PCR技術(shù)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

付莎莉 王利剛 張 婧 周正海 陳 欣 費(fèi)云滟 吳 丹

重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 重慶 401121

動(dòng)物源性食品因其含有豐富的人體必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，成為人們飲食構(gòu)架中必不可少的組成部分。隨著社會(huì)發(fā)展和消費(fèi)升級(jí)，人們對(duì)各種動(dòng)物源性食品的數(shù)量、質(zhì)量的需求都在增長(zhǎng)[1]。實(shí)際生產(chǎn)中，不同品種肉類因養(yǎng)殖成本、物流成本等因素影響，其產(chǎn)品銷售價(jià)格差異較大，一些不法商販在肉類及其制品中摻雜摻假牟取暴利。肉類摻假不僅影響市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)秩序，破壞食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還存在消費(fèi)者因食用未標(biāo)示的肉類原料產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的健康問(wèn)題[2]，以及宗教信仰問(wèn)題等[3]。肉制品特別是深加工肉制品僅靠感官和肉類形態(tài)學(xué)為主的鑒別方法，無(wú)法準(zhǔn)確鑒別其種類和品質(zhì)，而基于核酸水平的PCR技術(shù)可高效、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的動(dòng)物源性成分，現(xiàn)將PCR及其衍生技術(shù)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下，以期為食品監(jiān)管技術(shù)手段的選擇提供參考。

1 PCR技術(shù)原理及其衍生方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)可以在生物體外將DNA片段準(zhǔn)確有效進(jìn)行復(fù)制，實(shí)現(xiàn)DNA片段數(shù)量大幅度增加。實(shí)際工作中，只要能夠從樣品中提取出微量的DNA，就可以直接利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行分析比對(duì)，便可以獲得樣品所屬物種的信息。隨著使用需求的不同，沿用不同的使用條件，PCR技術(shù)已經(jīng)衍生出了多種應(yīng)用方法，下面就近年來(lái)在食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)中常用的實(shí)時(shí)熒光PCR法和數(shù)字PCR法進(jìn)行闡述。

1.1 實(shí)時(shí)熒光PCR法

實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-Time PCR)技術(shù)在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，可通過(guò)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光染料或特異性標(biāo)記探針造成的熒光信號(hào)的改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)[4]。實(shí)時(shí)熒光PCR法在動(dòng)物源性成分的檢測(cè)中的關(guān)鍵在于針對(duì)檢測(cè)目標(biāo)，選擇適宜的熒光標(biāo)記基團(tuán)來(lái)設(shè)計(jì)特異性引物。而熒光探針Real-Time PCR技術(shù)，還需要設(shè)計(jì)熒光探針序列。表1列出了豬、牛、羊、雞、鴨、鵝的引物和探針序列，在肉類鑒別檢測(cè)中熒光報(bào)告基因往往需要具有較強(qiáng)的特異性，特異性熒光報(bào)告基因主要包括線粒體基因DNA、細(xì)胞基因組中重復(fù)序列和單拷貝序列。Real-Time PCR在動(dòng)物源性檢測(cè)中的應(yīng)用如下。

1.1.1 單重?zé)晒馓结樂(lè)?/p>

Zhang[9](2007)等以牛線粒體Cyt b基因?yàn)榉治鰧?duì)象設(shè)計(jì)了特異性引物和Taqman熒光探針來(lái)檢測(cè)熱處理后的純?nèi)庵信Ｔ葱猿煞旨昂?，該方法牛DNA最低檢出限為35 pg，且未顯示與綿羊、山羊或豬的DNA有交叉反應(yīng)，特異性高。Ali[10](2012)等以豬線粒體Cyt b基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)了Taqman熒光探針來(lái)檢測(cè)混合肉中是否含有豬源性，該方法檢出限低至0.01%，可應(yīng)用于檢測(cè)肉制品中是否有豬肉添加。Miguel[11](2005)等以豬線粒體12S rRNA基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)了豬源性特異性引物，擴(kuò)增豬肉DNA的411 bp片段，同時(shí)擴(kuò)增幾種來(lái)自哺乳動(dòng)物物種DNA的425～428 bp片段用作內(nèi)源性干擾，結(jié)果顯示未與其他動(dòng)物DNA產(chǎn)生交叉反應(yīng)，該檢測(cè)方法對(duì)豬肉定量檢測(cè)的靈敏度范圍為0.5%～5%。

