綿羊精液冷凍技術(shù)及其發(fā)展概況

王俊峰

(貴州凱里黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州黔東南 556000)

綿羊精液冷凍技術(shù)及其發(fā)展概況

王俊峰

(貴州凱里黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州黔東南 556000)

家畜精液保存技術(shù)是20世紀(jì)隨著人工授精技術(shù)廣泛應(yīng)用而產(chǎn)生的。原理是通過(guò)降低或一致精子新陳代謝強(qiáng)度達(dá)到延長(zhǎng)精子在體外壽命的目的。由于較高的使用性和可觀的經(jīng)濟(jì)效益，在近幾十年得到長(zhǎng)足發(fā)展。現(xiàn)已研究的稀釋液包括檸檬酸鹽——糖類(lèi)、奶類(lèi)、蔗糖類(lèi)、棉籽糖類(lèi)、三基類(lèi)和其他含保護(hù)劑的抗氧化的溶液。凍精子宮頸輸精的產(chǎn)羔率與冷凍技術(shù)和輸精操作有關(guān)。本文重點(diǎn)介紹綿羊冷凍精液的保存、人工輸精技術(shù)。

1 綿羊的精液冷凍歷史

綿羊精液冷凍保存技術(shù)研究開(kāi)始于20世紀(jì)50年代。Emmens（1950）將綿羊精液冷凍到-79℃獲得了較高的存活率。后來(lái)，Mkorozzov（1964）[1]和PLKATILOVA（1960）分別用含30%卵黃、16%甘油的高滲卵黃-檸檬酸鹽-葡萄糖-甘油稀釋液和等滲的卵黃-檸檬酸鹽-阿拉伯糖稀釋液都獲得了較高的產(chǎn)羔率。

2 綿羊精液冷凍保存的稀釋液

為了延長(zhǎng)精子在體外的存活時(shí)間和授精力，便于保存和運(yùn)輸，常向精液中加入適宜精子存活的稀釋液。對(duì)稀釋液的基本要求包括：pH、緩沖性、滲透壓和低溫保護(hù)性能。常規(guī)的稀釋液可分為6種：

2.1 檸檬酸鹽-糖類(lèi)稀釋液

Emmens等（1950）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檸檬酸鹽液加0.9%～1.25%，阿拉伯糖的凍精存活率高。大多研究者發(fā)現(xiàn)提高稀釋液滲透壓可增加凍精存活率。如，Kuznecov等（1959）用高滲的檸檬酸鹽-葡萄糖-卵黃液獲得產(chǎn)羔率提高。

2.2 奶類(lèi)稀釋液

奶類(lèi)用于精液冷凍時(shí)要加入阿拉伯糖、果糖或卵黃（Blackshaw，1955；……Aumdal 等，1982）。

2.3 乳糖類(lèi)稀釋液

Marinov等（1983a，1984）證實(shí)，乳糖-卵黃液加12%EPC-20或EPC-6（多不飽和脂肪酸與乙二醇的復(fù)合物）對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)保護(hù)性較好。Zheltobrjuk等（1981）報(bào)道，乳糖-卵黃液中添家5%～6%polyglukine或10%repolyglukine（一種高分子葡萄糖漿合物），凍精存活率和授精率提高。Fiser等（1987～1990）試驗(yàn)在乳糖-葡萄糖稀釋液中冷凍綿羊精液獲得了可接受的授精率。

2.4 加抗氧化劑的蔗糖類(lèi)稀釋液

蔗糖作合成稀釋液主要成分是因?yàn)檎崽菍?duì)精子頂體保護(hù)性能優(yōu)于葡萄糖、果糖或乳糖。又由于綿羊精液不像其他畜種其中不含抗氧化劑。因此，通常在蔗糖類(lèi)稀釋液中添加合成的抗氧化劑，以抑制精子磷脂成分特別是不飽和[廿二碳（22∶6）和廿碳（20∶4）]脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)。研究證實(shí)，維生素E添加到含葡萄糖ETA-Na2或三基的糖類(lèi)稀釋液中，對(duì)精液進(jìn)行無(wú)氧凍前處理效果好（Varnavshkij等，1976；M·lovanov等1976）。Nauk等（1992）報(bào)道，乳糖-卵黃稀釋液添加抗氧化劑Fenozane和epihyd能提高解凍后鏡子活力。后一種還能提高授精率。

