副豬嗜血桿菌研究進展

劉俊琦

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南永州425000）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,H.parasuis）屬于巴斯德氏家族成員，是豬上呼吸道的早期入侵菌，為豬Glasser’s病的病因菌[1]。H.parasuis可寄居于健康豬只的上呼吸道，不引起明顯癥狀，但當豬只抵抗力下降或感染其他細菌、病毒性疾病時，H.parasuis可引起豬只出現(xiàn)多發(fā)性漿膜炎，甚至死亡[2,3]。H.parasuis具有多種基因型和血清型，但是至今為止未證實H.parasuis分型與細菌毒力之間有明顯的聯(lián)系[4]。引起H.parasuis的發(fā)病機制較復(fù)雜，通常認為細菌到達肺部后大量繁殖，隨后擴散至全身，引起系統(tǒng)性疾病。細菌在漿膜表面復(fù)制，引起炎癥損傷。鑒定副豬嗜血桿菌粘附、逃避、侵入的關(guān)鍵因素，可為掌握副豬嗜血桿菌的致病機制奠定基礎(chǔ)，也為日后合理設(shè)計高效疫苗提供理論依據(jù)。

1 流行病學(xué)調(diào)查

目前有已將H.parasuis分離、鑒定為15個血清型，且各血清型之間毒力差異較大。血清4型和5型在多個國家具有高流行性，例如加拿大、美國、德國[5-7]。在中國，研究者對110個分離菌株進行分離鑒定，結(jié)果證實血清5型（26.4%）和血清4型（14.5%）為最主要菌株，與國外報道相似，其次為血清13型（10.9%）和血清12型（9.1%）[8]。在越南，血清5型H.parasuis為最主要的流行菌株（26.8%），其次為血清2型（23.2%）、4型（17.9%）、10型、9型、1型、6型、7型和8型；vta1為最主要的毒力基因（62.5%），其次為vta3（42.9%）、vta2（39.3%）、HPM-1371（35.7%）、capD（30.4%）、HPM-1372（12.5%）、lsgB（8.9%）和HPM-1373（8.9%）[9]。

2 發(fā)病機制

H.parasuis的致病機制是受多種因素影響的感染過程，它需要多種機制建立感染，從而引起豬只發(fā)病。最初H.parasuis是在上呼吸道中進行感染，但隨著病情加重，細菌可擴散至肺部，引起肺炎。嚴重者可引起全身性感染，表現(xiàn)出纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，這些癥狀是Glasser’s病的典型癥狀[10]。H.parasuis通過粘附、入侵宿主上皮細胞從而建立早期感染[11]，通過降解IgA躲避宿主天然免疫系統(tǒng)[12]，并且細菌可抵抗巨噬細胞的吞噬作用[13]和補體的殺菌作用[14]。細菌可誘導(dǎo)氣管上皮細胞產(chǎn)生細胞凋亡，從而破壞了氣管粘膜。在肺部，通過巨噬細胞的吞噬作用可消除無毒力的H.parasuis[13]。然而，強毒菌株能通過產(chǎn)生囊泡躲避肺泡巨噬細胞的吞噬，使得細菌能在肺部增殖[13]。H.parasuis細菌在宿主體內(nèi)大量增殖，產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)，這些炎癥可引起滲透性改變，釋放出炎性因子IL-6和IL-8，使得豬只表現(xiàn)出Glasser’s病的典型癥狀[15]。盡管當前對于細菌是如何到達血液的機制仍不清楚，但是推測強毒株對內(nèi)皮細胞的入侵力可能在全身性感染中起著關(guān)鍵作用[16]。當強毒株進入血液循環(huán)后，它可有效地躲避補體介導(dǎo)的殺菌體系，抵制血清的殺菌作用，從而引起全身性感染，導(dǎo)致患病豬出現(xiàn)多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[14]。有研究表明，H.parasuis入侵內(nèi)皮細胞的能力決定了患病豬腦膜炎感染程度[17]。毒力菌株通過入侵內(nèi)皮細胞，穿過血腦屏障，引起腦膜炎[16]。