Yusop[12](2012)等以豬的Cyt b基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)引物和分子信標(biāo)探針，建立了Real-Time PCR體系，以多種生肉混合物為樣品，檢測(cè)結(jié)果顯示出高特異性，其中豬肉的定量檢出限為0.001ng，而其他肉類品種均為陰性。Mohanad[13](2018)等以豬的染色體DNA和Cyt b基因?yàn)檠芯繉?duì)象設(shè)計(jì)了引物和分子信標(biāo)探針，用于明膠制品中豬源性成分的定量檢測(cè)，結(jié)果顯示基于Cyt b基因的檢測(cè)方法可檢測(cè)出體系中10pg的豬DNA，而基于染色體DNA基因的檢測(cè)方法可檢測(cè)出體系中1pg的豬DNA。

1.1.2 多重?zé)晒馓结樂(lè)?/p>

多重?zé)晒馓结樂(lè)丛赗eal-Time PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用多對(duì)引物測(cè)定，在動(dòng)物源性檢測(cè)中也有較廣泛的應(yīng)用。Iwobi[14](2015)等選擇β-肌動(dòng)蛋白基因和肌肉生長(zhǎng)抑制素基因?yàn)榉治鰧?duì)象，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，采用三重Real-Time PCR用于定性和定量檢測(cè)混合肉中牛源性和豬源性成分，結(jié)果表明該引物和探針未與其他動(dòng)物DNA產(chǎn)生交叉反應(yīng)，定量范圍為0.5%～99.5%，檢出限為20bp。章晶晶[15](2017)等選擇貉子線粒體D-loop基因和狐貍的線粒體基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)引物和探針，建立了多重?zé)晒釶CR體系對(duì)肉制品中狐貍、貉子源性成分定量分析，其中最低檢測(cè)限為狐貍0.5pg/μL、貉子5pg/μL。劉艷艷[16](2016)等選擇線粒體基因組16S rRNA基因?yàn)榉治鰧?duì)象設(shè)計(jì)引物和分子信標(biāo)探針建立的多重Real-Time PCR體系能實(shí)現(xiàn)對(duì)阿膠原料中驢、馬、驢騾和馬騾源性成分的同時(shí)區(qū)分，結(jié)果顯示建立的多重Real-Time PCR體系具有較好的物種特異性和檢測(cè)靈敏性，最低檢測(cè)限為0.01ng/μL。Mar[17](2012)等選擇t-Glu和Cyt b基因?yàn)榉治鰧?duì)象設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)熱處理前后混合肉樣中豬、牛和雞肉的含量，最低檢出限為原樣1%、熱處理樣0.32pg/μL。Cheng[18](2014)等選擇β-肌動(dòng)蛋白基因和生長(zhǎng)因子基因設(shè)計(jì)引物和Taqman-MGB探針建立多重?zé)晒釶CR體系檢測(cè)雞、鴨和豬源性成分在混合DNA中的含量，并以鵝、馬、兔、牛、驢、鯽魚(yú)、綿羊和山羊8種源性成分作為陰性對(duì)照，結(jié)構(gòu)顯示該方法具有很強(qiáng)特異性，未產(chǎn)生交叉反應(yīng)，檢測(cè)限可達(dá)到0.15ng。Druml[19](2015)等選擇偽表皮生長(zhǎng)因子基因設(shè)計(jì)Taq man-MGB探針和體系，以鑒別混合肉類DNA中三種鹿的含量，該方法顯示出較高特異性，未與肉類產(chǎn)品中可能含有的其他20種動(dòng)物和43種植物成分產(chǎn)生交叉反應(yīng)，檢測(cè)為0.1%。許如蘇[20](2017)等選擇線粒體基因組為研究對(duì)象設(shè)計(jì)引物及探針，建立了多重Taqman-LNA熒光PCR體系，實(shí)現(xiàn)肉制品中豬雞鴨源性成分的同時(shí)檢測(cè)，且與牛、羊、驢、兔、鵝等常見(jiàn)動(dòng)物源性成分無(wú)交叉反應(yīng)，特異性高，且其檢測(cè)限均可低至肉含量的0.001%，靈敏度強(qiáng)。

