紫草素在缺血再灌注損傷中的應(yīng)用研究

胡偉，曹磊，董巖，付生軍，楊立

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，蘭州 730030)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是臨床常見的病理性損害，多發(fā)生于休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷以及器官移植等手術(shù)過程中[1]。而再灌注后的炎癥可進(jìn)一步加重IRI[2]，甚至造成不可逆性損害。炎癥損傷是影響缺血組織再灌注治療獲益的主要原因，也是影響移植器官早期功能恢復(fù)及患者長期存活的獨(dú)立危險因素[3]。IRI是一種無菌性炎癥，以往可通過清除自由基、減輕鈣超載及抗炎等減輕這種炎癥損傷[4]。近年來，中藥因不良反應(yīng)小、治療窗寬、價格低廉等特點(diǎn)在抗炎治療方面優(yōu)勢顯著。紫草及其制劑在中醫(yī)臨床治療中廣泛應(yīng)用，而紫草素是一種從紫草根中提取的萘醌類活性單體成分[5]，目前尚未應(yīng)用于臨床治療。隨著國家對中醫(yī)藥研究的積極推動，關(guān)于紫草素藥用價值的理論研究已成為研究熱點(diǎn)，目前主要集中于皮膚、肝臟、腫瘤防治等領(lǐng)域。紫草素在腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死、自噬等過程中發(fā)揮重要作用，另外，紫草素在減輕組織器官IRI的研究報道也日益增多，但目前研究主要處于細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)階段[6-8]。現(xiàn)就紫草素在IRI中的應(yīng)用研究予以綜述。

1 紫草素

紫草素主要以新疆紫草、內(nèi)蒙紫草和滇紫草為來源[5]。臨床上常用紫草素治療急、慢性肝炎；局部應(yīng)用紫草素可治療皮膚燒傷、促進(jìn)傷口愈合；紫草素油型制劑還可用于治療皮炎、濕疹等；眼科常用紫草素治療單純皰疹病毒性角膜炎；紫草及其衍生物亦常被作為藥物、化妝品及食品的著色劑[9-10]。

紫草素不易溶于水，可溶于無水乙醇等有機(jī)溶劑，與非離子表面活性劑調(diào)配后可制成水溶液，在堿性溶液中溶解度較高，遇酸則沉淀析出[10-11]。同位素放射示蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫草素進(jìn)入小鼠體內(nèi)后迅速發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，經(jīng)灌胃或肌內(nèi)注射1 min后即可在血漿中測得放射性，5～7 min達(dá)高峰，但首關(guān)效應(yīng)明顯，因此經(jīng)口服或腹腔注射的生物利用度較低，僅為34.3%[12]。食物對紫草素的吸收有促進(jìn)作用[13]，紫草素入血后與血漿蛋白結(jié)合率高，聯(lián)合用藥時可能與其他藥物產(chǎn)生競爭作用，影響藥效的發(fā)揮；另外，紫草素在小鼠不同組織或器官之間的分布隨給藥時間的不同而存在較大差異，提示可能存在二次吸收再分布現(xiàn)象[14]，臨床用藥或動物實(shí)驗(yàn)時應(yīng)考慮這一點(diǎn)。有學(xué)者指出，攝入較高劑量[15 mg/(kg·d)]的紫草素會對小鼠產(chǎn)生一定的毒性作用[15]。紫草素經(jīng)肝臟分解后主要隨膽汁進(jìn)入糞便排泄，以腎-尿液排泄為輔，僅有小部分以原形藥從尿液及糞便中排出[12-13]。

紫草素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病原微生物、免疫調(diào)節(jié)、保肝、止血、心血管保護(hù)等藥理作用，其抗癌作用的主要機(jī)制包括參與細(xì)胞凋亡、壞死、自噬相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤血管生成等[16]。目前認(rèn)為，紫草素的抗炎機(jī)制與白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子κB、CC趨化因子及其受體、環(huán)加氧酶2等密切相關(guān)[5]。炎癥損傷是許多IRI疾病的重要病理機(jī)制之一，抑制過度炎癥是治療IRI的重要靶點(diǎn)[17]。紫草素在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管保護(hù)等方面的優(yōu)勢作用可以為其預(yù)防或治療IRI提供參考。

