解淀粉芽孢桿菌抗病機(jī)制研究進(jìn)展

趙月盈

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

作物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中難以避免的問題。施用生物菌肥是一種新興手段，既能減少作物病害，提高作物產(chǎn)量并提升農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，又能避免因藥肥濫施導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)效益降低與自然環(huán)境被破壞等問題。由于生物菌肥加入了功能性微生物，不僅能補(bǔ)充土壤有機(jī)質(zhì)、增強(qiáng)土壤肥力，還具有促進(jìn)難溶性礦物利用、減少作物病蟲害發(fā)生、提高作物產(chǎn)量及改善品質(zhì)等多重功能[1]。黃恒掌等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在減少20%化肥施用量下，增施5%微生物菌肥使甘蔗產(chǎn)量提高9.6%～12.3%、糖分含量提高0.43%～0.64%，生產(chǎn)效益比單施化肥高。閻世江等[3]研究表明，化肥與菌肥配施還有利于減少田間操作次數(shù)，降低生產(chǎn)成本。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)生長速度快、營養(yǎng)需求簡單且抗逆性強(qiáng)、抗菌譜廣泛，其次生代謝產(chǎn)物對各類病原菌均有不同程度的抑制作用，是目前生防菌研究的主要菌種之一。本文綜述了解淀粉芽孢桿菌抑菌抗病的相關(guān)機(jī)制，以期為深入研究解淀粉芽孢桿菌與開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 解淀粉芽孢桿菌的生物學(xué)特性及主要代謝產(chǎn)物

1.1 生物學(xué)特性

解淀粉芽孢桿菌是一種好氧的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，最適生長溫度為28～30 ℃、最適宜生長的pH值為6.5～7.0；芽孢卵圓形，中生或極生；極生鞭毛，具備運(yùn)動能力；有還原硝酸鹽、水解淀粉的能力；可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖作為碳源[4]。

1.2 主要代謝產(chǎn)物

解淀粉芽孢桿菌通過產(chǎn)生與分泌次生代謝產(chǎn)物來促進(jìn)作物生長或抑制病原菌[5]。目前已分離的具有拮抗效果的產(chǎn)物包括多烯類、脂肽類、氨基酸類、核酸類、聚酮化合物以及抗菌蛋白等，其中抗菌蛋白包括抗菌肽、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素酶等[6-8]。解淀粉芽孢桿菌在生長的每一階段都能分泌不同的次生代謝產(chǎn)物，如在生長對數(shù)期產(chǎn)生表面活性素(surfactin)；對數(shù)期與隨后的穩(wěn)定期早期，伊枯草菌素(iturins)產(chǎn)出量最高；對數(shù)生長后期耗盡一種或多種必需營養(yǎng)素時產(chǎn)生豐原素(fengycin)[9]。

1.2.1 表面活性素 表面活性素是一種微生物來源的脂肽類表面活性劑，由7個α-氨基酸殘基和1個β-羥基脂肪酸組成，其中脂肪酸鏈和七肽鏈第7位的氨基酸殘基以酯鍵結(jié)合成環(huán)[10-11]。翟少偉等[12]研究表明，表面活性素?fù)碛惺杷院陀H水性的雙親性，可以插入細(xì)胞膜中，胞膜破裂后胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，引起細(xì)胞死亡，既能抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌等多種病原菌，又具有抗病毒、抗支原體、抗原蟲等生物防治活性，是一種潛在的抗生素替代品。表面活性素毒性低、易被降解、殘留量少，生物安全性有保障，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2.2 伊枯草菌素 伊枯草菌素是由肽和氨基酸組成的環(huán)狀重組脂肽類抗生素，比表面活性素具有更高的生物活性。1950年首次從枯草芽孢桿菌發(fā)酵代謝物中分離出伊枯草菌素。目前對伊枯草菌素A、C、D、E，抗霉枯草菌素(mycosubtilin)，桿菌霉素(bacillomycin) D、F、L和芽孢菌霉素(bacillopeptin)研究較多[13]。伊枯草菌素家族成員由7種氨基酸和1種氨基脂肪酸鏈組成[14]，具有強(qiáng)抗真菌活性，能抑制病原菌生長。當(dāng)與病原菌生物相遇時，首先破壞病原菌細(xì)胞壁并插入到細(xì)胞膜內(nèi)，后自發(fā)聚集或與膜脂類聚集形成寡聚結(jié)構(gòu)，形成離子通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量離子的流失，從而使病原菌生物膜崩解破壞[15]。