2.5 棉籽糖類(lèi)稀釋液

Varnaskij等（1974）試驗(yàn)結(jié)果表明，在棉籽糖-檸檬酸鹽-卵黃和棉籽糖-乳糖-卵黃液中冷凍的綿羊精液的產(chǎn)羔率略高于乳糖-卵黃液。

2.6 三基類(lèi)稀釋液

三基[teis（hydroxymethyl）aminomethane]（三羥甲基氨基甲烷）高濃度對(duì)精子毒性低，具有良好的緩沖性、利尿性和滲透性。Salamon等（1972）酒漿三基-葡萄糖稀釋液應(yīng)用于試驗(yàn)中，并于1976年推薦作為綿羊精液冷凍稀釋液。

2.7 其他稀釋液

Good等（1996）提出的兩性離子緩沖劑如N-三基（羥甲基）甲基-2-氨基磺酸（tes）、N-2（羥乙基）哌嗪-n-2-乙烷磺酸和哌嗪-N、N-bis（2-乙烷磺酸）（pipes）的緩沖性能優(yōu)于三基。哈福，趙有璋等（2003）證實(shí)，將山梨醇、氯前列烯醇、復(fù)合維生素B在綿羊冷凍精液稀釋液中進(jìn)行添加、篩選。解凍后活率結(jié)果顯示，1號(hào)稀釋液（41.17±4.72）%和4號(hào)稀釋液（37.76±3.15）%極顯著地高于對(duì)照組稀釋液（22.80±4.49）%（P〈0.01）。表明，在綿羊凍精稀釋液中添加復(fù)合維生素B可有效提高凍精解凍后活率并保護(hù)精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性（2）。

3 綿羊精液冷凍保護(hù)劑

已證實(shí)多種制劑和物質(zhì)可作哺乳動(dòng)物精子的低溫保護(hù)劑，其中甘油和卵黃是最常用的綿羊冷凍保護(hù)劑。

3.1 甘油

甘油的保護(hù)作用與甘油能濃縮或結(jié)合細(xì)胞內(nèi)水有關(guān)。另外還有稀釋作用，可降低溶液中鹽的解離度和冷凍液的滲透壓。另?yè)?jù)Milovanov（1962）研究甘油還有阻礙冰晶核形成和增長(zhǎng)的性能及滅菌作用（3）。因此是較好的低溫保護(hù)劑。

3.2 卵黃

卵黃有維持精子活力、保護(hù)精子頂體和線粒體膜的作用。它還是一種“滲透性緩沖劑”，使精子能耐受低滲和高滲，且其濃度范圍較大。

3.3 其他

由于甘油最大的缺點(diǎn)是，它對(duì)精子的活力和授精力的毒害作用，這就激發(fā)人們對(duì)頂體保護(hù)作用的其他試劑和抗凍劑的研究。如侯藎褒用乙酰胺在小尾寒羊的精液冷凍試驗(yàn)中，解凍后精子活力最高為45%，幾次平均值為26%（4）。

3.4 稀釋比例

Platko（1965）的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果證明，4倍和8倍稀釋的凍精存活率提高2倍和16倍。現(xiàn)在人們常用的最終稀釋比例（精液于稀釋液之比）：顆粒精液為1∶1，安瓿精液和細(xì)管精液為1∶3（顆粒精液及安瓿精液采用兩次稀釋法，細(xì)管精液采用一次稀釋法）。

4 綿羊冷凍精液平衡

精液稀釋后的平衡是最早由Polge 等[5]在研究公牛精液冷凍方法時(shí)提出的。平衡的溫度一般為4℃～5℃，精液經(jīng)過(guò)平衡處理后能夠改進(jìn)冷凍效果。精液稀釋后逐漸降溫到4℃的過(guò)程是精子代謝減少的適應(yīng)過(guò)程。過(guò)慢或過(guò)快的冷卻速率會(huì)導(dǎo)致精細(xì)胞膜脂蛋白復(fù)合體被破壞和膜被分解。當(dāng)細(xì)胞膜脫水收縮達(dá)到臨界最小體積時(shí)，又會(huì)使細(xì)胞膜的滲透性產(chǎn)生不可逆的損傷，原來(lái)不能透過(guò)膜的溶質(zhì)變成可滲透性的，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷或死亡（Mazur[6]）。有資料報(bào)道山羊精液在冷凍前的平均損傷率為19.4 %，冷凍后的平均損傷率為17.1 %。因此，平衡方法對(duì)冷凍精液的品質(zhì)有重要影響。

