基于質(zhì)控圖聯(lián)合Westgard多規(guī)則理論的替考拉寧血藥濃度監(jiān)測的室內(nèi)質(zhì)控評估

陳 明，唐原君*，王倩茹，唐晶晶，石晨陽

0 引言

替考拉寧(Teicoplanin)又稱肽可霉素，由游動放線菌屬發(fā)酵產(chǎn)生。其作用機(jī)制與萬古霉素相似，與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖前體分子結(jié)合，抑制細(xì)胞壁的合成，從而抑制或殺滅細(xì)菌[1-2]。研究表明，替考拉寧的抑菌效應(yīng)與其達(dá)到最低抑菌濃度和抗菌后效應(yīng)有關(guān)，提示了替考拉寧血藥濃度監(jiān)測的重要意義[3-4]。替考拉寧藥品說明書2018版也指出，在完成負(fù)荷劑量治療方案后，在穩(wěn)態(tài)時監(jiān)測替考拉寧濃度，有助于確保達(dá)到最低血清谷濃度，表明替考拉寧血藥濃度監(jiān)測的必要性已經(jīng)得到共識[5]。替考拉寧為糖肽類抗生素，主要由5個結(jié)構(gòu)類似的化合物組成(TA2-1、TA2-2、TA2-3、T2-4、TA2-5)，其中TA2-2為主要組分，占各組分總含量的40%～60%。當(dāng)臨床上檢測濃度較低時，會出現(xiàn)TA2-1、TA2-3、T2-4和TA2-5的峰，有可能還會出現(xiàn)這4個峰和其他雜質(zhì)峰達(dá)不到有效分離[6]。有文獻(xiàn)報道采用TA2-2峰的峰面積定量與采用5種成分的峰面積加和定量，其結(jié)果并無臨床顯著差異[7]。

考慮以上因素，本實驗室建立了測定人血清中替考拉寧(TA2-2峰)濃度的高效液相色譜法(HPLC)，并應(yīng)用于臨床血藥濃度監(jiān)測。為保證替考拉寧血藥濃度監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，現(xiàn)對2019年1-6月室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，以確保替考拉寧的血藥濃度監(jiān)測質(zhì)量，為臨床醫(yī)師使用和調(diào)整替考拉寧治療方案提供實驗室依據(jù)，保證臨床安全、有效地使用替考拉寧。

1 材料

1.1 儀器 SHIMADZU LC-10AD高效液相色譜儀(SHIMADZU，美國)，包括LC-10AT色譜泵，SIL-10AD自動進(jìn)樣器，CTO-10AS柱溫箱，SPD-10A檢測器；HY-5渦旋混合器(SI公司，美國)；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)；AL104-01電子分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)；CPA2250電子分析天平(賽多利斯，德國)；SK7200H超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Hitech-Kflow水純化系統(tǒng)(18.2 MΩ)(上海和泰儀器有限公司)等。

1.2 試藥 替考拉寧對照品(純度：每毫克相當(dāng)于894單位，中國食品藥品檢定研究院，批號：130374-201002)；富馬酸喹硫平對照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：N1102AS，純度：>98%)；磷酸二氫鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，分析純)；甲醇(Merck，HPLC級)；乙腈(Merck，HPLC級)；二氯甲烷(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，分析純)；磷酸(分析純)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 工作溶液配制 精密稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品20.36 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，加水溶解并定容，配制成濃度為2.036 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。4 ℃避光保存。精密稱取喹硫平標(biāo)準(zhǔn)品8.18 mg，置于50 ml棕色容量瓶中，加水溶解并定容，配制成0.16 mg/ml內(nèi)標(biāo)儲備液，4 ℃避光保存。

2.2 血漿樣品及質(zhì)控品處理方法 人血漿樣品及隨行質(zhì)控樣品室溫下解凍后，分別取400 μl置于1.5 ml 塑料離心管中，加入50 μl內(nèi)標(biāo)工作液，混勻，加入600 μl乙腈沉淀，渦旋振蕩5 min，于13 000 r/min離心5 min。取上清液900 μl置于另一1.5 ml EP塑料離心管中，加入400 μl二氯甲烷，渦旋振蕩5 min，于13 000 r/min離心5 min。取上清液200 μl置于進(jìn)樣器中自動進(jìn)樣20 μl，進(jìn)行LC-UV分析。

2.3 色譜條件 分析柱：Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；內(nèi)標(biāo)：喹硫平；柱溫：35 ℃；流動相：0.01 mol/L NaH2PO4(pH 2.7)-乙腈(76∶24)；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：240 nm。典型色譜圖見圖1。由圖1可見，空白血漿在替考拉寧和喹硫平出峰處無明顯雜質(zhì)峰干擾，替考拉寧和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為8.41 min和12.62 min。

圖1 人血漿中替考拉寧高效液相色譜圖注：A.空白血漿，B.替考拉寧對照品，C.內(nèi)標(biāo)喹硫平對照品，D.患者滴注替考拉寧達(dá)穩(wěn)態(tài)后的血漿樣品。1.替考拉寧，2.喹硫平

2.4 室內(nèi)質(zhì)量控制

2.4.1 線性范圍評價及定量下限(LLOQ) 配制濃度為101.80、50.90、25.45、12.72、6.36、3.18 mg/L的替考拉寧血漿樣品，每一濃度各3份，按“2.2”項下操作，記錄替考拉寧和內(nèi)標(biāo)峰面積，以替考拉寧濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，替考拉寧TA2-2峰面積(A)與內(nèi)標(biāo)峰面積(AI)的比值(A/AI)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行兩者線性回歸運(yùn)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.03 062 x-0.013 14 (R2=0.999 8)，結(jié)果表明，人血漿中替考拉寧濃度在3.18～101.80 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。配制替考拉寧定量下限3.18 mg/L血漿樣品5份，按“2.2”項下操作，計算得替考拉寧定量下限信噪比大于10，RSD小于2%，RE小于10%。

