甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對瘡痂鏈霉菌的生防潛力

許子璇，吳達(dá)仁，2，王建宇，周 波，李 健，2，蘇國成

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門361021；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

0 引言

瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabies)是馬鈴薯瘡痂病的病原菌，作為革蘭氏陽性、絲狀、腐生放線菌，其菌絲尖端釋放的孢子可在根際土壤、種子中傳播，并通過莖塊傷口、皮孔等侵染甜菜、蘿卜、馬鈴薯等多種植物[1]。瘡痂鏈霉菌能夠產(chǎn)生黑色素、灰色氣生菌絲和孢子螺旋鏈[2]，并隨著染病馬鈴薯的生長發(fā)育，鏈霉菌會影響其組織擴(kuò)張，導(dǎo)致其呈現(xiàn)軟木狀表皮壞死性病變，最終使馬鈴薯表面形成凸起的硬癍[3]。染病的馬鈴薯在清洗過程中不易被處理干凈，這不僅會導(dǎo)致加工成本增加，還嚴(yán)重降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2015年，我國農(nóng)業(yè)部啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，為滿足日益增長的糧食需求，培育優(yōu)質(zhì)無病害的馬鈴薯是關(guān)鍵。馬鈴薯瘡痂病在我國各大馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍存在[4-7]，但對其防治手段有限，目前主要依賴化學(xué)防治手段[8]，這種手段存在農(nóng)藥殘留、藥效低、耐藥性強(qiáng)、土壤污染等問題[9]。因此，近年來研究熱點(diǎn)主要集中在生物防治，利用土壤微生物的拮抗特性開發(fā)生防菌劑[10-12]，可以實(shí)現(xiàn)土壤生態(tài)體系的改良和病害的防治，是綠色、環(huán)保、高效的防治手段[13]。目前，有效針對馬鈴薯瘡痂鏈霉菌的生防菌研究較少，仍未開發(fā)出可以代替化學(xué)農(nóng)藥且低毒、安全、高效的生防菌劑。

芽孢桿菌在植物根際土壤中廣泛存在，它可以產(chǎn)生具有高度抗性的內(nèi)生孢子[14]，是開發(fā)生防菌劑的重要來源。目前，已有多種芽孢桿菌被報(bào)道，如解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌等，它們可通過分泌抗菌代謝產(chǎn)物來抑制食源性病害[15-18]，但對于土壤來源的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)的研究相對較少。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是2010年由Madhaiyan等[19]在水稻根際土壤中分離報(bào)道的新菌種，其對葡萄霜霉病[20]、葡萄灰霉病[21]、黃瓜炭疽病[22]、羅漢果斑枯病[23]、梨黑斑病[24]、西瓜枯萎病[25]等多種植物病害有抑制作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌也有抑菌作用[26]，具有開發(fā)生防菌劑的潛力。

本實(shí)驗(yàn)探究了2種土壤來源的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在不同條件下對馬鈴薯瘡痂鏈霉菌的拮抗效果，測試其發(fā)酵上清液的最佳發(fā)酵時間以及經(jīng)不同溫度、紫外照射、pH值、蛋白酶處理后的穩(wěn)定性，并與市售農(nóng)藥進(jìn)行對比，明確其體外急性細(xì)胞毒性作用和抑菌效果，以評估其作為生防菌劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

病原菌：瘡痂鏈霉菌(AMCC400023)[27]。拮抗菌：SJ80、SJ81甲基營養(yǎng)芽孢桿菌，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室。LO2正常肝臟細(xì)胞，大白鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞PC12，集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，瓊脂粉20，pH=7.0～7.5。放線菌液體培養(yǎng)基，海博生物有限公司。

1.1.2 主要試劑

噻唑蘭(MTT)，南京奧多福尼生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖液(PBS)、雙抗(PS)，美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，澳洲GEMINI公司；咯菌腈(fludioxonil)，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；辛菌胺醋酸鹽，山西美源化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株形態(tài)觀察