4.1 平衡方法

（1）在30℃的環(huán)境下，分裝稀釋精液于細(xì)管內(nèi)，并用聚氯乙烯醇粉末封口，隨后在5℃的環(huán)境中平衡1.5 h；（2）在30候℃環(huán)境下把稀釋精液放入管內(nèi)，與細(xì)管一起在5 ℃的環(huán)境中平衡1.5 h，而后在5℃環(huán)境中分裝（7）

4.2 平衡時(shí)間

早期的研究者應(yīng)用兩步法冷凍精液時(shí)對(duì)最適平衡時(shí)間持不同觀點(diǎn)。Lopatko[8]在精液冷凍實(shí)驗(yàn)中使用12～16 h的平衡時(shí)間，而Fiser et al.[9]傾向于較短的平衡時(shí)間。Lapatko[10]在考察了0～20 h范圍的平衡時(shí)間之后認(rèn)為，最佳平衡時(shí)間為4 h。Jones et al.[11]報(bào)道平衡時(shí)間與稀釋比例有關(guān)。Salamon[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用二次稀釋法冷凍顆粒精液的最佳平衡時(shí)間是2.5 h。Lightfoot[13]的研究證實(shí)，顆粒冷凍精液的平衡時(shí)間與糖的類(lèi)型及甘油的濃度有關(guān)。Bauer et al.[14]報(bào)道平衡2 h和6 h的產(chǎn)羔率分別是43%和3%。而陳亞明，趙有璋等（2002）推薦生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用200 ml體積水浴2.5 h降溫到4 ℃的平衡方法（15）。

5 綿羊精液分裝與冷凍

5.1 分裝方法

（1）在玻璃安瓿或塑料細(xì)管上加印精液紡號(hào)及冷凍日期等標(biāo)記。

（2）安瓿精液 經(jīng)過(guò)二次稀釋后的精液，立即在3℃～4℃下進(jìn)行分裝（1 ml安瓿）和火焰封口。

（3）細(xì)管精液 用5 ml注射器，在室溫下分裝與0.25 ml細(xì)管內(nèi)，并隨即用塑料株或聚乙烯醇封口。細(xì)管精液不宜過(guò)滿，封口后中間應(yīng)保留一定空隙，以防解凍時(shí)細(xì)管暴烈。

5.2 冷凍方法

5.2.1 顆粒精液

①干冰法：用特制扎孔器或普通玻璃棒在預(yù)先攤平，壓實(shí)的干冰上戳上排列整齊的齊圓光滑的小孔（直徑0.4 cm，深2～2.5 cm）再用滴管吸取稀釋混勻的精液，按0.1 ml容量逐穴滴凍，經(jīng)4～5 min即可揀取，存放與液氮中。

②液氮法：先將液氮注入12磅廣口溫瓶?jī)?nèi)，隨后放置漂浮冷凍器，鋼網(wǎng)面保持以地溫溫度計(jì)測(cè)試溫度，隨時(shí)調(diào)節(jié)漂浮冷凍器銅網(wǎng)與液氮面的距離（約3 cm），確保銅網(wǎng)面溫度保持在-80℃左右，用滴管吸取精液，按每粒0.1ml滴凍。加蓋停留4 min浸入液氮，用小勺收取。精液分批冷凍，第二批滴洞前，需用干紗布將銅網(wǎng)面擦凈。

5.2.2 安瓿精液

安瓿精液由直徑25 cm、深20 cm的鋁筒，周?chē)? cm厚保溫材料并固定在特制木箱里的液氮槽和一個(gè)直徑18 cm、深3～4 cm帶網(wǎng)眼的漂浮器制成簡(jiǎn)易冷凍器，冷凍時(shí)，向液氮槽內(nèi)注入約1 L液氮，將約40支安瓿精液平放入漂浮器，置于距液氮面2 cm處，停留7 min后浸入注入液氮。