2.4.2 準(zhǔn)確度和精密度 配制低、中、高3種濃度(3.77、11.31、33.93 mg/L)的替考拉寧質(zhì)控樣品，每個濃度的樣品平行制備5份，按“2.2”項下處理，記錄替考拉寧和內(nèi)標(biāo)峰面積。按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算濃度，對比求得日內(nèi)精密度。連續(xù)測定3 d，考察方法的日間精密度。測定濃度與理論濃度對比，求得準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1。

表1 HPLC法測定替考拉寧的方法回收率和精密度

2.4.3 提取回收率評價 配制低、中、高(L、M、H) 3個濃度的替考拉寧血漿質(zhì)控樣品各5份，同時配制低、中、高(L、M、H) 3個濃度的不含血漿質(zhì)控樣品各5份，按“2.2”項下處理，記錄替考拉寧和內(nèi)標(biāo)峰面積，將相應(yīng)濃度的替考拉寧血漿樣品峰面積與不含血漿質(zhì)控樣品峰面積進(jìn)行對比，計算提取回收率。見表1。同理，計算內(nèi)標(biāo)喹硫平提取回收率為94.82%。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 配制低、中、高 3 個濃度(3.77、11.31、33.93 mg/L)的替考拉寧質(zhì)控樣品各5份，置于不同條件下進(jìn)行穩(wěn)定性考察：凍融穩(wěn)定性，樣品反復(fù)凍融3次；室溫穩(wěn)定性，樣品室溫放置24 h；進(jìn)樣器放置24 h穩(wěn)定性，樣品按前處理方法處理后，在進(jìn)樣盤內(nèi)放置24 h。質(zhì)控樣品按上述條件處理后，以測得值與真實值比較，偏差均小于15%。結(jié)果表明，樣品在反復(fù)凍融3次、室溫放置24 h、進(jìn)樣器放置24 h條件下均穩(wěn)定。

2.5 回顧性質(zhì)量控制

圖2 替考拉寧低、中、高濃度質(zhì)控品 Levey-Jennings 質(zhì)控圖

圖3 替考拉寧低、中、高濃度質(zhì)控品 Z-分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖

3 討論

治療藥物濃度監(jiān)測對于臨床合理用藥、減少不良反應(yīng)的發(fā)生具有重要意義，而測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性是制定個體化給藥方案的重要前提[14]。室內(nèi)質(zhì)控是保證臨床實驗室發(fā)出高質(zhì)量報告的基本要求。根據(jù)我國頒發(fā)的《臨床實驗室質(zhì)量管理辦法》中要求，室內(nèi)質(zhì)量控制為檢驗人員按照一定的頻度連續(xù)測定穩(wěn)定樣品中的特定組分，并采用一系列方法進(jìn)行分析，按照統(tǒng)計學(xué)規(guī)律推斷和評價本批次測量結(jié)果的可靠程度，以此判斷檢驗報告是否可發(fā)出，及時發(fā)現(xiàn)并排除質(zhì)量環(huán)節(jié)中的不滿意因素[15]。目前，大多數(shù)藥學(xué)人員開展治療藥物濃度監(jiān)測工作尚未執(zhí)行統(tǒng)一質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外HPLC 監(jiān)測血藥濃度的室內(nèi)質(zhì)量控制研究尚不完善，且所用質(zhì)控品均為自行配制。關(guān)于替考拉寧血藥濃度監(jiān)測的室內(nèi)質(zhì)控研究尚未見報道，因此，本研究在已有實驗室條件下，對HPLC法測定替考拉寧血藥濃度的室內(nèi)質(zhì)量控制評價體系進(jìn)行了相關(guān)探索。

室內(nèi)質(zhì)量控制活動中經(jīng)常使用Levey-Jennings圖和Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖來監(jiān)測檢測結(jié)果的誤差是否在可接受的范圍。Levey-Jennings質(zhì)控圖主要用于同一濃度水平質(zhì)控品的精密度比較，但不適用于判斷準(zhǔn)確度；而Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖可以將不同濃度水平質(zhì)控品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后繪制在同一張質(zhì)控圖上，通過單值質(zhì)控圖連續(xù)評價實驗室的質(zhì)量控制能力[18-19]。觀察上述質(zhì)控圖，可以看出Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖的低、中、高濃度質(zhì)控品測定值在不同時間點(diǎn)的變化趨勢與Levey-Jennings質(zhì)控圖保持一致。將Levey-Jennings質(zhì)控圖與Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖聯(lián)合Westgard多規(guī)則理論，可以降低假失控和假報警率，從而呈現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控的準(zhǔn)確性。

本文采用Levey-Jennings圖和Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖，結(jié)果顯示，替考拉寧血藥濃度監(jiān)測的室內(nèi)質(zhì)控分析結(jié)果均在誤差允許范圍內(nèi)，保證了血藥濃度測定的準(zhǔn)確性和可靠性，具有較好的臨床指導(dǎo)意義。本實驗室在日常治療藥物濃度監(jiān)測工作中通過及時繪制質(zhì)控圖進(jìn)行監(jiān)測，可以及時發(fā)現(xiàn)質(zhì)控測定中出現(xiàn)的漂移、趨勢性變化、失控等問題，也可及時發(fā)現(xiàn)影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的潛在因素。有助于實驗人員判斷誤差類型并排除誤差原因，增加血藥濃度監(jiān)測結(jié)果的可靠性。