍵詞：微塑料，PE，PVC，毒性效應(yīng)

Study on the Toxicity of Polyethylene and Polyvinyl Chloride to Daphnia magna in microplastics

Zhu Huiling，Song Yitong

Department of biology and environmental engineering，Zhejiang Shuren University，Hangzhou，310015，China

Abstract：In this experiment，Daphnia magna was used as a model organism to investigate the toxic effects of two microplastics on the growth，reproduction and nutritional status of Daphnia magna.The results showed that the LC50–96 h values of PE and PVC with 5μm particle size for Daphnia magna were 199.99 mg·L-1and 48.19 ?mg·L-1，respectively.After exposure to two microplastics for 21 days，PE and PVC significantly inhibited the desquamation number and heart rate of Daphnia magna and reduced the content of protein in Daphnia magna.Keywords：microplastics，PE，PVC，toxic effects，mechanism

1.引言

微塑料（MPs）是指直徑小于5 mm的塑料碎屑和顆粒，其作為一種新興環(huán)境污染物已引起了全球研究學(xué)者和公眾的廣泛關(guān)注。目前的研究證明，微塑料廣泛存在于全球海洋、地表水、土壤、沉積物和空氣等環(huán)境介質(zhì)中，微塑料的來(lái)源、分布、毒理效應(yīng)、生態(tài)及健康風(fēng)險(xiǎn)已成為研究熱點(diǎn)[1]。水環(huán)境中最常檢測(cè)到的微塑料主要包括聚乙烯（PE）、聚氯乙稀（PVC）、聚丙?。≒P）、聚苯乙烯（PS）等。其中PE是乙烯經(jīng)聚合制得的一種熱塑性樹(shù)脂，主要用于身體、面部磨砂膏等個(gè)人護(hù)理用品和食品包裝膜、水瓶等;PVC是氯乙烯單體在過(guò)氧化物、偶氮化合物等引發(fā)劑或在光、熱作用下按自由基聚合反應(yīng)機(jī)理聚合而成的聚合物，主要用于排水管、電線、電纜、插銷(xiāo)、汽車(chē)材料、醫(yī)療器械等。我國(guó)是PE、PVC的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，2019年的消費(fèi)量分別達(dá)到3383萬(wàn)噸和2027萬(wàn)噸[2]。微塑料在水環(huán)境中漂浮、沉積和轉(zhuǎn)移，不可避免地與浮游生物發(fā)生接觸，了解微塑料對(duì)浮游生物的影響是評(píng)價(jià)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要依據(jù)。對(duì)于水生植物而言，微塑料的存在會(huì)降低下層水體的透明度，從而抑制其光合作用;而對(duì)于水生動(dòng)物，當(dāng)微塑料尺度小于動(dòng)物攝食口器的大小時(shí)則可以直接進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)食物鏈在營(yíng)養(yǎng)級(jí)之間轉(zhuǎn)移，危害大型水生動(dòng)物和整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)。此外，微塑料還可能吸附環(huán)境中的其他污染物而構(gòu)成復(fù)合污染[3]。枝角類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中的重要環(huán)節(jié)，它們對(duì)毒物有很強(qiáng)的敏感性。由于大型蚤在水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中的優(yōu)越性地位，且生殖周期短、繁殖迅速、對(duì)水體中有害污染物敏感（在各種環(huán)境壓力下，表現(xiàn)出生殖力下降、活動(dòng)抑制等行為異常）等特點(diǎn)，使其作為國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)生物廣泛應(yīng)用于水環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)和水生生態(tài)毒理學(xué)研究中[4]。美國(guó)環(huán)保局于1978年將大型蚤定為毒性試驗(yàn)的必測(cè)項(xiàng)目，建立了大型蚤急性毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法。1991年，我國(guó)也建立了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法[5]，塑料降解過(guò)程產(chǎn)生的一系列的脅迫因子不可避免地會(huì)對(duì)大型蚤產(chǎn)生影響，研究微塑料對(duì)大型蚤的毒性對(duì)評(píng)價(jià)微塑料的生態(tài)效應(yīng)具有重要的意義[6]。