5.2.3 細(xì)管精液

常用與羊的冷凍細(xì)管：0.5 ml 法國(guó)細(xì)管，0.25 ml法國(guó)細(xì)管和0.25 ml德國(guó)微細(xì)管。細(xì)管精液冷凍一般是在液氮汽中，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)管與液氮面的距離來(lái)控制降溫速度。細(xì)管精液降溫速度變化曲線的形狀是很重要的，不應(yīng)呈線性。Milovanov等（1980）認(rèn)為，降溫曲線是符合t=T2/2p公式的拋物線，其中t代表精液溫度，T是降溫開(kāi)始后的時(shí)間（分鐘），p是拋物線參數(shù)（決定曲線坡度）。已證實(shí)對(duì)綿羊精液最適合的參數(shù)是0.01～0.15，可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)管與液氮面的距離來(lái)達(dá)到。

6 解凍

解凍同冷凍過(guò)程一樣必須迅速通過(guò)精子冷凍的危險(xiǎn)區(qū)（-15℃～-60℃），才不至于對(duì)精子造成損害，這主要取決于降溫速度是否高到足以引起精細(xì)胞內(nèi)液體的凍結(jié)和降低到足以引起精細(xì)胞脫水（Park等1992）。

6.1 細(xì)管凍精的解凍

近年來(lái)，綿羊細(xì)管冷凍精液的解凍溫度和時(shí)間變化很大，如Maxwell.W.M.C.et al（1994）直接將細(xì)管投入37℃水中60 s，而后吹出精液與37℃水浴鍋的試管中，檢查火力；Ingrid Olesenz（1993）直接把0.25 ml微細(xì)管放于70℃水浴中解凍8 s；澳大利亞西沃大學(xué)畜牧科學(xué)院介紹他們牧場(chǎng)的解凍方法：從液氮中取出細(xì)管，在37℃的水中搖動(dòng)4 s，剪開(kāi)一段，把精液吹入38℃的水浴鍋的容器內(nèi)，10 s后吸出0.1 ml進(jìn)行腹腔內(nèi)窺鏡輸精。Johnson等（1974）發(fā)現(xiàn)，69.5℃解凍有利于提高存活率，而慢速解凍（45.6℃）有利于保護(hù)精子頂體。

6.2 安瓿凍精和顆粒凍精解凍

綿羊安瓿凍精解凍較好的方案是慢速解凍（室溫下，15℃/ min）。也有報(bào)道說(shuō)安瓿解凍可在37℃的溫水中解凍，顆粒解凍可以在解凍液（濕解凍）或試管中（干解凍）。起初報(bào)道，濕解凍優(yōu)于干解凍，另一些研究中，30℃～45℃間存活率沒(méi)有太大差異，37℃下干解凍存活率高于45℃，60℃或75℃的濕解凍（Fukui，1979）。

7 結(jié)論

精液冷凍保存和輸精技術(shù)的掌握是關(guān)系到人工授精和胚胎移植技術(shù)的發(fā)展，關(guān)系到種公羊的利用和經(jīng)濟(jì)效益的提高的龍頭技術(shù)，只有牢固掌握稀釋液種類(lèi)及其成分及添加方法，冷凍保存濃度，凍前稀釋?zhuān)禍丶敖鈨鏊俣燃胺椒ê妥訉m深部輸精技術(shù)，才能將人工授精和胚胎移植技術(shù)推向發(fā)展。但是，目前凍精授精率還不盡如人意，這就需要我們深入研究其中的原因和采用好的冷凍輸精技術(shù)。

[1] 哈福，趙有璋.羊冷凍精液稀釋液中添加復(fù)合維生 素B提高凍精解凍后品質(zhì)的研究 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，（3）：17-19.

[2] Polge C，smith A U，Parkes，A S. Revival of spermatogoa after vitrification and dehydration at low temperature[J]. Nature，1949，（164）：666

[3] Mazur R C. The rule of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates[J]. Cryobiology，1977，（14）：251.

[4] Lopatko M I. Method of freezing ram semen at temperatures of ?83 or ?96℃（in Russian）[J]. Zhivotnovodstvo. 1962，（10）：86-88.

[5] Fiser P S. Faithfull R W. The effect of rapid cooling，cold shock of ram semen，photoperiod，and egg yolk in diluents on the survival of spermatozoa before and after freezing[J]. Cryobiology，1986，（23）：518-524.