TGF-β1通過調(diào)節(jié)整合素、纖連蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白的表達，在細菌侵入細胞的過程中起著重要作用。Li等人發(fā)現(xiàn)TGF-β1可影響H.parasuis入侵PK-15細胞，在感染H.parasuis后PK-15細胞提升了TGF-β1的表達水平；在感染前用TGF-β1處理PK-15細胞可顯著降低H.parasuis的侵襲力[18]。LuxS/AI-2是一類非常重要的群體感應(yīng)系統(tǒng)，影響細菌生長特性、生物膜形成能力、抗體生成、毒力和新陳代謝。Zhangd等人通過敲除和回補LuxS，證實LuxS參與調(diào)節(jié)抗脅迫、生物膜形成和毒力[19]。

3 毒力因子

生物膜是細菌的一個重要毒力因子。體外實驗表明，與無毒菌株相比，強毒菌株能產(chǎn)生較多的生物膜[20]。生物膜的產(chǎn)生可能僅與黏膜定植有關(guān)，與全身性定植關(guān)系不大。研究者在肺部感染病例中檢測出生物膜功能相似基因siaB、hrtA、fumC、gcpE、acrR[21]。Hill等人發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激下，fadD、apaH、pstI、cysK基因的表達上調(diào)[22]。Fu等人鑒定了H.parasuis細胞壁6PGD[23],該基因為豬源致病性鏈球菌的保護性抗原。研究發(fā)現(xiàn)6PGD蛋白參與細菌粘附至豬肺泡上皮細胞，并且重組的6PGD蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6和IL-8，小鼠試驗證實該蛋白具有免疫源性和部分保護性，認為6PGD可作為潛在的基因工程疫苗候選基因[23]。H.parasuis SH0165具有4型IV菌毛基因，包括編碼主要結(jié)構(gòu)單元PilA和3個生物源蛋白PilB、PilC、PilD[24]。血清4型H.parasuis gx033的基因組分析表明，該菌攜帶pilF基因[25]。CDT屬于AB2型毒素家族，通常由3個亞基（cdtA、cdtB、cdtC）組成。在109個臨床分離株和15個血清型H.parasuis中菌檢測出cdtB蛋白[26]。研究發(fā)現(xiàn)CDT缺陷菌株對血清的敏感性增加，并降低了對豬臍靜脈內(nèi)皮細胞和豬腎上皮細胞的粘附和入侵[27]。在具有毒力的菌株中檢測出參與產(chǎn)生泡囊的capD基因，而在無毒菌株中未檢測出該基因[28]。在高毒菌株中敲除capD基因，結(jié)果細菌的致病力明顯下降且對血清的抗性降低[29]。OmpP2是H.parasuis外膜中含量最豐富的蛋白，該蛋白在細菌中具有高保守性[30]。當缺乏OmpP5時，細菌表現(xiàn)出生長緩慢[31]。VtaA編碼具有特異性粘附區(qū)域的外膜蛋白，該基因具抗原性，攻毒試驗表現(xiàn)出一定的保護性，并且在小鼠試驗中VtaA呈現(xiàn)出交叉反應(yīng)[32]。在H.parasuis中組3的VtaA具有高保守性，而在毒力菌株中可檢測出組1和組2的VtaA，VtaA在H.parasuis的這種差異表現(xiàn)可被用于構(gòu)建鑒定細菌毒力的PCR方法[33]。VacJ蛋白屬于外膜脂蛋白，與多種病原菌的毒力相關(guān)。Zhao等人通過敲除VacJ觀察到細菌形態(tài)發(fā)生改變，NPN熒光性增加，并對SDS-EDTA、滲透壓、氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗性降低，從而證實VacJ在H.parasuis維持細胞完整性和耐受力中起著重要作用[34]。ArcA參與調(diào)節(jié)大量參與有氧和無氧代謝的基因，Ding等人證實敲除arcA基因使得H.parasuis在厭氧條件下的生長速度減緩，并減低細菌對小鼠的致病力[35]。Huang等人通過敲除和回補ClpP，證實敲除ClpP使得H.parasuis對熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、滲透壓的降低[36]。cAMP受體蛋白（CRP）是一類重要的調(diào)節(jié)子，在細菌感染過程中對適應(yīng)環(huán)境變化起著重要作用，Jiang等人證實CRP基因參與細菌生長、生物膜形成、耐受性、血清抗性、鐵利用[37]。