本研究以PE和PVC為研究對(duì)象，以水環(huán)境初級(jí)消費(fèi)者大型蚤為模式生物，通過(guò)探討兩種微塑料PE和PVC對(duì)大型蚤的急性毒性致死率以及21d慢性藥物暴露對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)、繁殖及體內(nèi)蛋白質(zhì)含量等毒性效應(yīng)，評(píng)價(jià)PE、PVC對(duì)水生態(tài)環(huán)境的影響及可能的健康風(fēng)險(xiǎn)，為微塑料類物質(zhì)的生態(tài)危害及可能的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1模式生物大型蚤和其食物斜生柵藻的實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)

大型蚤（Daphnia magna）是購(gòu)自武漢科樂(lè)多生物科技有限公司大型蚤62 D.M生物株。選用OECD M4培養(yǎng)基作為大型蚤的培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為pH 7.8±0.2，硬度250 mg·L-1±25 mg·L-1（以CaCO3表示），Ca/Mg摩爾比接近4：1，溶解氧濃度大于2 mg·L-1。大型蚤培養(yǎng)4代后，以出生6-24 h的同批幼蚤進(jìn)行毒性試驗(yàn)。斜生柵藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，以水生4號(hào)（HB-IV）人工培養(yǎng)液作為斜生柵藻的培養(yǎng)基。所有使用到的玻璃器皿及培養(yǎng)液均經(jīng)過(guò)HVE-50自動(dòng)高壓滅菌器121℃高溫滅菌30 min，冷卻后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用紫外線照射滅菌30 min，避免藻種受到其他藻類和細(xì)菌的污染。接種方法：用1000 mL三角燒瓶移取400～600 mL新鮮的水生4號(hào)培養(yǎng)基，接入藻種使之成為淡綠色。接種完成后用八層滅菌過(guò)的無(wú)紡紗布封口防止藻液受到污染，并標(biāo)上接種日期和種類，移至智能人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光暗比12 h：12 h，光照強(qiáng)度2000 lux左右，培養(yǎng)溫度25℃左右，每天定期搖瓶5～6次防止藻種老化沉淀，以5-6天的頻率接種一次。經(jīng)常鏡檢觀察藻種是否單一（形狀上觀察）、有無(wú)其它雜菌。預(yù)培養(yǎng)3代，鏡檢細(xì)胞正常，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2PE和PVC測(cè)試液的配制

低密度聚乙烯（PE）和聚氯乙烯（PVC）購(gòu)自上海陽(yáng)勵(lì)機(jī)電科技有限公司，均為5 μm優(yōu)級(jí)純微粉。試驗(yàn)所用其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。分散劑Tween80溶液的配置：先用移液槍取1.5μL的分散劑Tween80加入到含100mL大型蚤M4培養(yǎng)基的燒杯中，在漩渦振蕩器上震蕩30s后，超聲分散30min，即得到分散劑溶液。稱取0.04g粉末狀聚乙烯（或聚氯乙烯）顆粒于100mL分散劑溶液中，在漩渦振蕩器上震蕩1min后，超聲分散30min，得到400mg/L的聚乙烯（或聚氯乙烯）測(cè)試液。其他濃度配制方法同理。

2.2 PE和PVC對(duì)大型蚤的急性毒性

按照ISO標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法進(jìn)行聚乙烯和聚氯乙烯對(duì)大型蚤的急性毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)容器為潔凈的50 mL小燒杯，盛20 mL試驗(yàn)溶液，每個(gè)燒杯中放入5只剛出生6-24h的幼蚤，PE和PVC的大型蚤暴露濃度均設(shè)置為0、12.5、25、50、100、200、400 mg·L-1，水溫20～22°C，光照周期為16h光照：8h黑暗，試驗(yàn)期間不喂食，每個(gè)濃度5組平行，連續(xù)暴露96 h后，分別記錄大型蚤24、48、72、96 h的死亡情況，計(jì)算兩種微塑料對(duì)大型蚤的致死率并采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算PE和PVC對(duì)大型蚤半數(shù)致死濃度LC50值。

