Caveolin-1在肝纖維化中作用的研究*

張 潔 楊子衡 王 燕 孫 泉,

(1.首都醫(yī)科大學實驗動物部，北京 100069)(2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院實驗動物學系，北京 100069)(3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100053)

肝纖維化是機體對肝炎病毒、酒精、藥物等致病因素所致慢性肝臟損傷后的一種修復反應，是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理過程[1]。隨著肝纖維化具有可逆性被證實，通過抗纖維化療法來減輕肝纖維化程度，延緩早期肝硬化變得尤為重要[2]。

小窩蛋白-1(Caveolin-1)是一種整合膜蛋白，其在組織修復和纖維化中的重要性逐漸被證實。Tourkina等[3]研究顯示，Caveolin-1在抑制纖維增生和組織重塑過程中發(fā)揮重要作用。在放射誘導的肺纖維化大鼠和小型豬中，誘導纖維化前在肺上皮細胞中觀察到Caveolin-1表達下調(diào)。Wang等[4]證實，在博來霉素誘導的肺纖維化中，Caveolin-1表達水平也明顯下調(diào)，而且Caveolin-1敲除小鼠出現(xiàn)明顯肺纖維化。

Lu等[5]研究前期發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型小鼠肝組織中，Caveolin-1表達水平顯著下調(diào)。因此，推測Caveolin-1可能與肝纖維化的形成有關，但其在肝纖維化中發(fā)揮何種作用仍不清楚。本實驗擬通過建立10%四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液誘導的野生型小鼠及Caveolin-1敲除小鼠肝纖維化模型，比較分析肝臟炎性損傷及肝臟膠原指標的差異，初步探討Caveolin-1在肝纖維化中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Caveolin-1敲除小鼠，購自美國The Jackson Laboratory，雌雄各2只，首都醫(yī)科大學實驗動物部隔離飼養(yǎng)，取哨兵鼠檢測合格后，移至屏障環(huán)境內(nèi)，體成熟后按近交系原則，1∶1配種擴繁至F2代。

SPF級C57BL/6雌鼠和129雄鼠各5只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021-0006，首都醫(yī)科大學實驗動物部屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，體成熟后1∶1雜交配種，繁殖至F2代。

飼養(yǎng)間室溫22～24 ℃，相對濕度40%～60%，保持光照和避光12 h/12 h，飼喂小鼠專用繁殖飼料，自由飲食飲水。

1.2 實驗試劑

四氯化碳(CCl4)及化學純橄欖油，購自國藥集團化學試劑有限公司；α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)一抗及Ⅲ型膠原(collagen-Ⅲ)一抗，購自Cell signaling technology；β-actin、TRIzol、RNA溶解液、Real-time PCR試劑盒及蛋白marker，購自北京全式金生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PVDF膜，購自Millipore；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 實驗儀器

-80 ℃超低溫冰箱，購自SANYO；普通熒光顯微鏡，購自奧林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司；全自動多功能酶標儀，購自賽默飛世爾科技公司；凝膠成像分析儀，購自UVP；PCR儀及實時熒光定量PCR儀，購自Eppendorf；恒溫搖床，購自New Brunswich Scientific；電泳儀，購自上海天能科技有限公司等。

1.4 實驗方法

1.4.1動物分組及造模:實驗通過首都醫(yī)科大學福利倫理審查，動物實驗倫理號：AEEI-2016-150。取體質(zhì)量20～22 g，雄性，Caveolin-1敲除小鼠和C57BL/6與129只F2代小鼠，分別作為敲除組和野生組，用10% CCl4橄欖油溶液(CCl4∶橄欖油體積比=1∶9)，1 μL/g，2次/周，腹腔注射。每組另各取5只小鼠，腹腔注射同等劑量的橄欖油，做0 d對照。

1.4.2樣品采集與處理:每組動物分別于給藥后1、3、7、14和28 d各取出5只(提前禁食8 h)，心臟取血后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。

對小鼠進行斷頸處死后，打開腹腔，取出肝臟，去除膽囊，用PBS沖洗肝臟，摘取肝左葉，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片。每只小鼠制備兩個包塊，制成5～8張切片，分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色，在普通顯微鏡100倍鏡下，隨機選取三個視野采集照片。采用Image-ProPlus彩色圖像分析軟件對炎癥反應病灶區(qū)域進行圖像分析，計算變性壞死細胞占整個視野的面積比及計算膠原纖維面積占整個視野的百分比，分別進行肝臟炎性損傷及纖維化程度分析。

剪取小塊肝右葉組織，提取總RNA，進行RNA反轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR，引物序列見表1：

表1 引物序列表

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學檢驗

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為無統(tǒng)計學差異。采用GraphPad Prism作圖。

