ATLI患者遺傳易感性及新型生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

聶偉杰 劉家旗 張錦 孟存英

我國結(jié)核病負(fù)擔(dān)較重，抗結(jié)核治療過程中會出現(xiàn)各種不良反應(yīng)，其中以抗結(jié)核藥物性肝損傷最為多見，危害性也最大，也是我國藥物性肝損傷(ATLI)的常見原因之一，位居第二，僅次于中藥[1]。有諸多研究表明抗結(jié)核藥物性肝損傷(ATLI)的發(fā)生與性別、年齡、基礎(chǔ)疾病都有關(guān)，當(dāng)然與遺傳易感性也有密不可分的聯(lián)系，但遺傳易感性方面需要探索的方面仍有許多。診斷方面主要依靠RUCAM評分量表，RUCAM(Roussel Uclaf因果關(guān)系評估方法)是一種完善的診斷算法和標(biāo)準(zhǔn)，用于評估疑似藥物性肝損傷患者的因果關(guān)系[2]。該算法提供了肝臟損傷與可疑病例之間高度可能、可能、不可能或排除關(guān)系的定量因果關(guān)系分級，但其對病歷數(shù)據(jù)的完整性要求較高，且其為一種排除性診斷，因此以RUCAM為基礎(chǔ)的可能病例和極可能病例對于檢測新的生物標(biāo)志物、確認(rèn)新的診斷方法至關(guān)重要[3]。ATLI臨床分型、病情嚴(yán)重程度分級以及治療等方面研究比較清晰，本文主要對ATLI患者的基因多態(tài)性及RUCAM評分量表基礎(chǔ)上對診斷有意義的生物標(biāo)志物及其他診斷方法做一闡述，提高臨床對ATLI的認(rèn)知。

一、 ATLI患者的遺傳易感性

ATLI是抗結(jié)核過程中最常見、最嚴(yán)重的的并發(fā)癥，近年來越來越多的證據(jù)證明其與藥物代謝強(qiáng)度的遺傳多態(tài)性有關(guān)，遺傳多態(tài)性主要體現(xiàn)在一些與代謝有關(guān)的酶系及轉(zhuǎn)運(yùn)體。ATLI患者的遺傳易感性的探索有助于預(yù)測抗結(jié)核藥物發(fā)生肝損害的概率。

(一)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2) N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT 2)是一種重要的代謝酶，參與藥物代謝和解毒，基因多態(tài)性和DNA甲基化已被證明是影響NAT 2表達(dá)的關(guān)鍵因素[4]。有學(xué)者通過DNA測序來評估NAT2編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)NAT2*6A與AT-DILI易感性顯著相關(guān)，此外，結(jié)核患者和NAT2相關(guān)的慢乙?；颖硇突颊弑瓤焖俸椭虚g型乙酰化子表型患者更易發(fā)生ATLI[5]。與NAT2慢乙?；颖硇突颊呦啾龋阴；颖硇突颊吒装l(fā)生ATLI[6]。另有學(xué)者研究蒙古族ATLI患者，發(fā)現(xiàn)NAT2基因481(rs1799929)和590(rs1799930)的多態(tài)性和乙?；硇陀酗@著差異，慢乙?；虯TLI的發(fā)生率是快乙?；偷?.56倍[4]。與對照組相比，ATLI組CpG5、CpG10、CpG11.12和NAT2啟動子區(qū)總甲基化呈高甲基化狀態(tài)，但經(jīng)二元logistic回歸分析，慢乙?；?、中間乙?；涂焖僖阴；cATLI無關(guān)，因此NAT2基因啟動子區(qū)總甲基化是蒙古族ATLI患者的獨(dú)立影響因素[4]。遺傳多態(tài)性影響NAT2基因的表達(dá)速度，NAT2的慢乙?；癄顟B(tài)會增加ATLI發(fā)生的風(fēng)險。

(二)細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1) 細(xì)胞色素P 450 2E1是參與乙醇代謝的主要酶，其水平可能與藥物的氧化速率有關(guān)，可以通過自由基的產(chǎn)生損害肝細(xì)胞，基因多態(tài)性影響著P450 2E1的表達(dá)[7]。對于CYP2E1 RsaI/PstI多態(tài)性，在基于種族和抗結(jié)核藥物方案的亞組分析中，CYP2E1 RsaI/PstI c1/c1基因型肺結(jié)核患者患ATLI的風(fēng)險顯著增加[8]。