1.1.3 熒光染料法

熒光染料是能與ds DNA雙螺旋小溝區(qū)域非特異性結(jié)合的染料，在激發(fā)光的作用下結(jié)合狀態(tài)染料的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離狀態(tài)的熒光強(qiáng)度，其熒光信號(hào)強(qiáng)度隨擴(kuò)增過(guò)程中PCR產(chǎn)物的增加而同步增強(qiáng)，以Sybr Green和EvaGreen較為常見(jiàn)。Soares[21](2013)等以Sybr Green作為熒光染料，選擇豬的Cyt b和18S rRNA基因?yàn)榉治鰧?duì)象設(shè)計(jì)引物，該方法表現(xiàn)出良好特異性，在豬肉添加量0.1%～25%的混合肉樣中檢測(cè)豬肉的含量，結(jié)果表明豬DNA在原樣中最低檢出量為5pg、熱處理樣中最低檢出量為20ng。郭云霞[22](2012)等選擇真核生物18S rRNA為對(duì)象設(shè)計(jì)引物，以SYBR Green I為熒光染料用Real-Time PCR方法檢測(cè)了多種動(dòng)植物食品樣品中的鯊魚(yú)源性成分，該方法的檢出限為0.001ng/μL；Kang[23](2018)等則采用Subr Green染料的Real-Time PCR技術(shù)，在100%～0.01%范圍內(nèi)對(duì)豬肉和牛肉混合樣品中豬肉的含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)驗(yàn)證比較得出該方法可以用于檢測(cè)牛肉加工制品中是否有豬肉摻假。Lubil[24](2018)等選擇豬的Cyt b基因?yàn)閷?duì)象設(shè)計(jì)引物，建立了采用EvaGreen為熒光染料的Real-Time PCR方法來(lái)檢測(cè)肉制品混合物中豬DNA的含量，并且通過(guò)9種其他動(dòng)物和6種蔬菜為陰性對(duì)照，證明了該方法對(duì)豬DNA具有特異性。該法在檢測(cè)生豬肉和雞肉混合物時(shí)檢出限可低至0.001%。同樣以Cytb基因?yàn)閷?duì)象進(jìn)行新引物設(shè)計(jì)，Meira[25](2017)等建立了定性定量檢測(cè)體系檢測(cè)加工食品中馬肉摻假，該方法表現(xiàn)出高靈敏度和特異性，在牛和馬的混合樣品的檢測(cè)中，最低可檢測(cè)到的馬DNA為0.1pg。Joana[26](2017)等采用EvaGreen熒光染料建立定量檢測(cè)體系，通過(guò)熔解曲線于標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對(duì)對(duì)肉制品中豬肉含量進(jìn)行定量檢測(cè)，并利用未知肉混合物進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，得出該方法特異性較強(qiáng)、重復(fù)性高，豬DNA的最低檢出限為0.01pg。Sakalar[27](2015)等選擇豬和馬的12S rRNA和16S rRNA基因?yàn)閷?duì)象設(shè)計(jì)引物，EvaGreen為熒光染料建立了多重Real-Time PCR技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在0.1%～10%范圍內(nèi)對(duì)混合肉中馬和豬肉的含量進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，檢出限低至0.00001ng/μL。Sakalar[28](2016)等還設(shè)計(jì)了基于EvaGreen的雙重Real-Time PCR檢測(cè)體系來(lái)檢測(cè)肉制品中豬肉和牛肉摻假，該體系異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)0.001%。

