金剛藤總黃酮分離純化工藝研究

況成裕，殷成強(qiáng)，劉大勇，龍玉波，王 振，王 芳，王玉環(huán)

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司，山東 濟(jì)南 250104）

金剛藤為百合科植物菝葜（Smilax chinaL.），又名金剛刺、假萆解[1]，廣泛分布于長江以南丘陵地區(qū)，藥用其根莖。其性甘溫?zé)o毒，有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金剛藤有抗感染與鎮(zhèn)痛[2]、抗腫瘤作用[3]、活血和增強(qiáng)免疫作用[4]?，F(xiàn)代臨床研究表明，金剛藤在治療輸卵管梗阻性不孕[5]、繼發(fā)性不孕癥[6]、慢性盆腔炎[7]等方面有較好療效。

國內(nèi)外學(xué)者在金剛藤屬植物的生物活性及化學(xué)成分研究中取得一定成果[8-9]，研究表明，金剛藤中含有山萘酚、山萘酚-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、二氫山萘酚、槲皮素-3-O-葡糖苷、槲皮素、異鼠李素、落新婦苷、新異落新婦苷、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷、黃杞苷等多種黃酮類化合物。其中落新婦苷含量較高，且生物活性較強(qiáng)，具有心血管活性、免疫抑制、減輕腎功能損傷、保肝等作用[10-12]。

黃酮化合物生物活性眾多，經(jīng)提取純化，可充分發(fā)揮其在醫(yī)藥方面的作用。而金剛藤總黃酮的分離純化尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)篩選6種不同型號的大孔吸附樹脂純化金剛藤黃酮，并通過動態(tài)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化LS-303型大孔樹脂純化工藝，為尋找該植物有效成分，更好地開發(fā)利用其資源提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

8453型紫外-可見分光光度儀（Agilent），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAOSB0-2100），玻璃層析柱（直徑1.5，2，2.5 cm）。

1.2 試藥與試劑

金剛藤藥材，2015年8～9月采集于貴州開陽縣、修文縣和四川安岳縣，經(jīng)鑒定為百合科植物菝葜（Smilax chinaL.）的根莖，洗凈，切片，曬干；落新婦苷對照品（自制，含量97.82 %），甲醇、乙醇為分析純，水為純化水；大孔吸附樹脂LS-46D、LSA-40、LS-300B、LS303、D101、AB-8（陜西藍(lán)深特種樹脂公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定方法

2.1.1 對照品溶液制備 稱取干燥至恒重的落新婦苷對照品（含量97.82 %）5 mg，精密稱定（5.09 mg），置入50 ml量瓶，加乙醇20 ml，超聲使溶解，加乙醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.0996 mg/ml對照品溶液[13]。

2.1.2 供試品溶液制備 藥材供試品溶液：稱取金剛藤細(xì)粉（過40目篩）0.3 g，精密稱定，置入250 ml圓底燒瓶，加乙醇100 ml，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，加乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為藥材供試品溶液。

浸膏供試品溶液的制備：稱取金剛藤藥材500 g，加水5 kg，加熱回流提取2次，每次時(shí)間1.5 h，合并提取液，濾過，濃縮至500 ml，放冷，邊攪拌邊加入95 %乙醇1400 ml，繼續(xù)電動攪拌15 min，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇，減壓濃縮至約250 ml，放冷，得浸膏。稱取浸膏0.1 g，精密稱定，置入100 ml量瓶，加乙醇40 ml，超聲30 min，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，7000 r/min離心10 min，取上清液作為浸膏供試品溶液。

上樣藥液、吸附后濾液、洗脫液（見2.3、2.4、2.8項(xiàng)下制備所得）供試品溶液的制備：稱取上樣藥液0.2 g、吸附后濾液0.5 ml、洗脫液供試品溶液0.5 ml，精密稱定，分別置入100 ml量瓶，加乙醇40 ml，超聲30 min，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，7000 r/min離心10 min，分別取上清液作為供試品溶液。

總黃酮提取物供試品溶液：稱取總黃酮提取物細(xì)粉25 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加乙醇40 ml，超聲30 min，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，7000 r/min離心10 min，取上清液作為總黃酮提取物供試品溶液。