(三)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST) 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)作為藥物解毒機(jī)制中的重要保護(hù)作用，可能影響患者對抗結(jié)核藥物性肝損傷(ATLI)的易感性,GST分子基因多態(tài)性可引起酶分子結(jié)構(gòu)、功能和水平的改變。有學(xué)者進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)東亞人群中無GSTM1基因型與ATLI風(fēng)險增加相關(guān)。無GSTT1基因型增加了ATLI的風(fēng)險，尤以印度人最為突出。這項最新的薈萃分析強(qiáng)烈提示GSTM1和GSTT1多態(tài)性與ATLI的關(guān)聯(lián)[9]。GSTP1 rs1695和GST啟動子甲基化均與GSTP1基因的表達(dá)有關(guān)，可能與ATLI發(fā)生有關(guān)，rs1695和GSTP1的啟動子甲基化可能獨(dú)立地參與ATLI的發(fā)生[10]。

(四)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1) 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)是哺乳動物體內(nèi)一種重要的結(jié)合酶，負(fù)責(zé)內(nèi)源性和異生物化合物的結(jié)合和解毒[11]。其基因多態(tài)性影響著UGT1A1的表達(dá)，表達(dá)不足時會導(dǎo)致毒性物質(zhì)堆積，可能導(dǎo)致ATLI。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因rs4148323 A/A基因型能顯著降低ATLI的發(fā)病風(fēng)險，UGT1A1的ATG單倍型也降低了ATLI的風(fēng)險，因此UGT1A1基因多態(tài)性與ATLI易感性有關(guān)，易感基因的分子鑒定為預(yù)測肺結(jié)核患者ATLI的發(fā)生率和預(yù)測治療效果提供了理論基礎(chǔ)[12]。

(五)溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員1B1(SLCO1B1) 溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員1B1(SLCO1B1)主要表達(dá)于肝細(xì)胞的基底膜，對肝臟攝取和清除多種藥物底物和內(nèi)源性化合物至關(guān)重要。一般來說，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(SLCO1B1)是一個攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體的超家族，介導(dǎo)多種兩親性有機(jī)化合物(包括膽鹽、類固醇結(jié)合物、甲狀腺激素、陰離子肽、許多藥物和其他異物)的鈉無關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)。SLCO1B1是高度多態(tài)的，許多相關(guān)的和種族相關(guān)的多態(tài)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了功能表征[13]。SLCO1B1基因型rs4149034 G/A、rs1564370g/C、rs2900478 T/A患者發(fā)生ATDH的風(fēng)險顯著降低，而rs2417957t/T和rs4149063t/T基因型患者發(fā)生ATDH的風(fēng)險增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1的rs4148323 A/A基因型顯著降低了ATDH的風(fēng)險。單倍型分析顯示SLCO1B1的TGTG、TTTC和GTTC單倍型與ATDH風(fēng)險增加相關(guān)，而GACC單倍型與風(fēng)險降低相關(guān)[12]。

(六)NRF2、KEAP1、MAFF、MAFK基因多態(tài)性 抗結(jié)核藥物的活性代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致活性氧(ROS)過多，導(dǎo)致藥物性肝損傷。NRF2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受KEAP1、MAFF、MAFK調(diào)控，通過與抗氧化反應(yīng)元件ARE相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達(dá)[14]。以中國抗結(jié)核治療隊列為基礎(chǔ)，采用巢式病例對照研究，發(fā)現(xiàn)NRF2中攜帶TC基因型rs4243387或C-C單倍型(rs2001350-rs6726395)的患者發(fā)生ATLI的風(fēng)險增加，而攜帶rs2267373的TC基因型或MAFF中C-G-C單倍型(rs2267373-rs4444637-rs4821767)的患者ATLI風(fēng)險降低[14]。亞組分析還發(fā)現(xiàn)MAFF中rs4821767和rs4444637，MAFK中rs4720833與不同遺傳模型下肝損傷的具體臨床模式之間存在顯著相關(guān)性，研究表明NRF2、MAFF和MAFK基因多態(tài)性可能與中國抗結(jié)核治療人群對ATLI的易感性有關(guān)[14]。

(七)PXR和NF-κB1基因多態(tài)性 孕烷X受體(PXR)調(diào)節(jié)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)酶的表達(dá),NF-κB不僅通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)在肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)和損傷愈合過程中發(fā)揮作用，而且還可能調(diào)節(jié)PXR的轉(zhuǎn)錄[15]。有研究表明PXR中rs3814055的T等位基因與ATDILI風(fēng)險降低相關(guān)，NF-κB1中rs78872571和rs4647992的T等位基因與ATDILI風(fēng)險增加顯著相關(guān)，因此其基因多態(tài)性與ATLI的發(fā)生相關(guān)[15]。