1.2.3 豐原素 豐原素通過非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)途徑合成。豐原素合成酶由fen操縱子編碼，包含5個基因[16]。對絲狀真菌具有特異活性，可以緩解植物組織損傷后癥狀[17-19]。由于真菌細(xì)胞膜組成結(jié)構(gòu)特殊，豐原素僅對真菌細(xì)胞膜起作用，通過擾亂細(xì)胞膜、損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抑菌效果。當(dāng)豐原素結(jié)合到真菌細(xì)胞膜后，會聚集在細(xì)胞膜上形成大的聚集體，破壞細(xì)胞膜上磷脂分子的正常秩序，引發(fā)胞質(zhì)外流，致使細(xì)胞死亡。低濃度的豐原素聚集會導(dǎo)致形成孔隙，隨后細(xì)胞膜透性發(fā)生改變；而高濃度的豐原素和表面活性素類似，可作為表面活性劑溶解細(xì)胞膜[19]。豐原素可以通過群體感應(yīng)抑制金黃色葡萄球菌的定殖[20]。同其他脂肽類抗生素相類似，豐原素具有廣譜的抗菌活性、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等特征，是醫(yī)療、農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中具有開發(fā)潛力的新型抗生素。

2 解淀粉芽孢桿菌抗病作用機(jī)理

2.1 解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞

解淀粉芽孢桿菌通過分泌次生代謝產(chǎn)物破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)制主要包括兩方面。一是使菌絲和孢子萎縮或膨大畸形至破裂，最終抑制病原菌生長蔓延、孢子萌發(fā)，失去對作物的侵染能力；二是直接作用于真菌細(xì)胞生物膜系統(tǒng)，破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，改變其通透性或使其產(chǎn)生孔洞，造成物理損傷，最終導(dǎo)致病原菌內(nèi)容物泄露或細(xì)胞破裂死亡[21]。此外，一些肽類物質(zhì)能減少真菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(如線粒體和核酸)的含量，抑制其功能[22-24]。

解淀粉芽孢桿菌在生長過程中可以向胞外分泌各種抑菌活性物質(zhì)，均具有較好的抑菌作用。如分泌的幾丁質(zhì)酶與β-1，3葡聚糖酶可以破壞真菌菌絲細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，二者聯(lián)合使用可增強(qiáng)降解真菌細(xì)胞壁的功能[25]。王偉等[26]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌DH8030在4倍最低半抑菌濃度下產(chǎn)生的解淀粉芽孢桿菌素amylocyclicinW5可以作用于蠟樣芽孢桿菌菌株LMGT2805的細(xì)胞壁，破壞結(jié)構(gòu)后形成孔洞，內(nèi)容物外泄，處于生長或生殖階段的細(xì)菌無法正常代謝，生長完全受到抑制，最終導(dǎo)致菌株死亡。程敏等[21]通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株CGMCC 11640代謝物主要通過破壞菌絲和孢子的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜，使細(xì)胞原生質(zhì)化，從而導(dǎo)致菌絲和孢子萎縮，最終殺死病原菌細(xì)胞。

2.2 解淀粉芽孢桿菌對植物系統(tǒng)性抗性的誘導(dǎo)