2 結果

2.1 血清中ALT和AST含量檢測

將相同組別的不同時間點分別與0 d比較，ALT含量均顯著升高(P<0.01)，提示注射CCl4橄欖油溶液1 d后，肝細胞即出現(xiàn)明顯損傷。相同時間點，將兩組對比后發(fā)現(xiàn)，0 d時，兩組無顯著性差異。給藥后1 d，血清ALT含量迅速達到最高值，后降低，趨于平緩。1 d、3 d和7 d時，敲除組小鼠血清ALT含量明顯高于野生組，其中3 d時差異極顯著(P<0.01)，而14 d和28 d時，敲除組小鼠血清的ALT含量低于野生組，其中14 d時差異顯著(P<0.05)，其它時間均無統(tǒng)計學差異(見表2)。

表2 小鼠血清ALT含量(U/L)

同一時間點的兩組數(shù)據(jù)相比，1 d、3 d、7 d和28 d時，敲除組小鼠血清中AST含量明顯高于野生組，尤以3 d時，差異極顯著(P<0.01)；14 d時，敲除組小鼠血清中AST含量略低于野生組，但無統(tǒng)計學差異(見表3)。

表3 小鼠血清AST含量(U/L)

2.2 HE染色結果

顯微鏡下觀察肝臟組織HE染色，正常小鼠(0 d)時肝組織形態(tài)正常，肝細胞以中央靜脈為中心，大致排列成板狀，均勻、整齊并成放射狀向外發(fā)散，肝細胞體積較大、胞漿豐富、邊緣明顯及細胞核位于中心且大致呈圓形。肝細胞無變性、壞死、炎性細胞浸潤等病理性變化(見圖1)。

造模后3 d時，中央靜脈及匯管區(qū)均可見明顯的淡染區(qū)，區(qū)域內(nèi)無細胞結構，炎性細胞浸潤明顯，肝索和肝小葉結構消失。上述區(qū)域，敲除組較野生組壞死明顯。7 d時，肝小葉結構仍紊亂、肝細胞明顯變大腫脹、細胞核濃縮、小部分細胞破裂和失去正常細胞結構。中央靜脈淤血并擴張，并伴隨炎性細胞浸潤。14 d時，中央靜脈周圍仍可見散在壞死區(qū)域，偶見少量淋巴細胞浸潤。

肝纖維化是一個動態(tài)的病理變化過程。野生組與敲除組小鼠均具有相同的進行性變化，但在相同時間段，敲除組小鼠肝組織中炎性細胞的浸潤更多，細胞變性、壞死的速度更快，壞死和纖維化面積更大(見圖1)。

圖1 小鼠肝組織HE染色及病灶面積占總視野的百分比

通過采用Image-Pro Plus彩色圖像分析軟件，對視野內(nèi)的病灶面積進行分析；3 d時，敲除組小鼠肝組織的病灶面積明顯大于野生組，差異極顯著(P<0.01)；7 d和14 d時，差異顯著(P<0.05)。

2.3 天狼腥紅染色結果

視野內(nèi)明顯的紅染部分為膠原纖維，正常小鼠肝組織可見中央靜脈及匯管區(qū)有少量膠原纖維。造模后，膠原纖維的分布明顯增多，并沿著血管向周圍散發(fā)；7 d時，滲入肝內(nèi)實質(zhì)，并逐漸向四周擴散；14 d和28 d時，膠原纖維分布逐漸匯集，最終連成線狀或環(huán)狀的纖維間隔。野生組和敲除組小鼠均呈現(xiàn)相同的變化趨勢。同一時間點，與野生組相比，敲除組肝膠原纖維形成的范圍更大，發(fā)展的速度更快(見圖2)。

0 d時，兩組肝組織的膠原含量無明顯差異。隨著造模時間的增加，肝纖維化不斷加重，膠原纖維面積占總視野的百分比逐漸增加，后期增加迅速。與野生組小鼠相比，7 d、14 d和28 d，敲除組小鼠肝組織中膠原纖維占視野面積比明顯升高，差異極顯著(P<0.01)，見圖2。

圖2 小鼠肝組織天狼猩紅染色及膠原纖維面積占總視野的百分比

2.4 Real-time PCR結果

以0 d為參照，3 d和14 d時，敲除組小鼠肝組織中α-SMA mRNA的表達量均高于野生組，差異顯著(P<0.05)。3 d時，敲除組collagen-ⅠmRNA的表達量低于野生組，但不具有統(tǒng)計學差異。14 d時，敲除組collagen-ⅠmRNA的表達量明顯高于野生組，差異極顯著(P<0.01)。3 d時，敲除組collagen-Ⅲ mRNA的表達量高于野生組，但差異不顯著。14 d時，敲除組collagen-Ⅲ mRNA的表達量高于野生組，差異極顯著(P<0.01)，見圖3。

圖3 Real-time PCR結果

2.5 Western blot結果

以β-actin為內(nèi)參，各組與β-actin的比值為相對表達結果。14 d時，敲除組小鼠肝組織中α-SMA、collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ蛋白表達量均高于野生組，顯色結果加深明顯，差異顯著(P<0.05)，見圖4。