2 IRI的發(fā)病機(jī)制

IRI是指組織器官在缺血后重新獲得血液供應(yīng)時,組織或器官的功能未恢復(fù)，反而出現(xiàn)代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的病理現(xiàn)象[4,18]。心、腦、腎或機(jī)體其他組織器官均可發(fā)生IRI，其主要的發(fā)病機(jī)制概括為以下幾點(diǎn)。

2.1自由基大量生成 再灌注為組織提供血液和氧氣的同時，還產(chǎn)生大量自由基。自由基指外層電子軌道上存在不配對的單個電子的原子或分子等物質(zhì)，其中由氧誘發(fā)的自由基稱為氧自由基，包括超氧陰離子、羥自由基等，過氧化氫等活性氧類雖不屬于自由基，但其在IRI中發(fā)揮重要作用，因此常一并討論[19]。由于活性氧類和自由基具有不穩(wěn)定且活潑的化學(xué)性質(zhì)，因此具有較強(qiáng)的破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)變性失活、脂質(zhì)過氧化等能力[20]。生物體內(nèi)有兩大抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)，即酶性抗氧化劑和非酶性抗氧化劑。正常情況下，體內(nèi)活性氧類等自由基水平與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、泛素、維生素A等自由基清除物質(zhì)水平處于動態(tài)平衡[21]。當(dāng)缺血缺氧時，組織器官內(nèi)次黃嘌呤等物質(zhì)大量堆積，再灌注時瞬間涌入的過量氧氣分子提供的電子受體將次黃嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化為尿酸[22]，在此反應(yīng)過程中，超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等氧化應(yīng)激產(chǎn)物大量產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體處于缺氧等應(yīng)激條件下時，體內(nèi)兒茶酚胺水平不斷升高，而兒茶酚胺可在單胺氧化酶的作用下，生成超氧陰離子，導(dǎo)致體內(nèi)自由基水平進(jìn)一步升高[23]。值得注意的是，在白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞聚集、招募和浸潤過程中同樣伴隨氧自由基的大量生成[24]。此外，由于自由基破壞、鈣超載等因素對線粒體膜的影響，導(dǎo)致線粒體內(nèi)電子傳遞效能降低，正常的自由基清除系統(tǒng)無法及時有效發(fā)揮作用，同時線粒體內(nèi)的氧自由基大量堆積[25]，最終導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化物質(zhì)消耗殆盡、自由基與清除系統(tǒng)的平衡被打破，造成組織損傷。

2.2細(xì)胞內(nèi)鈣超載 正常情況下，胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)濃度僅約為胞外的1/10 000，其中作為第二信使的游離鈣僅占胞內(nèi)Ca2+的0.005%[26]。組織器官缺血缺氧導(dǎo)致機(jī)體代謝產(chǎn)物堆積、pH值升高、細(xì)胞內(nèi)酸中毒、離子交換異常，使Na+-Ca2+交換增加[27]。此外，胞內(nèi)鈣超載引起組織器官IRI的作用機(jī)制還包括：①氧自由基等對生物膜的破壞致使胞外Ca2+內(nèi)流增加[24]；②線粒體氧化磷酸化功能受到抑制，ATP依賴的離子泵功能障礙，導(dǎo)致胞內(nèi)多余的Ca2+無法及時轉(zhuǎn)運(yùn)出去，進(jìn)一步加重IRI對細(xì)胞的損害[28]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚過多可通過各種途徑引起線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開放，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因激活，導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡[29-30]。而且，缺氧等應(yīng)激可激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，導(dǎo)致兒茶酚胺大量產(chǎn)生，通過α、β腎上腺素受體分別促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+和胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生不可逆性損傷[31]。

