雞毒支原體檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

倪谷音，謝昊晉，金嘉旻，陸宇超，秦佳元

（1.無錫市動(dòng)物園管理處，江蘇無錫 214000；2.無錫市崇安區(qū)廣益街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇無錫 214000；3.無錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無錫 214000）

1 雞毒支原體分離培養(yǎng)

支原體分離培養(yǎng)較為困難。分離樣本主要為氣管、氣囊、肺臟或鼻竇的分泌物，常用的分離MG的人工培養(yǎng)基有FM-4培養(yǎng)基、改良Frey氏培養(yǎng)基和PPLO培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入20%的馬血清或豬血清，而后根據(jù)培養(yǎng)后的菌落形態(tài)、菌體形狀、生化特性結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)來確定。雞毒支原體分離的菌落呈圓形，邊緣整齊，透明，表面光滑，菌落中心色暗致密，邊緣薄園，呈“荷包蛋”狀。但該方法工作量大，耗費(fèi)時(shí)間長，并不適合于生產(chǎn)上的快速診斷和監(jiān)測(cè)。但某些時(shí)候如MIC測(cè)定，病原學(xué)研究等，需要獲得雞毒支原體菌株，就必須做支原體分離。AM Younis G等采用支原體分離和PCR技術(shù)分離和檢測(cè)了埃及351份發(fā)病肉雞樣本，（其中227份為氣管和氣囊組織樣本，124份為氣管拭子），結(jié)果共分離到159株支原體（45.29%），其中雞毒支原體100份（占分離總支原體量的62.89%）。Khalifa KA等從蘇丹出現(xiàn)呼吸道臨床癥狀的商業(yè)（蛋雞和肉雞）農(nóng)場采集的氣管拭子中分離到45個(gè)支原體分離菌株，其中8株為MG，3株為MS。

2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

雞毒支原體血清檢測(cè)技術(shù)主要有血清平板凝集試驗(yàn)（SPA）以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。其中ELISA是伴隨著單克隆抗體技術(shù)產(chǎn)生的一種血清檢測(cè)技術(shù)，特異性和敏感性較高，目前市場上也有很多商品化雞毒支原體血清抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，比如美國的IDEXX，荷蘭的BioChek以及我國的北京世紀(jì)元亨等公司。Ben Abdelmoumen Mardassi B等建立了一種基于重組抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（recELISA），可用于同時(shí)和特異地檢測(cè)三種主要禽支原體的抗體，特異性較高，適合于大量樣本的篩查。Elyazeed HA等自制了一個(gè)雞毒支原體ELISA試劑盒，與商品化試劑盒進(jìn)行了對(duì)比，具有很好的相關(guān)性。王莉莉等利用雞毒支原體重組熱休克蛋白DnaK（rDnaK）作為包被抗原，HRP標(biāo)記的兔抗雞 IgG作為酶標(biāo)二抗，建立了一種穩(wěn)定檢測(cè)MG抗體的間接ELISA方法。對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)估顯示該方法不與NDV、IBV、ILTv等幾種常見的禽呼吸道疾病的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，特意性較高，重復(fù)性好，敏感性與進(jìn)口商品化試劑盒相當(dāng)，的總體符合率為90.4%。周云雷等以原核表達(dá)的PvpA蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)MG抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。該方法所用的重組PvpA蛋白與NDV、IBV、MS、大腸桿菌＂O＂抗原、禽沙門氏菌＂O＂抗原陽性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性良好。用該檢測(cè)方法與進(jìn)口試劑盒對(duì)不同省份送檢的雞血清進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果兩者陽性和陰性符合率均達(dá)到90%以上。血平板凝集試驗(yàn)?zāi)壳笆褂玫牟皇翘貏e廣泛，AM Younis G等同時(shí)采用血清平板凝集試驗(yàn)（SPA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別檢測(cè)了71份血清的MG抗體，結(jié)果SPA法和ELISA法檢測(cè)陽性率分別為54.9%和40.8%。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，不同形式的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，包括普通PCR，熒光定量PCR，多重PCR等，在雞毒支原體檢測(cè)中越來越廣泛。其中套氏PCR和熒光定量PCR的敏感性和特異性較高。趙杰等以mgc2基因設(shè)計(jì)的引物建立的MG套氏PCR，能夠擴(kuò)增的基因片段的大小為300bp，與GenBank中收錄的相關(guān)序列的同源性為98%，而與大腸桿菌、沙門菌、雞滑液囊支原體均無交叉反應(yīng)，能夠檢測(cè)出DNA的最小質(zhì)量濃度為0.18fg/μL。周云雷等建立了基于雞毒支原體種特異性粘附蛋白編碼基因pvpA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法具有很好的特異性，敏感性檢測(cè)顯示該方法最低檢測(cè)限為72拷貝/20μL，敏感性比常規(guī)PCR100倍以上，重復(fù)性試驗(yàn)顯示批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%。