將拮抗菌培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基中，用革蘭氏染色法處理拮抗菌后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.2 拮抗菌發(fā)酵上清液制備

挑取單菌落接種于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，得到種子液。按1%接種量將種子液接種至裝有20 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾后，4 ℃ 保存待用。

1.2.3 病原菌孢子懸浮液制備

挑取一環(huán)活化好的瘡痂鏈霉菌，緊密地劃在高氏一號培養(yǎng)基上，28 ℃ 恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d。吸取無菌水于平板上，用刀片輕輕刮下表面孢子，少量多次沖洗培養(yǎng)基表面孢子，收集至50 mL離心管中，4 ℃保存待用。

1.2.4 拮抗物質(zhì)發(fā)酵時間優(yōu)化

將2株拮抗菌連續(xù)6 d在同一時間接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)，每隔24 h取一次樣品，采用牛津杯法測定抑菌直徑，每組重復(fù)3次。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

牛津杯法抑菌試驗(yàn)：在放線菌固體培養(yǎng)基表面涂布200 μL病原菌孢子懸浮液[28]，至表面沒有明顯水分后，將無菌牛津杯垂直插入培養(yǎng)基表面，每孔加入200 μL樣品，28 ℃ 恒溫靜置培養(yǎng)48 h后，測量抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式為：抑菌率/%=(1-d對照-d樣品/d對照)×100，其中，d為抑菌圈直徑。

參照Huang等[15]的方法對發(fā)酵上清液穩(wěn)定性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1)溫度穩(wěn)定性。將拮抗菌發(fā)酵上清液分別在50，60，70，80，90，100，121 ℃條件下處理30 min，冷卻后采用牛津杯法測定抑菌直徑，以未處理的發(fā)酵上清液為對照，每組重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

2)紫外照射穩(wěn)定性。參照文獻(xiàn)[29]，將拮抗菌發(fā)酵上清液分別置于15 W紫外燈下照射6，12，24 h，通過牛津杯法測定抑菌直徑，以未處理的發(fā)酵上清液為對照，每組重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

3)pH值穩(wěn)定性。將拮抗菌發(fā)酵上清液用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)整pH值為1～13，靜置24 h后調(diào)回原始pH值，通過牛津杯法測定抑菌直徑，以未處理的發(fā)酵上清液為對照，每組重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

4)蛋白酶穩(wěn)定性。選擇0.1，0.5，1.0 mg/L的胰蛋白酶和堿性蛋白酶處理發(fā)酵上清液，以1∶50的比例加入發(fā)酵上清液，37 ℃水浴2 h，90 ℃滅活蛋白酶，冷卻至室溫后用牛津杯法測定抑菌直徑，以酶液為空白組，以未處理的發(fā)酵上清液為對照組，每組重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

1.2.6 拮抗菌粗提物細(xì)胞毒性試驗(yàn)

利用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗(青霉素、鏈霉素)和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在二氧化碳培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)LO2細(xì)胞與PC12細(xì)胞，恒溫 37 ℃，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%。

將2種拮抗菌發(fā)酵上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取劑合并后真空濃縮，得到乙酸乙酯浸提物，用適量甲醇復(fù)溶并稀釋至不同濃度，用0.22 μm濾膜過濾后4 ℃ 保存待用。SJ80樣品作用的質(zhì)量濃度分別為50，100，150，200，250，300，350 mg/L；SJ81樣品作用的質(zhì)量濃度分別為25，50，5，100，125，150，175，200 mg/L。以辛菌胺醋酸鹽[30]和咯菌腈[8]2種農(nóng)藥作為對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照推薦使用濃度選擇辛菌胺醋酸鹽36 mg/L(稀釋500倍)、咯菌腈16.7 mg/L(稀釋1 500倍)。此外，設(shè)一個高濃度組辛菌胺醋酸鹽180 mg/L(稀釋100倍)、咯菌腈167 mg/L(稀釋150倍)作為參考。