解淀粉芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)寄主做出防御反應(yīng)，提高與抗病性相關(guān)酶的酶活性[27]。解淀粉芽孢桿菌能夠改變植物IAA的內(nèi)源庫，進(jìn)而影響其生長、發(fā)育、脅迫應(yīng)答等過程[28]。與未接種解淀粉芽孢桿菌的植株相比，接種的植株可以檢測到更高的植物生長促進(jìn)激素(GA3和IAA)含量和防御相關(guān)酶(過氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶)酶活性。邱思鑫等[29]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌的抗菌蛋白可以顯著誘導(dǎo)辣椒抗性基因表達(dá)，提高活性氧代謝相關(guān)酶的酶活性，維持MDA含量穩(wěn)定，還能提高與抗病性相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性，從而使辣椒果實(shí)抗病性得到提升，有效減輕發(fā)病程度。Rahman et al[30]研究表明，解淀粉芽孢桿菌菌株FZB42-AK分泌的表面活性素能夠誘導(dǎo)黑麥草細(xì)胞出現(xiàn)多級系統(tǒng)抗病，通過積累胼胝質(zhì)和酚類物質(zhì)、提高細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶活性以及增加誘導(dǎo)典型防衛(wèi)反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)量，促進(jìn)黑麥草自身修復(fù)。谷醫(yī)林等[31]研究表明，解淀粉芽孢桿菌LJ1能夠影響黃瓜植株細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶等一些與活性氧防御活動相關(guān)酶的活性，從而誘導(dǎo)黃瓜對白粉病的抗性。

2.3 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌生長的抑制

解淀粉芽孢桿菌生長過程中能產(chǎn)生抑制病原菌生長發(fā)育的揮發(fā)性物質(zhì)。解淀粉芽孢桿菌菌株NJN-6產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)。Yuan et al[32]研究表明，檢測出具有拮抗作用的36種揮發(fā)性物質(zhì)中，有11種氣體可以完全抑制尖孢鐮刀菌的生長，有防治香蕉枯萎病的潛力。郝象瑢等[33]利用GC-MS發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌菌株LJ02產(chǎn)生的34種揮發(fā)性物質(zhì)對多種病原菌均有抑制效果，其中對黑腐皮殼菌等3種病原菌抑制效果達(dá)50%以上，氣體中的4-乙基苯酚和2-丙基環(huán)己酮是主要的抑菌成分。

3 解淀粉芽孢桿菌對病害的拮抗

解淀粉芽孢桿菌能夠分解環(huán)境中難溶性微量元素，提高植物根際營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的促生物質(zhì)能夠被作物利用，促進(jìn)作物生長并提高抗逆性；還能通過誘導(dǎo)作物防御反應(yīng)，減少病原物對作物的損害[28]。蔣凱麗等[34]研究表明，解淀粉芽孢桿菌KL-1菌株可以同時抑制鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌、擬康寧木霉、鹽生枝孢霉菌和膠孢炭疽菌等多種番茄采后病原菌，抑制率均在60%以上，其中對黑曲霉的抑制率為81%。鄧懿禎等[35]分離的CGB15菌株，能夠影響甘蔗鞭黑粉菌、香蕉枯萎病菌菌絲生長與孢子萌發(fā)，幾乎抑制稻瘟病病斑形成，可以應(yīng)用于稻瘟病或甘蔗鞭黑穗病的防治。劉昆昂等[36]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌BA-KA4菌株無菌發(fā)酵液能夠抑制灰霉病菌生長，在不同條件下抑菌物質(zhì)活性穩(wěn)定。劉劍金等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草苗期施用解淀粉芽孢桿菌YN48菌劑可以緩解黑脛病發(fā)病初期的癥狀，單獨(dú)噴淋YN48菌劑或分別與化學(xué)殺菌劑氟嗎·乙鋁、精甲霜·錳鋅等結(jié)合使用，對煙草黑脛病防效達(dá)60%以上。陳照等[38]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌HAB-9菌株對多數(shù)病原菌株的抑制率都超過50%，其中對檳榔炭疽菌效果最好。楊帆等[39]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌BQD1、TY菌株通過硫酸銨鹽析沉淀得到的脂肽類粗提液對玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌和水稻紋枯病菌均有不同程度的抑制作用，對玉米大斑病菌的抑制作用最強(qiáng)，能明顯抑制菌絲的生長。王德培等[40]發(fā)現(xiàn)，BI2發(fā)酵上清液能抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲生長，經(jīng)120 ℃下處理20 min后仍然保持抗菌活性。張木清等[41]從甘蔗葉片分離的解淀粉芽孢桿菌ZHR0具有產(chǎn)生脂肽類抗菌物質(zhì)的能力，其生防菌劑對甘蔗鞭黑穗病的防治效果達(dá)到53.98%。