2.3白細(xì)胞聚集活化及炎癥反應(yīng)過度激活 動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證明，白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞在IRI區(qū)域大量聚集，與白細(xì)胞呼吸暴發(fā)及炎癥級聯(lián)反應(yīng)相互促進(jìn)、相互影響[6,32-33]，其具體機(jī)制目前尚未完全闡明，可能與中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中的黏附分子、趨化因子表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[24,34]。中性粒細(xì)胞聚集、活化過程中伴隨著大量炎癥細(xì)胞因子釋放，如IL-1β、IL-6和TNF-α等[35]，而這些細(xì)胞因子會激活更多的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重IRI[36]。

3 紫草素對IRI的保護(hù)作用

3.1減輕組織水腫、壞死 各種組織或器官缺血再灌注均可造成相應(yīng)細(xì)胞變性、壞死，破壞細(xì)胞膜屏障功能，造成細(xì)胞內(nèi)空泡形成、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞崩解死亡，表現(xiàn)為組織水腫、壞死的廣泛形成，因此減輕上述病理損害被視為干預(yù)或治療IRI的有效依據(jù)[27]。在肝臟節(jié)段性IRI模型中，缺血再灌注組大鼠肝組織廣泛壞死、水腫，經(jīng)不同劑量紫草素預(yù)處理后，再灌注后3個時間觀察點(diǎn)的肝組織水腫均顯著改善，且壞死區(qū)域明顯減少，尤以再灌注后6 h的改善效果最為顯著，同時血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著降低[6]。缺血性腦血管病給患者的生活和家庭造成了嚴(yán)重影響，早期干預(yù)可以減輕腦水腫，減小腦梗死面積。在一項(xiàng)針對小鼠腦IRI模型的研究中，再灌注導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞核萎縮、胞質(zhì)嗜酸粒細(xì)胞增多和細(xì)胞水腫等IRI特征性病理損害，而紫草素干預(yù)治療可減輕缺血再灌注導(dǎo)致的上述組織病理損害，同時可降低神經(jīng)元的萎縮程度和速度[37]，可能為缺血性腦血管病患者的治療提供幫助。另外，在心肌缺血再灌注中，經(jīng)紫草素預(yù)處理后，小鼠心肌梗死面積、血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ、肌酸激酶同工酶MB等心肌損傷標(biāo)志物水平也均顯著改善，且這種作用呈劑量依賴性[8]。

3.2抑制炎癥細(xì)胞聚集和激活 再灌注后的炎癥瀑布反應(yīng)是導(dǎo)致IRI的病理基礎(chǔ)之一，而炎癥細(xì)胞的聚集和激活在其中起關(guān)鍵作用。研究表明，再灌注可激活TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子受體，而TNF-α、IL-1β等與對應(yīng)受體結(jié)合后可激活眾多炎癥相關(guān)細(xì)胞因子信號通路，進(jìn)而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[38-39]。白細(xì)胞浸潤，特別是中性粒細(xì)胞聚集是炎癥反應(yīng)的典型特征之一，而髓過氧化物酶的活性與中性粒細(xì)胞的浸潤程度及數(shù)量呈正相關(guān)[40]。在急性肺損傷[41-42]、急性肝損傷[43]等所致的組織炎癥反應(yīng)中均可觀察到大量中性粒細(xì)胞聚集以及TNF-α、IL-1β、髓過氧化物酶水平升高。以上實(shí)驗(yàn)表明，紫草素提前干預(yù)或再灌注后及時治療均可抑制髓過氧化物酶活性，減少中性粒細(xì)胞聚集和炎癥細(xì)胞因子激活。

3.3減少炎癥細(xì)胞因子釋放和氧化應(yīng)激水平 再灌注可造成炎癥因子相關(guān)基因和信號通路激活，刺激炎癥細(xì)胞聚集和激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)，反映在分子水平上就是氧化應(yīng)激產(chǎn)物或炎癥細(xì)胞因子的大量釋放。相關(guān)研究表明，在肝臟缺血再灌注后6 h，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平達(dá)峰值，而紫草素預(yù)處理可顯著降低炎癥細(xì)胞因子水平，且降低程度隨紫草素劑量增加而增大[6]。