在臨床診斷中，除考慮能否實(shí)現(xiàn)批量和快速分析以及敏感性和特異性外，兼顧鑒別診斷的檢測(cè)技術(shù)越來越受歡迎。早在2000年，謝志勤等就建立了能夠同時(shí)檢測(cè)雞毒支原體、雞滑液囊支原體和禽衣阿華支原體的多重PCR檢測(cè)技術(shù)。Fraga AP等建立了MG和MS多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，該技術(shù)在MG檢測(cè)分析中的敏感性和特異性均為100%，在MS的分析中的敏感性和特異性分別為94.7%和100%，所以該方法非常適用于家禽業(yè)實(shí)驗(yàn)室的MG和MS批量和快速分析。由于活疫苗的廣泛使用以及雞毒支原體的多樣性，臨床上快速鑒別診斷疫苗株和野毒株的需求越來越多。Sulyok KM等根據(jù)MG的crmA、gapA、lpd、plpA、potC、glpK和hlp2基因的突變，建立的PCR方法能夠區(qū)分雞毒支原體疫苗株和臨床分離株。Ghorashi SA等也建立了類似的方法，能夠鑒別不同MG菌株。此外，研究人員還建立了其他特殊用途的關(guān)于MG的PCR檢測(cè)技術(shù)，比如Tan CG等建立了基于支原體16S核糖體核酸（rRNA）的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），該技術(shù)與PCR聯(lián)合應(yīng)用可以檢測(cè)和區(qū)分活的雞毒支原體和死的雞毒支原體。

研究顯示，MG的PCR檢測(cè)結(jié)果受咽拭子材料，病料保存方式以及抗生素治療的影響。Christopher Ball等發(fā)現(xiàn)，塑料棉簽拭子MG的分離率顯著高于木棉簽，4℃條件下的MG的PCR檢出率高于室溫條件。唐小飛等發(fā)現(xiàn)病料保存最有效的保存方法是將咽喉棉拭子置于甘油PBS中于-20℃冷藏或?qū)⒏裳屎砻奘米臃湃?20℃中保存。同時(shí)，抗生素治療會(huì)降低PCR的檢出率，從而影響MG臨床診斷，故在做實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)，要充分考慮抗生素的影響。

4 雞毒支原體各檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)性

雞毒支原體不同檢測(cè)技術(shù)具有一定的差異，所以不同地檢測(cè)目的，需要選擇適用的檢測(cè)技術(shù)。Kahya S等利用31個(gè)祖父母雞種群的646份血液和氣管拭子樣本比較了實(shí)時(shí)PCR（rPCR）和血清學(xué)以及培養(yǎng)方法的相關(guān)性。結(jié)果MG-RPA和HI的血清陽性率分別為48.4%（15/31）和32.3%（10/31），而培養(yǎng)陽性和rPCR陽性率分別為16.1%（5/31）和29.0%（9/31）。在群體分析中，培養(yǎng)法在MG血清陽性的雞群中檢測(cè)到5只（敏感性50%，特異性100%），而rPCR檢測(cè)到8/10（敏感性80%，特異性95%）。血清學(xué)與培養(yǎng)、血清學(xué)與rPCR的符合率分別為83.9%和90.3%。在個(gè)體樣本分析中，培養(yǎng)法在血清陽性雞中檢出26只（敏感性33%，特異性100%），而rPCR在78 MG血清陽性雞中檢出51只（敏感性65%，特異性96%）。血清學(xué)與培養(yǎng)、血清學(xué)與rPCR的符合率分別為91.9%和91.4%。