參照肖寶平等[31]的MTT法測定體外急性細(xì)胞毒性，取對數(shù)生長期的LO2細(xì)胞制成均勻單細(xì)胞懸液，以1×104個/孔鋪至96孔板，100 μL/孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入不同濃度粗提物或藥品，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔換100 μL新培養(yǎng)基，并加入15 μL 0.5 g/L的噻唑蘭，37 ℃ 孵育4 h后吸棄上清液，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，在490 nm處檢測吸光度值。每個樣品做6個平行，設(shè)定DMSO為空白組，甲醇為溶劑對照組。PC12細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法同上，計(jì)算細(xì)胞活力公式如下：細(xì)胞活力/%=(A樣品-A空白)/(A溶劑-A空白)×100，其中，A為吸光度值。

1.2.7 農(nóng)藥對比試驗(yàn)

選擇1.2.6中質(zhì)量濃度為50，100，150，200 mg/L的SJ80粗提物，質(zhì)量濃度為50，75，100，125 mg/L的SJ81粗提物，以及4個濃度的農(nóng)藥，用牛津杯法比較抑菌活性，每組重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以SPSS statistics 17.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)檢驗(yàn)其相關(guān)性和顯著性，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)

將2株拮抗菌接種在LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃ 恒溫靜置培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)和革蘭氏染色后的顯微形態(tài)(1 000倍)，結(jié)果如圖1所示。可見，2株菌形態(tài)有明顯差異，SJ80單菌落呈圓形，邊緣粗糙，中間有褶皺狀圓形凸起，干燥無光澤，不透明 (見圖1a )；SJ81單菌落大，形狀不規(guī)則，邊緣較光滑，中間有不規(guī)則褶皺凸起，表面無光澤，干燥 (見圖1c )；2株菌在顯微鏡下觀察均呈藍(lán)紫色短桿狀(見圖1b、圖1d)，均為革蘭氏陽性菌。

2.2 發(fā)酵時間優(yōu)化

如圖2所示，在1～3 d內(nèi)，2株拮抗菌隨著發(fā)酵時間的增加，抑菌圈直徑顯著增加(P<0.01)；在4～6 d內(nèi)，發(fā)酵液的抑菌效果逐漸趨于平緩，不再提高。因此，2株拮抗菌活性物質(zhì)在發(fā)酵3 d達(dá)到飽和，最佳發(fā)酵時間為3 d。

2.3 溫度穩(wěn)定性

如圖3所示，2種發(fā)酵上清液經(jīng)50～121 ℃ 處理后，抑菌率均高于90%，與未經(jīng)處理的對照組間沒有顯著性差異(P>0.05)，說明2種發(fā)酵上清液的活性物質(zhì)在高溫下不會失活，對溫度不敏感，具有較強(qiáng)的耐熱性。

2.4 紫外照射穩(wěn)定性

如圖4所示，SJ80發(fā)酵上清液經(jīng)紫外照射6，12，24 h后的抑菌率分別為96.23%，98.5%，99.3%，SJ81發(fā)酵上清液的抑菌率分別為94.22%，98.64%，99.25 %，2種發(fā)酵上清液抑菌活力均在90% 以上。與未經(jīng)處理的對照組相比，抑菌圈直徑均無顯著性差異(P>0.05)，表明2株拮抗菌的活性物質(zhì)對紫外照射不敏感，在紫外線下較穩(wěn)定。

2.5 pH值穩(wěn)定性

如圖5所示，SJ81發(fā)酵上清液在pH=1～13時均有抑菌活性，在pH=7，9時抑菌率達(dá)到88%，91%，與未經(jīng)處理的對照組無顯著性差異，其余pH值條件下與對照組有顯著性差異(P<0.05)；SJ80發(fā)酵上清液在pH=1～11時均有抑菌活性，在pH=13時抑菌率為0，其中pH=9時抑菌率高達(dá)100%，與對照組無顯著性差異，在其余pH值條件下抑菌率均小于80%，與對照組有顯著性差異(P<0.05)。綜上可得，2株拮抗菌發(fā)酵上清液在弱堿條件下抑菌活性較高，強(qiáng)堿或偏酸條件下抑菌活性降低。