氧化代謝對組織細(xì)胞的生存至關(guān)重要，這與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)[37]，活性氧類等自由基清除不利可進(jìn)一步造成脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性失活等損害，加重IRI。在急性肝損傷模型中，對乙酰氨基酚實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)谷胱甘肽被大量消耗、超氧化物歧化酶活性降低，同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛大量產(chǎn)生，而紫草素干預(yù)組小鼠體內(nèi)的谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平降低則并不顯著，丙二醛的產(chǎn)生量也較少，肝組織出血、細(xì)胞變性壞死等均顯著改善[43-44]，表明紫草素在改善對乙酰氨基酚所致肝臟氧化應(yīng)激損傷方面具有強(qiáng)大作用。

紫草素改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)主要涉及的信號通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路[6,8,43,45]、核因子κB信號通路[42,45]、促分裂原活化的蛋白激酶信號通路[42]以及IL-1β/c-Jun氨基端激酶/磷酸化c-Jun氨基端激酶信號通路[39]等，但目前哪條信號通路在其中占主導(dǎo)地位尚不明確，這些通路相互交叉、相互影響，共同決定體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)展方向。上述研究為紫草素作為治療IRI的新型藥物提供了參考，也為探究紫草素在改善和保護(hù)器官IRI方面的機(jī)制研究提供了新的思路和方向。

3.4減少細(xì)胞凋亡和自噬 過強(qiáng)的氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致組織或器官的不可逆性損傷，造成細(xì)胞凋亡或死亡，引起器官功能障礙。細(xì)胞死亡與器官IRI密切相關(guān)，凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，在缺血再灌注中尤其常見，主要受B細(xì)胞淋巴瘤-2、胱天蛋白酶等基因家族調(diào)控；自噬的主要特點(diǎn)是形成自噬小體或自溶酶體，目前認(rèn)為自噬主要受Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和p62等基因調(diào)控，通過透射電子顯微鏡可以觀察到特征性的自噬小體[6,39]。在肝IRI動物模型中，與缺血再灌注組相比，紫草素治療組中的抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2水平在各指定檢測點(diǎn)均上調(diào)，而促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3水平均下調(diào)；經(jīng)紫草素預(yù)處理后，Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和p62蛋白的表達(dá)均受到抑制，通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紫草素預(yù)處理組的溶酶體和自噬小體數(shù)量均顯著減少；另外，肝組織免疫化學(xué)染色與聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果一致，為上述結(jié)果提供了更進(jìn)一步的有力證據(jù)支持[6]。黃澤林[46]研究表明，紫草素預(yù)處理可抑制大鼠肢體IRI中的細(xì)胞凋亡，上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2水平，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白水平。紫草素拮抗促凋亡蛋白表達(dá)、促進(jìn)抗凋亡蛋白表達(dá)的作用在低氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型[47]以及心肌IRI動物模型[8]中均得到了證實(shí)。

4 小 結(jié)

近年預(yù)防或治療IRI已成為研究熱點(diǎn)。紫草素作為一種天然的脂溶性萘醌類藥物，在腫瘤的抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面顯示出巨大作用，甚至可能作為一種新型的免疫抑制劑用于臨床移植[48]。IRI主要由自由基生成增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和炎癥反應(yīng)過度激活引起。了解紫草素在急性組織損傷、缺血性疾病以及心、腦和肝IRI等方面的研究現(xiàn)狀，探究紫草素減輕IRI、保護(hù)組織器官功能的作用機(jī)制，可為進(jìn)一步深入研究紫草素在器官IRI方面的詳細(xì)作用機(jī)制提供幫助，也為其作為IRI的潛在預(yù)防和治療藥物提供新思路，未來紫草素可能用于減輕器官移植圍手術(shù)期缺血再灌注造成的臟器損害，但具體方案有待進(jìn)一步深入研究。