茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展與“茶-草-菌”技術(shù)應(yīng)用展望

黃小云，黃秀聲，韓海東

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/福建省丘陵地區(qū)循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

茶葉中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分如茶氨酸、茶多酚、咖啡堿、維生素等，具有提神醒腦、降壓降血糖、抗老防衰、殺菌防癌等保健功能，是世界“三大無酒精飲料之一”，也是21世紀(jì)最健康的飲料之一[1]。茶樹是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，茶葉種植面積和干毛茶產(chǎn)量均穩(wěn)居世界第一。

茶樹的原產(chǎn)地在中國(guó)云南。茶樹是多年生植物，喜溫怕寒、喜酸耐鋁怕堿、喜光怕曬、喜濕怕澇[1]，形成了獨(dú)特的茶園土壤生態(tài)系統(tǒng)。茶樹每年修剪的凋落物均留園中成為茶園土壤的腐殖質(zhì)，使茶園土壤積累大量的鋁離子酸化土壤，導(dǎo)致土壤中某些養(yǎng)分的缺乏；茶樹根系不斷地向土壤中釋放分泌物，對(duì)根系造成逆境脅迫、自毒作用，進(jìn)而影響茶樹生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。土壤微生物是在復(fù)雜的土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和具有決定性影響的組分之一，在生態(tài)系統(tǒng)中積極參與物質(zhì)和能量循環(huán)，而且直接影響土壤的生物化學(xué)活性及土壤養(yǎng)分的組成與轉(zhuǎn)化，是土壤肥力的重要指標(biāo)之一[3]。茶樹根際是一個(gè)由茶樹根系、土壤及微生物三者構(gòu)成的特殊生態(tài)系統(tǒng)[4]，其周圍聚集了大量的微生物和土壤動(dòng)物，是茶樹和土壤之間物質(zhì)能量交換最劇烈的區(qū)域，是各種養(yǎng)分和有害物質(zhì)從無機(jī)環(huán)境進(jìn)入茶樹生命系統(tǒng)參與食物鏈物質(zhì)循環(huán)的必經(jīng)通道[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明在獨(dú)特的茶園土壤生態(tài)系統(tǒng)中，不僅土壤微生物的活動(dòng)對(duì)茶園土壤的理化性狀、物質(zhì)循環(huán)、激素合成等因素起著重要作用，而且土壤微生物間的拮抗作用及根際中特定微生物菌株的耐脅迫和防治根腐病等能力，都會(huì)直接或間接影響茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育和病蟲害防治[6-7]。

近年來，土壤微生物構(gòu)成特征不僅作為評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量變化的重要指標(biāo)，而且根際的研究得到世界范圍的關(guān)注和重視，成為生態(tài)學(xué)和土壤學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)[8]。利用生物工程技術(shù)在分子水平上對(duì)植物土壤微生物多樣性的研究主要集中在作物和森林，對(duì)茶園獨(dú)特的土壤生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物及群落多樣性的研究報(bào)道較少[9]。

1 茶園土壤微生物主要種類

茶園土壤中主要的微生物群落有三大類，其中以細(xì)菌最多，放線菌次之，真菌最少[8]；微生物總量隨土層厚度、土壤物理性狀、茶樹栽培時(shí)間而變動(dòng)，總的分布趨勢(shì)是根表多于根際、根際多于根外[10-11。

1.1 細(xì)菌

細(xì)菌個(gè)體小、數(shù)量大，占微生物總量的70%～90%，是土壤中最活躍的生物因素，分為自養(yǎng)型和腐生型，自養(yǎng)型細(xì)菌主要轉(zhuǎn)化礦質(zhì)養(yǎng)分的存在狀態(tài)，腐生型細(xì)菌則參與土壤有機(jī)質(zhì)的合成與分解，主要類群有假單孢菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)和微球菌屬(Micrococcus)、氣桿菌屬(Aerobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和固氮菌屬(Azotobacter)等[12]。

1.2 放線菌

放線菌主要分布在土壤耕作層，約占土壤微生物的6%～15%，雖然數(shù)量比細(xì)菌少，但其單個(gè)絲狀營(yíng)養(yǎng)體比單個(gè)細(xì)菌大幾十倍到幾百倍，因此在土壤中生物量接近細(xì)菌[12]。主要類群有鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocarelia)和小單孢菌屬(Micromonspora)等[13-14]。