4 解淀粉芽孢桿菌對土壤的改良效應(yīng)

芽孢桿菌具有分泌鐵載體和氨的能力，并且分泌的次生代謝產(chǎn)物能促進(jìn)環(huán)境中難溶金屬離子的溶解，還原高價鉻，降低鉻污染土壤的毒性，減輕作物受害程度[28]。此外，芽孢桿菌有生物吸附和積累能力，通過共享金屬負(fù)載來降低重金屬對植物的毒害。楊亞紅等[42]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充等量氮素條件下，施用生物有機(jī)肥代替化學(xué)肥料能夠降低土壤70%的氨氣蒸發(fā)量，在提高蔬菜產(chǎn)量的同時蔬菜內(nèi)的硝酸鹽含量降低46.6%，顯著提高土壤中芽孢桿菌、硝化螺菌屬的相對豐度，增加細(xì)菌種群多樣性。解淀粉芽孢桿菌TF28菌株對設(shè)施連作黃瓜根際土壤中的堿性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性以及微生物含量和pH值都具有調(diào)節(jié)作用，有利于均衡土壤微生物群落分布、增加有益菌數(shù)量與加速受損土壤恢復(fù)[43]。張木清等[44]通過盆栽和大田試驗(yàn)表明，ZHR0生物菌肥能夠提升甘蔗生物量(41.80%～125.98%)、提高根際土壤肥力、增加細(xì)菌多樣性，使土壤更加健康。同時該生物菌肥能有效防治甘蔗黑穗病，盆栽試驗(yàn)的防效為74.9%，田間試驗(yàn)的防效為68.28%[45]。

5 展望

解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物具有生物安全性好、防治效果穩(wěn)定、適用病害范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于防治甘蔗、煙草、番茄等主要經(jīng)濟(jì)作物根部、葉部和采后病害等[37,46-47]。由于對人畜安全，解淀粉芽孢桿菌越來越多地應(yīng)用于食品保鮮、畜牧業(yè)飼料以及漁業(yè)上相關(guān)真菌病害的防治[48-49]。作為一種重要的生防菌，解淀粉芽孢桿菌將在作物的綠色防控和可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中扮演越來越重要的角色，建議從以下方面加深研究。(1)解淀粉芽孢桿菌在不同逆境下皆表現(xiàn)出優(yōu)良生防功能[50]，有必要基于現(xiàn)代多組學(xué)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的植保、栽培等技術(shù)，闡明其誘導(dǎo)作物抗病性、抑制病原菌的內(nèi)在機(jī)制，并且通過基因組學(xué)、細(xì)菌分子遺傳學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)來選育更高效的功能性微生物。(2)田間環(huán)境復(fù)雜且不完全符合微生物最適生長需求，實(shí)驗(yàn)室條件下效果顯著的解淀粉芽孢桿菌生物肥在田間難以保持穩(wěn)定防效[51-52]，應(yīng)進(jìn)一步研究生防菌與大田環(huán)境根際微生物的群落互作原理，通過宏基因組研究尋找關(guān)鍵影響因子。優(yōu)化菌肥組成成分及生產(chǎn)工藝，提高生防產(chǎn)品中芽孢數(shù)量，并系統(tǒng)研究產(chǎn)品用量、用時、施用方式等，建立符合生產(chǎn)實(shí)際的應(yīng)用技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及體系，進(jìn)一步優(yōu)化生防產(chǎn)品的田間表現(xiàn)。(3)一般情況下，聯(lián)合使用生物制劑與化學(xué)制劑會影響生防菌活性，降低生防菌效果。但對真菌專一性殺菌劑與解淀粉芽孢桿菌混用的研究則表現(xiàn)出二者具有良好的協(xié)同作用，并且能夠通過相容性測定、菌種選育后獲得有應(yīng)用潛力的耐藥菌株[53]。(4)具有不同功能的解淀粉芽孢桿菌聯(lián)合使用能提高生防效果[54],但菌株間需滿足不互相拮抗、擁有同等的定殖增殖能力等條件。為使菌肥表現(xiàn)更強(qiáng)的應(yīng)用效果，開展多菌種組合防治及藥肥協(xié)同應(yīng)用技術(shù)研究是必要的。