2.3 PE和PVC對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)繁殖等慢性毒性

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)求得的兩種微塑料對(duì)大型蚤L(zhǎng)C50值，慢性試驗(yàn)的PE濃度設(shè)置分別為0、12.5、25、50、100 mg·L-1;PVC濃度設(shè)置為0、3、6、12、24 mg·L-1，慢性毒性試驗(yàn)按照OECD標(biāo)準(zhǔn)方法。每個(gè)燒杯中放1只剛出生6-24h的幼蚤，每濃度設(shè)置10個(gè)平行，染毒過(guò)程中保證蚤類的生活環(huán)境適宜和食物充足，并且每天定時(shí)觀察、記錄和分離幼蚤，每3d更換一次培養(yǎng)液，其余條件與急性毒性試驗(yàn)相同。每天記錄大型蚤脫皮情況并且及時(shí)移出。試驗(yàn)21 d后統(tǒng)計(jì)兩種藥物各濃度下的脫皮數(shù)，并于XD-202倒置生物顯微鏡下測(cè)定大型蚤的心率。心率的測(cè)定步驟：使用XD-202倒置生物顯微鏡對(duì)每組隨機(jī)挑選3只大型蚤進(jìn)行1min的錄像，然后使用計(jì)數(shù)器對(duì)錄像結(jié)果進(jìn)行大型蚤跳動(dòng)次數(shù)的計(jì)數(shù)，每個(gè)視頻計(jì)數(shù)三次。

2.4 PE和PVC對(duì)大型蚤蛋白質(zhì)含量的影響

取暴露21 d的大型蚤，超純水沖洗干凈并吸干水分后稱重，加入3 mL0.9%的生理鹽水，在冰水浴條件下超聲破碎 15 min機(jī)械勻漿，勻漿液于高速冷凍離心機(jī)中4℃、15000 r·min-1離心10 min后，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定大型蚤蛋白質(zhì)含量。步驟：準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，即為100 ug·mL-1的原液。稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容到250 mL。取6 支10 mL 干凈的離心管，按表1 取樣。蓋塞后混合，放置2 min 后用1 cm 光經(jīng)的比色杯在595 nm 波長(zhǎng)下比色，記錄各管測(cè)定的光密度OD595 nm，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 mL 離心管 ，按下表取樣。吸取提取液0.2 mL，放入離心管 中，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 蛋白試劑，充分混合，放置2 min 后用1 cm 光徑比色杯在595 nm 下比色，記錄光密度OD 595 nm，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（μg）。

2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用origin8.0進(jìn)行處理和作圖，采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并用Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析檢驗(yàn)，p<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果采用means±SD的方法。

3.結(jié)果與討論

3.1 PE和PVC對(duì)大型蚤的急性毒性

圖1為PE和PVC對(duì)模式生物大型蚤24h、48h、72h、96h的急性毒性影響結(jié)果。由圖可得出，在濃度為12.5mg·L-1的PE和PVC暴露組，模式生物大型蚤均出現(xiàn)死亡，隨著時(shí)間的推移，尤其以PVC暴露下的大型蚤死亡率最為明顯，而PE暴露組大型蚤死亡率則微有波動(dòng)。兩種微塑料對(duì)模式生物大型蚤的致死作用會(huì)隨著時(shí)間的推移而加大，由圖可見(jiàn)，微塑料PVC暴露組下的大型蚤死亡率增大較微塑料PE暴露組明顯。微塑料PE暴露組在24h急性毒性作用下，模式生物大型蚤未出現(xiàn)死亡，也說(shuō)明了微塑料PE對(duì)大型蚤的急性致死作用要稍低于微塑料PVC。微塑料PE在分散劑Tween80作用下在純水中呈懸浮狀態(tài)，而微塑料PVC呈現(xiàn)乳濁液，所以隨著時(shí)間的增加模式生物大型蚤的死亡率增大，微塑料PE暴露組50mg·L-1濃度下，大型蚤的死亡率和400mg·L-1濃度暴露組相當(dāng)，原因是隨著時(shí)間的推移，微塑料PE慢慢聚集，50mg·L-1濃度下微塑料聚集度不高剛好可以被大型蚤攝取，而100mg·L-1和200mg·L-1濃度下的微塑料PE聚集度過(guò)大，導(dǎo)致大型蚤無(wú)法攝取。微塑料對(duì)大型蚤的致死原因不僅表現(xiàn)在大型蚤攝入體內(nèi)產(chǎn)生的消化道等堵塞，還會(huì)纏在大型蚤身上，使得大型蚤游動(dòng)能力下降而死亡，所以在400mg·L-1濃度下，大型蚤死亡的原因可能是游動(dòng)能力受到了束縛而致死。微塑料PVC在純水中呈乳濁液，隨著時(shí)間增加，會(huì)有部分沉在燒杯底部，所以其對(duì)大型蚤的致死情況也表現(xiàn)出在微塑料100mg·L-1與400mg·L-1濃度下相當(dāng)。