1.3 真菌

真菌大多數(shù)好氣且耐酸，分布在土壤表層的有機(jī)質(zhì)殘片或土壤團(tuán)粒表面，約占土壤微生物的1%左右，由于其菌絲體是放線菌菌絲體的幾倍至幾十倍，因此，其生物量在土壤中并不少。真菌具有耐酸性和廣泛的酶系統(tǒng)，對(duì)土壤的熟化起重要作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的分解者[12,15]。其物種豐富、數(shù)量龐大，產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)抗菌活性強(qiáng)，成為天然活性物質(zhì)的重要來源之一，為發(fā)現(xiàn)新型抗生素藥物和生物農(nóng)藥提供廣闊領(lǐng)域。主要類群有青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)、擬青霉屬(Paecilomyce)和鐮刀菌屬(Fusarium)、酵母菌(Yeast)等，酵母菌(Yeast)有假絲酵母(Candida)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、球擬酵母(Torulopsis)[11]。

2 土壤微生物研究方法

2.1 平板培養(yǎng)法

平板培養(yǎng)法的主要原理是將微生物從土壤分離，根據(jù)微生物的形態(tài)特征和生理生化特性來分析。但是這種方法僅能從固體培養(yǎng)基上分離，表現(xiàn)1%～10%的優(yōu)勢(shì)微生物，無法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)微生物的多樣性，不能得到全面的微生物群落信息[16-17]。

2.2 生物化學(xué)方法

2.2.1 磷脂脂肪酸(PLFA)圖譜分析法 磷脂脂肪酸(PLFA)圖譜分析法的主要原理是磷脂脂肪酸的含量和組成因微生物不同而不同，且隨細(xì)胞死亡而即刻分解。這種方法雖然對(duì)微生物多樣性分析較可靠，但提純難度大，穩(wěn)定性易受外界條件影響[16]。

2.2.2 生物標(biāo)記法(Biology) 生物標(biāo)記法(Biology)的主要原理是通過微生物對(duì)95種碳源的利用率大小和代謝速度快慢來表達(dá)其結(jié)構(gòu)和代謝功能，但是測(cè)定結(jié)果易受外界干擾物、種子濃度和微孔板類型的影響，不能表達(dá)全部信息[16,18]。

2.3 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法

2.3.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD) RAPD的主要原理是隨機(jī)選取八到十個(gè)寡核苷酸作為引物，檢測(cè)DNA的多樣性，群落結(jié)構(gòu)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得的條帶數(shù)反映；其局限性為要花大量的人力和物力來篩選出能夠PCR擴(kuò)增最多條帶的引物序列[16,18]。

2.3.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP) RELP的主要原理是利用篩選得到的內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，再利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將酶切片段分離，根據(jù)酶片段的大小、種類、數(shù)量的差異被廣泛應(yīng)用于微生物群落的多樣性分析。這種方法分析結(jié)果準(zhǔn)確，但工作量大、任務(wù)繁重且沒有重復(fù)性[16,19]。

2.3.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP) AFLP的主要原理是由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)相結(jié)合的新型DNA檢測(cè)技術(shù)，可鑒別微生物間的親緣關(guān)系和分析菌株間的形態(tài)差異，比RAPD和RELP更好揭示微生物系統(tǒng)的多樣性；其局限性為AFLP技術(shù)雖然既高效又可靠，但對(duì)DNA的純度要求高，花費(fèi)較大[20]。

2.3.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE) DGGE技術(shù)是在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠基礎(chǔ)上加入變性劑(尿素和甲酰胺)梯度，區(qū)分長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA；該方法具有可靠、可重復(fù)、快速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要方法之一，不足之處是要求微生物的豐度要超過1%，DNA片段長(zhǎng)度要在1 kb以內(nèi)，且要有DGGE儀器設(shè)備[21-23]。

2.3.5 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) SSCP的主要原理是利用單鏈DNA的特異空間結(jié)構(gòu)(一個(gè)堿基的差異)，通過非變性PAGE凝膠上電泳，來顯示目標(biāo)DNA的多態(tài)性；該方法分辨率高、操作簡(jiǎn)單，被廣泛用于微生物多樣性的研究，但由于單鏈DNA的空間構(gòu)象不止一種，因此電泳條件及其條帶會(huì)造成實(shí)驗(yàn)誤差[24-26]。