圖4 肝組織α-SMA、collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ蛋白表達

3 討論

吳蘭婷等[6]報道，肝纖維化是指在肝臟受到各種損傷后，肝細胞發(fā)生反復而持續(xù)的炎癥或壞死，大量纖維組織異常增生的同時伴隨著纖維降解的相對不足，進而使細胞外基質(zhì)增生與降解的失調(diào)與失衡，表現(xiàn)為肝內(nèi)結締組織的異常增生與過量沉積。肝纖維化也是慢性肝臟疾病重要的病理特征之一。如果不在疾病早期及時采取治療措施，將會進一步惡化至肝硬化，甚至肝癌。肝纖維化的發(fā)展惡化已經(jīng)引起了全社會的廣泛關注，積極防治肝病，有效控制肝纖維化及肝硬化成為了急需解決的問題[7]。隨著國內(nèi)外臨床研究的開展，在肝纖維化早期及時的采取治療措施，纖維化是具有可逆性的[8]，而肝硬化則不能[9]，因而通過抗纖維化療法來減輕肝纖維化程度，延緩早期肝硬化，延長壽命變得尤為重要[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1在多器官纖維化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。Wang等[4]發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1通過負調(diào)控應激活化蛋白激酶信號通路，可抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞膠原分泌。Tourkina等[3]證實，通過敲減Caveolin-1表達，可以增強肺成纖維細胞絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路的活化，促進膠原合成。干擾Caveolin-1表達可導致腹膜纖維化及MEK/ERK通路過度活化，而過表達Caveolin-1可使腹膜上皮細胞恢復至正常狀態(tài)[11]。在肝臟疾病方面，研究顯示，在非酒精性脂肪肝炎[12]、肝硬化、肝再生組織中[13]及原發(fā)性肝癌組織中[14]，Caveolin-1表達上升，明顯高于正常肝臟，但對于該蛋白是否參與調(diào)控肝纖維化的形成，目前國內(nèi)外研究并不多見。

炎癥反應是肝纖維化形成和發(fā)展的必經(jīng)過程，Caveolin-1在減緩炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。王華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)大鼠肺組織Caveolin-1表達，能有效抑制Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信號通路，減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子釋放，減輕肺部炎癥水腫，從而保護機械通氣相關肺損傷。Gao等[16]證實，Caveolin-1通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)/轉(zhuǎn)錄因子(STAT3)/一氧化氮合酶(iNOS)信號通路活化，減緩肝損傷。Deng等[17]發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1缺失加劇刀豆蛋白A(ConA)誘導的肝細胞死亡和過度氮應激反應引起的鐵死亡，而上調(diào)肝臟Caveolin-1表達則抑制ConA誘導的鐵中毒和硝化應激。通過10%CCl4橄欖油溶液誘導小鼠肝纖維化模型，對肝臟組織病理及血清肝功指標的檢測，對比野生型小鼠和Caveolin-1敲除小鼠纖維化的多項指標。實驗中，小鼠纖維化的發(fā)展規(guī)律，模型制備初期，藥物經(jīng)血液運送至肝臟，發(fā)生炎癥反應，且反應強烈，細胞損傷發(fā)生，纖維化初步形成。ALT和AST是肝細胞損傷的診斷指標和輔助檢測指標，敲除組小鼠的兩項指標均顯著高于野生組小鼠，表明Caveolin-1缺失，肝細胞損傷程度加重，推測該蛋白的表達與肝臟炎癥反應有關，此結論在肝組織HE染色結果中得到了驗證。隨著病情的發(fā)展，肝細胞不斷修復及再生，炎性反應趨于平緩，隨著肝星狀細胞的不斷活化，促使膠原分泌，通過7、14和28 d肝組織的天狼腥紅染色可以明顯的觀察到膠原不斷增多，纖維化不斷形成，敲除組小鼠的發(fā)展速度要明顯快于野生組。α-SMA、collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ的表達同樣顯示，敲除組小鼠要顯著高于野生組。與Tourkina等[3]在肺纖維化及Gao等[4]在酒精性肝損傷的研究相似，本研究結果表明Caveolin-1敲除小鼠肝臟炎性損傷更重，肝纖維化程度更高。因此，Caveolin-1是纖維化的重要抑制因子，其機制可能與抑制炎癥反應相關。

細胞外基質(zhì)的降解和重塑是慢性肝臟疾病進展中的重要病理生理現(xiàn)象。根據(jù)Roeb[18]及Duarte等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)不僅影響細胞外基質(zhì)的降解和重塑，還可通過多種機制參與肝臟炎癥及免疫反應的調(diào)控。Miyasato等[20]發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化模型中，Caveolin-1敲除小鼠的膠原沉積進一步增強，并伴有MMP8和MMP13表達水平的顯著減少。注射Caveolin-1腳手架區(qū)多肽CSD的Caveolin-1敲除小鼠膠原沉積減少了4倍，而接受CSD治療的野生小鼠膠原沉積減少了2倍。因此，推測Caveolin-1可能通過上調(diào)MMPs的表達發(fā)揮抗肝纖維化的作用。在目前尚無有效方法根治肝纖維化的情況下，進一步闡明Caveolin-1調(diào)控肝纖維化的相關機制，開發(fā)針對Caveolin-1的治療方法對改善甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化和肝硬化具有潛在的應用價值[21]。