實(shí)驗(yàn)求得PE和PVC對(duì)大型蚤的LC50-96h值分別為107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1。李勤和方海燕等分別了考察了不同粒徑大小的PVC對(duì)大型蚤的急性毒性作用發(fā)現(xiàn)，15 μm的PVC微塑料對(duì)大型蚤L(zhǎng)C50-96h為130.1 mg·L-1 [7];2 μm的PVC對(duì)大型蚤48 h LC50為20.5 mg·L-1 [8]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)。

3.2 PE和PVC對(duì)大型蚤脫皮數(shù)和心率的影響

經(jīng)過(guò)21d的微塑料PE和PVC的慢性暴露，各濃度組僅有少數(shù)大型蚤死亡。微塑料PE暴露組12.5mg·L-1濃度第10天死亡1只、50mg·L-1濃度第19天死亡1只、100mg·L-1濃度第6天死亡1只;微塑料PVC暴露組6mg·L-1濃度第13天和第17天各死亡1只。脫皮數(shù)是大型蚤生長(zhǎng)的一個(gè)指標(biāo)，大型蚤每脫一次皮代表大型蚤生長(zhǎng)發(fā)育一回。微塑料PE和PVC兩種藥物暴露21d的慢性毒性試驗(yàn)，每天觀察大型蚤的繁殖代謝情況，記錄每只母蚤在實(shí)驗(yàn)期間的蛻皮數(shù)，21d后統(tǒng)計(jì)總脫皮數(shù)。微塑料PE暴露組從小到大各個(gè)濃度下21d大型蚤的脫皮總數(shù)分別為61個(gè)、61個(gè)、69個(gè)、57個(gè);微塑料PVC暴露組從小到大各個(gè)濃度下21d大型蚤的脫皮總數(shù)分別為77個(gè)、76個(gè)、73個(gè)、71個(gè)，與對(duì)照組脫皮數(shù)84個(gè)相比均低于對(duì)照組。表明兩種藥物暴露阻礙了大型蚤的生長(zhǎng)，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。

試驗(yàn)21 d后于XD-202倒置生物顯微鏡下測(cè)定大型蚤心率，由圖2大型蚤于兩種微塑料中暴露21 d后的心率變化結(jié)果可見(jiàn)，12.5～100 mg·L-1 PE作用下大型蚤的心率分別相當(dāng)于對(duì)照值的81.5%、79.8%、72.8%和70.1%;3～24 mg·L-1 PVC作用下的大型蚤的心率分別相當(dāng)于對(duì)照值的89.4%、80.1%、69.9%和61.8%，均顯著低于對(duì)照。說(shuō)明在兩種微塑料藥物的暴露下，大型蚤的心臟功能發(fā)生了變化，會(huì)降低機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)的速率，導(dǎo)致大型蚤對(duì)攝入體內(nèi)的食物的消化吸收能力降低，從而加速大型蚤的死亡。對(duì)比兩種微塑料對(duì)大型蚤心率的影響來(lái)看，微塑料PE暴露組大型蚤的心率呈現(xiàn)陡坡式下降，而微塑料PVC暴露組大型蚤的心率呈直線型下降。且兩種微塑料的最高濃度組PVC24 mg·L-1的心率比 PE100 mg·L-1的心率更低，由此可以看出，微塑料PVC暴露組對(duì)大型蚤心率的影響較微塑料PE暴露組更大。