2.3.6 熒光原位雜交(FISH) FISH的主要原理是用熒光標(biāo)記已知序列的單鏈核酸做為熒光探針與待測(cè)樣品進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交，再用熒光顯微鏡等儀器檢測(cè)雜交熒光的位置，從而將特定基因定位染色體的方法。這種方法快捷、分辨率高，成為微生物研究的重要方法之一。缺點(diǎn)是熒光信號(hào)的干擾，雜交信號(hào)會(huì)因細(xì)胞壁的影響而輕度下降，而且并不是DNA的每一片段都能與熒光探針雜交[27-28]。

2.3.7 末端限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP) T-RFLP的主要原理是對(duì)末端熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切的一種分析微生物群落的指紋技術(shù)，是一種高效和可重復(fù)的技術(shù)，可定性定量檢測(cè)一個(gè)微生物群體的特定基因；缺點(diǎn)是PCR易產(chǎn)生差異或誤差，片段長(zhǎng)度要求在50～500 bp之間檢測(cè)數(shù)據(jù)才準(zhǔn)確，圖譜的數(shù)據(jù)庫(kù)有待進(jìn)一步完善，提高核查準(zhǔn)確度[29]。

3 影響茶園土壤微生物群落的主要農(nóng)業(yè)措施

茶樹、土壤和土壤微生物構(gòu)成茶園獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。茶園的農(nóng)業(yè)措施如培肥、套種、覆蓋等方式都直接影響茶園土壤微生物的豐度和微生物群落的多樣性。

3.1 培肥措施對(duì)土壤微生物群落的影響

孫海新等[13]研究認(rèn)為土壤肥沃的茶園根際細(xì)菌較多，肥力中等和貧瘠的茶園土壤則真菌較多，放線菌是在貧瘠的茶園土壤中較多；徐華勤[30]研究認(rèn)為在紅壤茶園土壤中長(zhǎng)期施肥能不同程度增加茶園土壤微生物整體活性和豐富度，而有機(jī)肥與無機(jī)肥配施調(diào)節(jié)了土壤C/N，能提供更適應(yīng)微生物生活的環(huán)境。林斯等[31]研究表明茶園不同培肥措施對(duì)根系微生物種的豐富度和多樣性都有明顯的影響，以“無機(jī)肥+有機(jī)肥+豆科綠肥”綜合培肥模式對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)多樣性和穩(wěn)定性最佳，且茶葉產(chǎn)量最高。孫啟祥等[32]加入含有微生物制劑的土壤改良劑可使土壤中微生物數(shù)量及活性均較對(duì)照有不同程度的提高。邢世和[33]研究提出生物有機(jī)肥是一種有效的土壤改良劑，富含的有機(jī)質(zhì)和植物成長(zhǎng)必需的氮、磷、鉀、鎂、鈣、鋅等營(yíng)養(yǎng)成分及大量有益微生物，能有效地抑制土壤中病原微生物的生長(zhǎng)，改善土壤中的微生態(tài)區(qū)系，從而促進(jìn)茶樹生長(zhǎng)。管恩江等[34]研究結(jié)果也表明，生物有機(jī)肥能夠提高茶園土壤微生物數(shù)量，改善茶園土壤微生物群體結(jié)構(gòu)，并使茶葉增產(chǎn)，品質(zhì)提高。