2.1.3 檢測波長選擇 精密量取對照品溶液、藥材供試品溶液和總黃酮提取物供試品溶液各1 mL，置入10 mL量瓶，加乙醇至刻度，搖勻，以乙醇為空白，在波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描，對照品溶液、藥材供試品溶液和總黃酮提取物供試品溶液均在292 nm處有最大吸收峰，因此選擇292 nm作為檢測波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對照品溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml，分別置入10 ml量瓶，292 nm處測定吸光度，以濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=31.69C+0.053，R2=0.9993。結(jié)果表明，落新婦苷在3.98～23.90 μg/ml濃度范圍之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系

2.1.5 測定 精密量取供試品溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加乙醇至刻度，搖勻，292 nm處測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2.2 上樣藥液制備

稱取金剛藤藥材500 g，加水5 kg，加熱回流提取2次，每次時(shí)間1.5 h，合并提取液，濾過，濃縮至500 ml，放冷，邊攪拌邊加入95 %乙醇1400 ml，繼續(xù)電動攪拌15 min，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇，減壓濃縮至約250 ml，放冷，邊攪拌邊加入純化水至相對密度為1.10（20 ℃），2～4 ℃靜置24 h，抽濾，即得上樣藥液（約500 ml）。

2.3 靜態(tài)吸附法篩選大孔吸附樹脂型號

取上樣藥液5份，每份100 ml，分別置入裝有經(jīng)預(yù)處理各種型號樹脂20 g的250 ml具塞三角瓶[14-15]，每30 min振搖1次，每次30 s，持續(xù)3 h，靜置過夜，濾過，取續(xù)濾液0.5 ml至10 ml量瓶，加乙醇至刻度，搖勻，于292 nm處測定吸光度，計(jì)算吸附率。樹脂抽濾至干，用70 %乙醇200 ml解吸，操作同上，濾過，得靜態(tài)洗脫液，測吸光度，計(jì)算解吸率，結(jié)果見表1。

由表1可見，吸附率、解吸率相對較高的為LS303，其優(yōu)勢明顯，故選擇LS303型樹脂進(jìn)一步優(yōu)化工藝。

表1 不同型號樹脂靜態(tài)吸附率及解析率結(jié)果

2.4 靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附的比較研究

取上樣藥液100 ml，按2.3項(xiàng)下方法操作，測定吸附率和解析率。

取上樣藥液100 ml，加至預(yù)處理合格的大孔吸附樹脂柱（LS-303，20 g，直徑1.5 cm），流速1 BV/h，收集吸附后濾液，攪勻，按2.2項(xiàng)下要求測定總黃酮含量，計(jì)算吸附率。加70 %乙醇200 ml至樹脂柱，攪勻，洗脫，流速1 BV/h，收集洗脫液，攪勻，按2.2項(xiàng)下要求測定總黃酮含量，計(jì)算解析率。結(jié)果見表2。由表2可見，動態(tài)吸附方式的吸附率高于靜態(tài)吸附。

表2 大孔吸附樹脂靜、動態(tài)吸附率及解析率結(jié)果

2.5 泄露曲線繪制

取預(yù)處理樹脂20 g（體積28 ml），裝柱（直徑1.5 cm）。取上樣藥液（45.33 mg/ml）300 ml，以1 BV/h流速上樣。收集流出液，每份28 ml。測定總黃酮含量，以總黃酮含量為考察指標(biāo)繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，當(dāng)上樣吸附84～112 ml（4 BV）時(shí)，開始有泄漏，故暫定吸附終點(diǎn)為總黃酮/樹脂=5.14:20。

圖1 初步確定吸附終點(diǎn)的泄露曲線

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選大孔吸附樹脂柱吸附工藝

2.6.1 因素及水平考察 根據(jù)單因素探索性試驗(yàn)結(jié)果，取樹脂20 g（28 ml），選擇上樣藥液濃度、吸附流速、樹脂柱高度等3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)定因素水平，見表3。

表3 大孔樹脂吸附工藝因素水平

2.6.2 取金剛藤藥材細(xì)粉，按2.2項(xiàng)下要求制備上樣藥液3批，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)方案分別取80 ml，加至預(yù)處理合格的大孔吸附樹脂柱，進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后，測定吸附后濾液中總黃酮含量，計(jì)算吸附率；取200 ml 70 %乙醇加至樹脂柱中，攪拌均勻，排凈氣泡，進(jìn)行洗脫，洗脫流度均為1 BV/h，洗脫液濃縮、干燥，測定總黃酮含量，測定結(jié)果及方差分析結(jié)果見表4。