3.3 PE和PVC對(duì)大型蚤蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)是評(píng)價(jià)大型蚤營(yíng)養(yǎng)狀況的指標(biāo)之一，當(dāng)大型蚤長(zhǎng)時(shí)間暴露在微塑料中，微塑料會(huì)進(jìn)入大型蚤消化道造成消化道堵塞，導(dǎo)致大型蚤攝入體內(nèi)的食物長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法消化，體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低;再者，大型蚤把微塑料當(dāng)成食物攝入體內(nèi)造成飽腹感，而微塑料在體內(nèi)無(wú)法被大型蚤消化吸收，所以導(dǎo)致大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降。

由圖3大型蚤于兩種微塑料中暴露21 d后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果可見(jiàn)，微塑料PE暴露組隨著濃度的增加，模式生物大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)呈階梯型下降的趨勢(shì)。而相對(duì)于微塑料PE暴露組，微塑料PVC暴露組大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著濃度逐漸增大下降的趨勢(shì)比較平緩，尤其是濃度0～12 mg·L-1 大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降趨勢(shì)微小，而濃度為24mg·L-1 大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著下降。我們猜測(cè)，微塑料PE經(jīng)分散劑Tween80分散后在純水中呈懸浮狀，顆粒較大，大型蚤攝入體內(nèi)后產(chǎn)生的飽腹感以及造成腸道堵塞的程度大，所以隨著濃度的增加，大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈明顯的下降趨勢(shì)。而微塑料PVC經(jīng)分散劑Tween80分散后是乳濁液，形態(tài)與大型蚤攝入體內(nèi)的食物斜生柵藻相似，在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)大型蚤腸道內(nèi)的堵塞程度不明顯，大型蚤對(duì)食物的消化能力沒(méi)有受到很大程度上的限制，但當(dāng)微塑料PVC濃度達(dá)到一定程度，大型蚤腸道堵塞嚴(yán)重，影響了其對(duì)食物的消化，抑制了體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，所以當(dāng)濃度為24 mg·L-1 時(shí)，大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了急劇降低的現(xiàn)象。

4.結(jié)論與應(yīng)用前景展望

（1） 96 h的急性毒性試驗(yàn)求得5 μm粒徑的PE和PVC對(duì)大型的LC50-96h值分別為107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1，表明相同條件下PVC對(duì)大型蚤的急性毒性較PE更強(qiáng)。

（2） PE和PVC兩種微塑料暴露21 d后，較高濃度的PE和PVC對(duì)大型蚤生長(zhǎng)和繁殖等生命活動(dòng)均具有顯著影響。表現(xiàn)為大型蚤的脫皮數(shù)減少，在XD-202倒置生物顯微鏡下測(cè)得的大型蚤心率下降，說(shuō)明兩種藥物對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。

（3） PE和PVC兩種微塑料暴露21d后，模式生物大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著藥物濃度的升高而呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，表面兩種微塑料對(duì)大型蚤的營(yíng)養(yǎng)狀況產(chǎn)生了危害作用。

（4）微塑料是一種新型環(huán)境污染物，成為了近年來(lái)比較熱門(mén)的研究對(duì)象，國(guó)內(nèi)對(duì)微塑料毒性的探索還在比較淺層的階段。微塑料不僅會(huì)對(duì)水環(huán)境、大氣環(huán)境、土壤環(huán)境等造成危害，而且對(duì)生物及人類的危害是不可估量的。由于微塑料毒害的潛在性和漫長(zhǎng)性，人們?nèi)菀缀鲆曀拇嬖?，但是現(xiàn)階段對(duì)微塑料的研究以及探索解決微塑料污染的辦法是人們亟待解決的問(wèn)題。對(duì)微塑料毒性的探索是一個(gè)永無(wú)止境的過(guò)程，它將會(huì)是人類探索道路上的一大挑戰(zhàn)。

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作者簡(jiǎn)介：祝慧玲（1998-），籍貫：浙江衢州人，浙江樹(shù)人大學(xué)，大學(xué)本科，毒理學(xué)方向。