1.2 數(shù)字PCR法

單一的Real-Time PCR技術(shù)雖能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，但需要建立已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能比對(duì)出目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，而檢測(cè)結(jié)果受擴(kuò)增效率的影響較大，所以該方法不能對(duì)目標(biāo)序列精確定量，而數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了核酸的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR的快速發(fā)展得益于微流控技術(shù)的逐漸成熟，先后發(fā)展出基于微反應(yīng)腔室、集成化微流控芯片和微滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)[29]，微流控芯片式數(shù)字PCR(cdPCR)技術(shù)通過(guò)將納升級(jí)的液體樣品封閉在由多個(gè)獨(dú)立的微池或微通道組成的集成芯片后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)不同微池或微通道的熒光信號(hào)情況判讀。微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是一種利用水油乳化液滴系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字PCR的方法[30～33]。兩者中微滴數(shù)字PCR具有一定優(yōu)勢(shì)，以下重點(diǎn)介紹微滴數(shù)字PCR的應(yīng)用。

Cai[34](2014)等通過(guò)應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，對(duì)豬肉和雞肉產(chǎn)品進(jìn)行定量分析，研究結(jié)果表明，肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)量之間均呈線性關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，建立了根據(jù)DNA拷貝數(shù)計(jì)算肉質(zhì)量的模型。并通過(guò)人工比例污染試驗(yàn)，混合已知比例的豬肉和雞肉，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和適用性，獲得了較好的驗(yàn)證結(jié)果。該團(tuán)隊(duì)于2017年通過(guò)應(yīng)用雙微滴數(shù)字PCR技術(shù)，對(duì)肉制品中牛肉源性和豬肉源性成分進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步定量。該方法實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)數(shù)字PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)牛肉和豬肉混合樣品中的源性成分進(jìn)行識(shí)別和定量，同時(shí)，通過(guò)已知比例成分的混合肉類樣品驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和適用性[35]。該團(tuán)隊(duì)于2018年通過(guò)應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，對(duì)肉制品中山羊肉和綿羊肉含量的檢測(cè)和定量進(jìn)行了研究，建立了一套基于DNA拷貝數(shù)的肉質(zhì)量計(jì)算模型。并使用不同動(dòng)物品種(24種)的樣本進(jìn)行了專一性的驗(yàn)證，其中包括山羊和綿羊每個(gè)種屬各5個(gè)品種。方法采用含有山羊和綿羊特異基因片段的質(zhì)粒作為正對(duì)照用于校正，方法結(jié)果顯示山羊和綿羊的檢出限和定量限分別為1 copies/μL和5 copies/μL。采用將山羊和綿羊肉按比例混合的模擬樣品進(jìn)行了準(zhǔn)確性和適用性的驗(yàn)證。結(jié)果顯示該方法具有很高的精確度，具有較好的應(yīng)用前景[36]。

Floren[37](2015)等以真核生物核F2基因作為目標(biāo)靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了一種兩步式微滴數(shù)字PCR方法，用于檢測(cè)肉制品加工過(guò)程中牛、馬、豬源性成分的含量并與熒光定量PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果表明微滴數(shù)字PCR法更具有優(yōu)勢(shì)，定量限低至0.01%，檢出限為0.001%。并采用了14種物種驗(yàn)證其特異性，未顯示出交叉反應(yīng)。Ren[38](2017)等通過(guò)采用微滴數(shù)字PCR方法對(duì)綿羊、山羊?yàn)樵系娜庵破分械碾u肉含量進(jìn)行定量檢測(cè)，該方法在檢驗(yàn)計(jì)算過(guò)程中引入倍數(shù)因子，將擴(kuò)增拷貝數(shù)的比例換算為肉源性含量的比例，該法對(duì)經(jīng)過(guò)熱處理和超高壓處理后的樣品同樣具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，且原料動(dòng)物不同部位采樣對(duì)該方法的精確度無(wú)影響。

Noh[39](2019)等建立了一種用于定量分析海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚(yú)含量的微滴式數(shù)字PCR方法，確立了魚(yú)肉質(zhì)量、DNA含量和DNA拷貝數(shù)量之間的線性關(guān)系，在此基礎(chǔ)上建立了以DNA拷貝數(shù)為計(jì)算基礎(chǔ)的肉質(zhì)量計(jì)算模型。通過(guò)對(duì)已知比例混合樣品進(jìn)行定量分析驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性和適用范圍。結(jié)果顯示，該方法可用于海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚(yú)的檢測(cè)及定量分析，可應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量及真實(shí)性認(rèn)證。史艷宇[40](2018)等以鴨線粒體基因?yàn)槟繕?biāo)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)微滴數(shù)字PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)和分析，建立了產(chǎn)品中鴨源性成分的檢測(cè)和定量分析方法，與熒光定量PCR比較后得出該方法靈敏度高于熒光定量PCR。