2.6 蛋白酶穩(wěn)定性

由于2種發(fā)酵上清液自身呈堿性，因此選擇胰蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6?？梢?，空白組的抑菌率均為0，排除了酶的自身作用，2株拮抗菌發(fā)酵上清液經(jīng)不同濃度酶液處理后，抑菌活性均高于95%，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，胰蛋白酶與堿性蛋白酶對2種拮抗菌發(fā)酵上清液中活性物質(zhì)無酶解作用。

2.7 體外急性細(xì)胞毒性試驗(yàn)

由于拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，抑菌活性物質(zhì)與毒素物質(zhì)共同存在，若作為生防菌劑作用于農(nóng)田，噴灑過程會在農(nóng)作物上有些許殘留，有直接入口的風(fēng)險(xiǎn)，因此，需要通過MTT實(shí)驗(yàn)確定其體外急性細(xì)胞毒性作用。如圖7所示，隨著樣品濃度增加， LO2、PC12細(xì)胞活力逐漸降低。對于LO2細(xì)胞，樣品質(zhì)量濃度在200 mg/L時，細(xì)胞活力達(dá)到80%以上，在300 mg/L時，細(xì)胞活力低于50% (見圖7a)；樣品質(zhì)量濃度為75 mg/L時，細(xì)胞活力在80%以上，在150 mg/L時，細(xì)胞活力低于50%(見圖7b)。對于PC12細(xì)胞，樣品質(zhì)量濃度為200 mg/L時，細(xì)胞活力仍在80%以上，在250 mg/L時，細(xì)胞活力明顯下降，只有39.84%(見圖7c)；樣品濃度在125 mg/L時，細(xì)胞活力在80%以上，在150 mg/L和175 mg/L時，細(xì)胞活力也處于較高水平，分別達(dá)到59.74%，58.89%，在200 mg/L時，細(xì)胞活力才顯著降低至7.98%(見圖7d)。對于SJ80，LO2、PC12 2種細(xì)胞中其IC50分別為239，266 mg/L；對于SJ81，LO2、PC12 2種細(xì)胞中其IC50分別為137，161.3 mg/L，因此可知SJ81毒性比SJ80強(qiáng)，可能是由于SJ81發(fā)酵產(chǎn)生的毒素物質(zhì)較多的緣故。4組農(nóng)藥對應(yīng)的細(xì)胞活力均低于50%，其中咯菌腈在16.7 mg/L時對LO2細(xì)胞活力為42.32%，對PC12細(xì)胞活力為28.52%，其余各濃度對2種細(xì)胞的細(xì)胞活力均在10%以下，細(xì)胞幾乎全部死亡，與對照組有極顯著性差異(P<0.01)，與SJ80、SJ81粗提物相比表現(xiàn)出較大殺傷力，體現(xiàn)了拮抗菌生物防治的安全性(見圖7e)。

2.8 農(nóng)藥對比實(shí)驗(yàn)

為了比較拮抗菌粗提物與農(nóng)藥的抑菌活性，選擇節(jié)2.7中細(xì)胞活力在80%以上的作用濃度與農(nóng)藥進(jìn)行對比，結(jié)果如圖8所示?？梢?，以抑菌效果最強(qiáng)的167 mg/L咯菌腈為抑菌率100%的對照組，其推薦使用濃度(16.7 mg/L)的抑菌率為25.46%；辛菌胺醋酸鹽在高濃度下的抑菌率為37.46%，在推薦使用濃度(36 mg/L)下的抑菌率為0。通過線性擬合，得到SJ80和SJ81粗提物的抑菌率方程分別為Y=0.215 7X+22.75和Y=0.176 3X+25.45。SJ80和SJ81粗提物在質(zhì)量濃度為16.7 mg/L時的抑菌率分別為26.35%，28.39%，均強(qiáng)于咯菌腈的抑菌效果，在質(zhì)量濃度為36 mg/L時的抑菌率分別為30.52%，31.8%，均強(qiáng)于辛菌胺醋酸鹽的抑菌效果。因此，在推薦使用濃度下，2株拮抗菌的抑菌效果均強(qiáng)于2種農(nóng)藥，突出了SJ80、SJ81拮抗菌的作用優(yōu)勢。