由表4可見，考慮吸附率最佳工藝均為A3B2C1；考慮提取物總黃酮含量最佳工藝均為A3B2C2。由方差分析可見，樹脂柱高徑比對吸附率有顯著影響，上樣藥液含量對提取物含量有顯著影響。綜合考慮耗能等因素，最佳工藝定為A3B2C2，即上樣藥液濃度45.81 mg/ml、吸附流速1 BV/h、樹脂柱徑高比8.9:2。

表4 篩選動態(tài)吸附參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重新確定吸附終點(diǎn)

取預(yù)處理樹脂20 g（體積28 ml），裝柱（直徑2 cm）。取上樣藥液（45.56 mg/ml）200 ml，以1 BV/h流速上樣。收集流出液，每份14 ml。以總黃酮質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，當(dāng)上樣吸附84～98 ml（3.5 BV）時(shí)，開始有泄漏，故確定吸附終點(diǎn)為總黃酮:樹脂=4.5:20，上樣藥液:樹脂（v/v）=3.5:1。

圖2 重新確定吸附終點(diǎn)的泄露曲線

2.8 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化大孔吸附樹脂柱洗脫工藝

2.8.1 因素及水平考察 根據(jù)單因素探索性試驗(yàn)結(jié)果，選擇水洗體積數(shù)、洗脫液濃度、洗脫液體積數(shù)、洗脫流度等4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)定因素水平，見表5。

表5 洗脫工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.8.2 取金剛藤藥材細(xì)粉，按2.2項(xiàng)下要求制備上樣藥液，按2.6和2.7項(xiàng)下優(yōu)選最佳工藝進(jìn)行吸附，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)方案進(jìn)行洗脫，檢測水洗脫液、醇洗脫液含量，計(jì)算醇洗脫液解析率。將醇洗脫液回收乙醇、減壓濃縮、70 ℃減壓干燥，檢測總黃酮含量，測定結(jié)果及方差分析結(jié)果見表6。

表6 篩選洗脫參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6可見，考慮醇洗脫液解析率，最佳工藝為A3B2C2D3；考慮提取物總黃酮含量，最佳工藝為A3B2C2D2。由方差分析可見，水洗體積數(shù)、洗脫液濃度對解析率、總黃酮含量有顯著影響。綜合考慮耗能等因素，最佳工藝定為A2B2C2D2，即水洗體積數(shù)2 BV、洗脫液濃度60 %、洗脫液體積數(shù)6 BV、洗脫流度1 BV/h。

2.9 干燥溫度考察

取上樣藥液70 ml，按2.3～2.8項(xiàng)下操作得60 %乙醇洗脫液500 ml，減壓回收乙醇，平均分為3份，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，減壓干燥（60，70，80 ℃）。干燥后，研細(xì)，稱重，得金剛藤總黃酮提取物。按2.1項(xiàng)下操作測定總黃酮含量，結(jié)果見表7。由表7可見，干燥溫度對總黃酮含量無明顯影響，但60 ℃干燥時(shí)間較長，因此確定減壓干燥溫度為70 ℃。

表7 不同干燥溫度對總黃酮含量影響結(jié)果

2.10 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為考察上述工藝的穩(wěn)定性，按最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)（n=3），分別測定金剛藤總黃酮提取物中總黃酮含量，結(jié)果見表8。由表8可見，該工藝穩(wěn)定、可行。

表8 3批工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.11 樹脂再生使用試驗(yàn)

按照工藝驗(yàn)證試驗(yàn)方法連續(xù)10次試驗(yàn)，結(jié)果LS303型樹脂的重復(fù)使用性能較好，重復(fù)使用10次之后，吸附率和解析率無明顯變化。

3 討論

3.1 由于工業(yè)化生產(chǎn)均使用全自動設(shè)備，多為動態(tài)吸附，因此本試驗(yàn)采用靜態(tài)吸附篩選樹脂型號后，與動態(tài)吸附進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)動態(tài)吸附的吸附率高于靜態(tài)吸附。

3.2 本試驗(yàn)篩選吸附終點(diǎn)為上樣藥液：樹脂（v/v）=3.5:1，在此條件下，仍有少量泄露，為降低損失，擴(kuò)大生產(chǎn)時(shí)可適當(dāng)降低比例。

3.3 金剛藤吸附結(jié)束，樹脂柱內(nèi)仍有部分上樣藥液，含有較多非黃酮類成分，因此本試驗(yàn)考察了水洗脫體積數(shù)，水洗2 BV和3 BV無明顯差異，因此選擇水洗2 BV。