4 防治措施

當前通過免疫接種商品疫苗、自價苗是預(yù)防H.parasuis感染的重要措施，當前的研究疫苗重要包括滅活苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、弱毒疫苗。盡管接種疫苗能降低細菌的致死率，但是由于不同分型菌之間缺乏交叉保護，常導(dǎo)致免疫失敗[38-41]。目前市場上的商品疫苗均為H.parasuis滅活苗，是由強毒株傳代培養(yǎng)產(chǎn)生，經(jīng)甲醛37℃滅活48h后重懸，加入礦油、氫氧化鋁或者蜂膠等佐劑[42]。除了單價苗，目前市場上已出現(xiàn)二價、三價、四價H.parasuis疫苗，這些疫苗包含了多種血清型，具有一定的交叉保護。商品化滅活苗的廣泛使用，在一定程度上降低了H.parasuis在全球的爆發(fā)。滅活苗可對接種疫苗的母豬所生仔豬提供一段時間的免疫保護。在接種2次滅活疫苗后，可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生180天的免疫保護，高濃度的IgG使得疫苗的免疫時間延長。此外，高濃度的母源抗體通常持續(xù)3周，有效地保護仔豬避免感染H.parasuis，提升了仔豬存活率。并且母源抗體不干擾1～3周齡仔豬的免疫。因此，母豬分娩前接種疫苗能有效地預(yù)防Glasser’s病的發(fā)生，保護哺乳期仔豬。盡管滅活苗具有眾多優(yōu)點，但也存在一些缺陷：滅活苗不完全包含了區(qū)域內(nèi)所有流行毒株；佐劑效果的不穩(wěn)定性使得疫苗很難維持穩(wěn)定的保護效果；滅活苗只能提供短時間的保護效果[42]。弱毒苗能提高免疫效果，但是由于缺乏H.parasuis主要毒力因子的研究，使得弱毒苗發(fā)展受阻[43]。當前H.parasuis疫苗的一個研究熱點為通過基因敲除技術(shù)，敲除細菌中重要的毒力因子，從而構(gòu)建一些活的減毒突變株，包括capD突變株、rfaE突變株、cheY突變株、hfq突變株、wza突變株、lgtF突變株[29,44,45]。近年來，大量免疫組學(xué)分析表明一些毒力因子和免疫蛋白可在不同菌株之間產(chǎn)生免疫保護作用，這表明研發(fā)高效的基因工程疫苗乃H.parasuis防治的大勢所趨[46-49]。

在當前缺乏具有交叉保護的商品疫苗的養(yǎng)殖背景下，藥物治療仍是治療本病的主要措施。研究者通過構(gòu)建H.parasuisMIC值的肉湯微量稀釋檢測方法，對H.parasuis在德國的耐藥情況進行評估，對頭孢噻肟具有敏感性而對鏈霉素具有耐藥性[50]。在丹麥，研究者發(fā)現(xiàn)所有分離的H.parasuis對氨芐西林、頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟霉素、青霉素、大白菜霉素、四環(huán)素、噻穆林或替米考星均敏感；有2株H.parasuis對甲氧芐氨嘧啶和新若明具有耐藥性；有6株H.parasuis對環(huán)丙沙星的敏感性降低；有10株H.parasuis對TMP和磺胺甲惡唑的敏感性降低[51]。在中國，Zhou等人報道所分離的110株H.parasuis對頭孢噻肟、頭孢噻呋、阿奇霉素、氯霉素、氟苯尼考和替米星敏感[51]。恩若沙星具有氟喹諾酮活性，可用于治療革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌感染[52]。恩若沙星通過抑制細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶（一種II型拓撲異構(gòu)酶），阻礙了細菌中DNA超螺旋的形成和復(fù)制，從而引起細菌的死亡[53]。有研究發(fā)現(xiàn)H.parasui對恩若星沙比較敏感，使用恩若沙星治療可減輕豬上呼吸道中H.parasuis感染癥狀[3]。