3 討論

本研究旨在對比2種農(nóng)藥與2株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對瘡痂鏈霉菌的抑菌效果。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌與農(nóng)藥相比，具有較好的抑菌效果，且相同濃度下有較低的細(xì)胞毒性。由于農(nóng)藥殘留，人們長期、低劑量地?cái)z入農(nóng)藥，在體內(nèi)積累的農(nóng)藥不僅會造成慢性損傷，而且有一定的神經(jīng)毒性與肝臟毒性。茍練等[32]發(fā)現(xiàn)，低劑量與高劑量農(nóng)藥均可導(dǎo)致PC12細(xì)胞DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；陳潔等[33]闡述了不同農(nóng)藥導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的不同途徑，具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。我國已經(jīng)意識到農(nóng)藥與化肥對生態(tài)系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞造成的糧食安全問題，在2015年制定了《到2020年化肥使用量零增長行動方案》和《到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》[34]，大力推進(jìn)農(nóng)藥減量控害。

生防菌劑一般要具有強(qiáng)穩(wěn)定性，耐高溫性、耐酸堿性、耐紫外照射都是重要指標(biāo)。若作為生防菌劑代替農(nóng)藥施用于田間，耐高溫特性是重要的指標(biāo)。2株拮抗菌發(fā)酵上清液在121 ℃高溫處理30 min仍對瘡痂鏈霉菌有90%以上的抑菌效果，說明其活性物質(zhì)高溫下不易失活，有很好的耐熱性；2株菌在24 h紫外連續(xù)照射后仍有較強(qiáng)抑菌活性，說明抑菌活性物質(zhì)強(qiáng)光下不易被分解；在pH值呈中性或弱堿性時，2株拮抗菌抑菌活性穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性條件下仍有活性，表明其耐酸性較強(qiáng)，說明其在農(nóng)田中可能對土地的酸堿性有很好的適應(yīng)性；抑菌活性物質(zhì)不易被蛋白酶酶解，是較穩(wěn)定的生防菌劑。許多研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，其中能夠有效抑制植物病害的代謝產(chǎn)物有環(huán)狀脂肽、聚酮化合物、桿菌素和核糖體合成的抗菌肽等幾類物質(zhì)；已經(jīng)鑒定得到的環(huán)狀脂肽類物質(zhì)主要有脂肽(Surfactin)[35]、伊枯草素(iturin)[36]、豐霉素(fengycin)、多粘菌素(polymyxin)[37]、鐮刀菌素(fusaricidin)等，聚酮化合物主要有巨乳素(macrolactin)、地非西丁(difficidin)等，其中脂肽的存在最廣泛[38-39]。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，一些芽孢桿菌存在脂肽類抗生素的合成基因，可分泌大量抗生素，有廣譜抑菌效果，且發(fā)酵上清液理化性質(zhì)較穩(wěn)定。因此，本文所用的2株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可能也是通過產(chǎn)生天然抗菌物質(zhì)來抑制馬鈴薯瘡痂病的病原菌，但具體還需進(jìn)一步深入研究。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌針對馬鈴薯瘡痂病的研究較少，2019年首次報(bào)道了一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對內(nèi)蒙古馬鈴薯瘡痂病有抑菌效果[40]，但未明確其有效成分和抑菌機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)SJ80與SJ81能有效抑制馬鈴薯瘡痂病，體外急性細(xì)胞毒性比市售農(nóng)藥小，而且具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)，有用于馬鈴薯瘡痂病生物防治的潛力。為進(jìn)一步探索其抑菌機(jī)理，后續(xù)將對發(fā)酵上清液粗提物分離純化、活性鑒定等進(jìn)行深入研究，為瘡痂病研究提供新的方向，也為更好地將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。