2 研究展望

目前對(duì)肉類源性的鑒別檢測(cè)主要集中在對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和對(duì)核酸的檢測(cè)兩方面。但是蛋白質(zhì)檢測(cè)的開(kāi)展需要高要求的儀器和樣品前處理方法，前處理復(fù)雜、試劑成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、特異性較差，且往往不適用于經(jīng)熱加工處理的肉制品，僅適用于對(duì)新鮮肉類的檢測(cè)。而基于核酸的檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已知種類特異DNA序列的比對(duì)判定樣品種類，更適用于檢測(cè)未知樣品。

Taqman熒光探針在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中存在一定的局限性，無(wú)法應(yīng)對(duì)靶基因特異序列較短的情況。對(duì)體系中存在的與靶基因同源的序列，也很容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，造成最終定量不準(zhǔn)確。分子信標(biāo)靈敏度強(qiáng)，可檢測(cè)出單個(gè)核苷酸的突變，可以應(yīng)對(duì)靶基因特異序列較短狀況，但其設(shè)計(jì)要求復(fù)雜，且成本較高[24]。熒光染料法可用于dsDNA序列的擴(kuò)增監(jiān)測(cè)，相對(duì)熒光探針?lè)ㄔO(shè)計(jì)要求簡(jiǎn)單，成本低?；赗eal-Time PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作便捷的特點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于快速定量檢測(cè)，在食品檢測(cè)領(lǐng)域更是具有較高的應(yīng)用價(jià)值。利用Real-Time PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，大量研究建立了畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)制品、奶制品的檢測(cè)方法，可應(yīng)用于肉類摻假、奶制品摻假的鑒別。采用Real-Time PCR技術(shù)時(shí)仍需注意：熒光染料法雖然檢測(cè)簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜，但染料與DNA雙鏈的結(jié)合為非特異性結(jié)合，往往會(huì)出現(xiàn)多個(gè)終產(chǎn)物，則需要通過(guò)擴(kuò)增曲線的判斷來(lái)確定多個(gè)終產(chǎn)物的特異性[38]。熒光探針?lè)ū葻晒馊玖戏ň哂懈鼜?qiáng)的特異性，但至關(guān)重要的目標(biāo)基因選擇以及引物探針設(shè)計(jì)還較為困難，若體系中存在與靶基因同源的序列，則易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，使得定量不準(zhǔn)確。數(shù)字PCR法是近幾年才新出現(xiàn)的技術(shù)，可以檢測(cè)出混合復(fù)雜樣品中的微量核酸，靈敏度極高，且可以實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量。因其具有的明顯優(yōu)勢(shì)已在成分鑒定檢測(cè)領(lǐng)域快速發(fā)展，在動(dòng)物源性食品成分檢測(cè)中也具有重要作用。

數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用，使很多動(dòng)物源性食品摻假制假的研究，從以往片面的定性檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)定量檢測(cè)的跨越，檢測(cè)數(shù)據(jù)能反應(yīng)混合樣品中不同動(dòng)物源性材料的含量，進(jìn)一步掌握動(dòng)物源性制品摻假程度?，F(xiàn)階段微生物檢測(cè)領(lǐng)域和植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)制定了相關(guān)方法和標(biāo)準(zhǔn)，但在動(dòng)物源性成分檢測(cè)方面檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)仍空缺，所需試劑和ddPCR儀器價(jià)格居高不下，造成了ddPCR在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室普及率低。未來(lái)隨著國(guó)家監(jiān)管投入增加和設(shè)備價(jià)格的降低，微滴數(shù)字PCR將更加普及，成為動(dòng)物源性食品監(jiān)管的檢測(cè)技術(shù)支撐。