3.2 套種綠肥對(duì)土壤微生物群落的影響

綠肥是指可以利用其生長(zhǎng)過程中所產(chǎn)生的全部或部分鮮體，直接或間接翻壓到土壤中作肥料，或者是通過它們與主作物的間套輪作，起到促進(jìn)主作物生長(zhǎng)、改善土壤性狀等作用的作物[35]。在茶園間作白三葉草方面：齊龍波等[36]研究認(rèn)為有利于提高土壤微生物生物量碳(MB-C)和土壤微生物生物量磷(MB-P)及土壤微生物量，且在三葉草生長(zhǎng)旺季土壤微生物量提高得更多；而沈程文等[37]研究得出在幼齡茶園間作4年白三葉草，0～20 cm紅壤剖面中土壤有機(jī)碳、微生物量碳、全氮、堿解氮、土壤微生物量氮、全磷、有效磷、微生物量磷隨土層深度的增加而遞減；宋莉等[38]在成齡茶園(茶齡15年)套種白三葉草和黑麥草，研究結(jié)果表明處理與對(duì)照相比較土壤微生物數(shù)量明顯增加：細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量、放線菌數(shù)量分別是1.75倍～2.58倍、1.22倍～1.88倍和1.15倍～1.46倍。封海勝等[39]和郭永霞等[40]的研究結(jié)果表明，細(xì)菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)化，是土壤肥力衰竭的標(biāo)志之一。茶園套種圓葉決明不僅能提高茶園土壤細(xì)菌、放線菌和固氮菌數(shù)量及微生物總數(shù)，而且可以顯著降低各土層真菌的數(shù)量，起到減緩或阻止茶園土壤肥力衰竭的作用。林黎[41]在研究不同草種組合在茶園套種，結(jié)果表明組合套種平托花生與百喜草比單獨(dú)套種平托花生有效降低土壤溫度、保持旱季土壤容重和自然水量、提高土壤綜合肥力、增加土壤微生物群落數(shù)量，有效增加土壤細(xì)菌159.64倍、真菌5.63倍、放線菌1.76倍、固氮菌37.1倍，并提高茶葉品質(zhì)。

3.3 套種食用菌對(duì)土壤微生物群落的影響

茶園套種食用菌模式是利用茶園園面空間和土壤環(huán)境因地制宜的仿生態(tài)栽培適生食用菌，適生食用菌因茶樹樹齡不同而不同，分為幼齡茶園套種和成齡茶園套種兩種模式。間作食用菌使茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，無論是土壤微生物群落數(shù)量，還是多樣性，間作后土壤微生物普遍高于單作[42]。楊云麗等[43]在成齡茶園(云南大葉種茶園，樹齡8年)套種平菇(糙皮側(cè)耳)，研究表明：在茶樹與食用菌的復(fù)合栽培模式下，土壤微生物中細(xì)菌數(shù)量和放線菌數(shù)量的變化情況為：對(duì)照組>兩年>一年；隨著降雨量的變化情況為：細(xì)菌數(shù)量持續(xù)增多，放線菌數(shù)量是旱季>雨季>雨季初期；真菌數(shù)量是雨季初期>旱季>雨季；李艷春等[2]在10年生茶園中套種靈芝，研究結(jié)果表明茶園間作靈芝處理的土壤細(xì)菌群落豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)與純茶園相比無顯著性差異；間作靈芝處理顯著提高了土壤有益微生物菌相對(duì)豐度：間作靈芝茶園土壤的變形菌門相對(duì)豐度顯著提高21.18%，而酸桿菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度顯著降低15.09%和53.52%，其他細(xì)菌門類變化不顯著。李振武等[44]以1年生幼齡茶園生態(tài)系統(tǒng)為研究對(duì)象，通過連續(xù)4年的冬季茶株行間套種大球蓋菇能明顯提升茶園土壤有機(jī)質(zhì)含量，減緩?fù)寥浪峄M(jìn)程，增加全氮和速效氮含量，減小土壤容重，改善土壤結(jié)構(gòu)。

3.4 土壤覆蓋物對(duì)微生物群落的影響

土壤微生物多為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型，茶園修剪物回園和農(nóng)作物秸稈、綠肥等覆蓋物都為土壤微生物提供了有機(jī)能源，可以促進(jìn)茶園土壤微生物的生長(zhǎng)，對(duì)土壤微生物生命活動(dòng)有刺激效應(yīng)。同時(shí)在有機(jī)物分解過程中，各種有機(jī)和無機(jī)養(yǎng)分的消長(zhǎng)，也必然會(huì)引起土壤微生物區(qū)系組成的變化，尤其是隨著修剪物的腐爛分解，修剪物中的抑菌、抗菌物質(zhì)的不斷釋放出來，反過來抑制微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致微生物的數(shù)量和種類下降，但由于真菌的抗逆能力較強(qiáng)，影響到土壤中整個(gè)生物學(xué)過程的活性和強(qiáng)度，兩者綜合作用的結(jié)果促進(jìn)了土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，使土壤肥力得到補(bǔ)充和更新[45-46]。徐華勤等[30]研究認(rèn)為稻草覆蓋不同程度地提高了微生物整體活性和豐富度。

總之，土壤微生物活性既受土壤環(huán)境因子的影響，又通過自身對(duì)土壤養(yǎng)分的分解轉(zhuǎn)化作用影響土壤因子，從而影響著土壤養(yǎng)分的有效性、作物對(duì)土壤養(yǎng)分的利用能力，以及土壤質(zhì)量的自我維持能力。土壤微生物數(shù)量與有機(jī)質(zhì)、易氧化有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)，即土壤含有機(jī)質(zhì)、易氧化有機(jī)質(zhì)豐富，土壤微生物數(shù)量就多[47]。

4 利用“茶-草-菌”技術(shù)構(gòu)建生態(tài)茶園的應(yīng)用展望

茶園獨(dú)特的土壤生態(tài)系統(tǒng)導(dǎo)致茶園土壤養(yǎng)分缺乏。茶樹根系分泌物累積影響土壤微環(huán)境，造成土壤微生物的選擇性適應(yīng)，改變茶園土壤微生物組成[48]，使得某些特定微生物類群得到富集，最終改變土壤中微生物種群的平衡[2]。利用微生物的生態(tài)功能[49]，構(gòu)建“茶-草-菌”耦合生態(tài)茶園，提高土壤有機(jī)質(zhì)和改善微生物群落。其應(yīng)用展望有以下三點(diǎn)：

4.1 消除茶園連作障礙

茶園連作障礙問題在生產(chǎn)上主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是在茶樹盛產(chǎn)期茶葉產(chǎn)量逐年下降；二是在老茶園更新時(shí)新茶苗難成活、成活的茶苗根系不發(fā)達(dá)，影響茶苗健康成長(zhǎng)[50]?？朔B作障礙的主要措施有施用化學(xué)改良劑(生石灰)、有機(jī)肥、生物菌肥、生物質(zhì)材料和茶園多樣性栽培等[2]。通過構(gòu)建生態(tài)茶園，利用茶園套種護(hù)坡草(黃花萱草或百喜草)、綠肥(圓葉決明)、食用菌(靈芝)等增加茶園多樣性栽培的模式，利用茶園修剪覆蓋物和化學(xué)改良劑(生石灰)及茶園施肥(有機(jī)肥)等諸因子的耦合，以達(dá)到增加和豐富土壤微生物群落，改善茶園的土壤生態(tài)系統(tǒng)，達(dá)到消除連作障礙的目的。

4.2 增加土壤有益微生物群落

生態(tài)茶園的立體栽培有套種綠肥和食用菌等方式，而選擇合適的套種組合比單一套種更能有降低茶園土壤真菌的數(shù)量和提高固氮菌的群落數(shù)量，對(duì)土壤肥力衰竭起到減緩或阻止的作用，顯著提高了土壤有益微生物菌相對(duì)豐度[2,41]。因此，選擇茶園適生草種及食用菌組合套種的構(gòu)建“茶-草-菌”立體栽培模式，可以提高和改良茶園土壤有益微生物群落，從而減緩茶園連作造成的土壤肥力衰竭。

4.3 專用生物菌肥研發(fā)應(yīng)用

茶園土壤微生物不僅物種豐富，而且在細(xì)菌和真菌中都存在優(yōu)勢(shì)門屬，其功能也不盡相同[51-53]，如茶樹根際有豐富的固氮菌，應(yīng)用現(xiàn)代科技分離出有益微生物菌株研制成茶樹專用生物菌肥，不僅能增強(qiáng)茶樹對(duì)磷的吸收能力，而且可以促進(jìn)對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分如氮、鉀、鎂、銅、鐵、鋅等的吸收，從而增強(qiáng)茶樹的抗逆性和抗病蟲害能力，達(dá)到促進(jìn)茶樹的健康生長(zhǎng)和提高茶葉品質(zhì)目的[11,54-55]。

5 小結(jié)

茶園獨(dú)特的土壤生態(tài)系統(tǒng)決定了土壤微生物的種群及數(shù)量，通過人為的干擾即應(yīng)用如“茶-草-菌”的立體栽培技術(shù)模式構(gòu)建生態(tài)茶園，改變微生物的種群及數(shù)量，改良茶園土壤的理化性狀，促進(jìn)茶樹體內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)、激素合成，進(jìn)而促進(jìn)茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育和病蟲害防治。因此，通過對(duì)生態(tài)茶園土壤微生物的研究，不僅為生態(tài)茶園提供科學(xué)理論支撐，而且有助于茶園生態(tài)建設(shè)在山地茶園推廣應(yīng)用，為茶園克服連作障礙、增強(qiáng)茶樹抗病蟲害、提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。