(八)其他 還有相關(guān)報道表明轉(zhuǎn)化生長因子β1基因多態(tài)性、超氧岐化酶基因多態(tài)性等與ATLI發(fā)生相關(guān)，相關(guān)基因多態(tài)性的檢測為肺結(jié)核患者發(fā)生ATLI提供了重要的預(yù)測及預(yù)后價值。

二、ATLI新型生物標(biāo)志物

抗結(jié)核藥物性肝損傷診斷主要依靠RUCAM評分量表，但其主要是一種排除性診斷，有一定的局限性，對病例完整度要求高，因此找尋具有診斷價值及預(yù)后評估的方法刻不容緩，下面將進(jìn)一步闡述對ATLI有診斷價值的方法，進(jìn)一步提高臨床對ATLI的認(rèn)知。

(一)白細(xì)胞端粒長度 端粒是在線性染色體末端發(fā)現(xiàn)的核蛋白結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞衰老有關(guān)，隨著年齡的增長而縮短，與各種年齡相關(guān)的疾病有關(guān),端粒長度作為疾病和/或疾病易感性的臨床生物標(biāo)記物的有效性和實(shí)用性引起了人們的極大興趣[16]。有學(xué)者應(yīng)用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RTL)對100例年齡和性別健康對照組、49例ATLI肺結(jié)核患者和53例非ATLI肺結(jié)核患者的白細(xì)胞相對端粒長度(RTL)進(jìn)行了測定，與非ATLI患者相比，ATLI肺結(jié)核患者RTL明顯升高，RTL延長與ATLI易感性增加顯著相關(guān)[17]。多元線性回歸分析顯示，RTL的增加與抗結(jié)核治療后60 d內(nèi)評估的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的升高獨(dú)立相關(guān)[17]。Kaplan-Meier曲線分析表明，RTL時間越長，肺結(jié)核患者肝毒性發(fā)生率越高。受試者操作特征曲線分析揭示了RTL作為ATLI進(jìn)展新指標(biāo)的診斷準(zhǔn)確性，該指標(biāo)比傳統(tǒng)肝臟生物標(biāo)志物(包括抗結(jié)核治療后7 d內(nèi)測定的轉(zhuǎn)氨酶活性)具有更高的敏感性和特異性,白細(xì)胞中異常的RTL反映了抗結(jié)核藥物引起的肝毒性，可能是ATLI早期進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物[17]。

(二)人白細(xì)胞抗原B和人白細(xì)胞抗原DQB1聯(lián)合5-羥甲基胞嘧啶 DNA甲基化被認(rèn)為是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方法，它參與了許多生物學(xué)和病理過程，甲基群加在胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶，5-mC)的5碳位上，是最清楚的表觀遺傳機(jī)制之一[18]。有學(xué)者采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測外周血白細(xì)胞DNA中5-mC和5-hmC的含量，單因素分析HLA-B和HLA-DQB1的5-mC和5-hmC含量與ADLI顯著相關(guān)，受試者操作特性(ROC)分析表明，HLA-B和HLA-DQB1的5-hmC含量均高于5-mC含量。HLA-B和HLA-DQB1聯(lián)合5-hmC水平是診斷ATLI的最佳指標(biāo)，靈敏度和特異度均較高，可以作為ATLI患者的診斷指標(biāo)[19]。

(三)MicroRNAs(miRNAs) microRNAs是一類小的單鏈內(nèi)源性高度保守的非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化、腫瘤轉(zhuǎn)化和細(xì)胞再生等多種細(xì)胞生理事件中起著重要的調(diào)控作用，眾多研究發(fā)現(xiàn)證明了microRNAs表達(dá)與許多疾病的發(fā)展密切相關(guān)，表明microRNAs作為臨床生物標(biāo)志物和藥物發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)的重要性[20]。目前生物標(biāo)志物ALT/AST、ALP和TBil為DILI的診斷提供了一種無創(chuàng)的診斷工具，在疾病診斷中發(fā)揮著重要作用，但這些生物標(biāo)記物的升高也見于一般性肝損傷，在肝損傷中只有進(jìn)展后才會升高和檢測到，miR-122與ALT/AST相比，作為早期預(yù)測因子具有更高的靈敏度和特異度[21]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)隨著INH誘導(dǎo)肝損傷時間的延長，組織miR-122的表達(dá)水平在0.25 h(即INH的峰值濃度時間)明顯低于對照組。其變化較血清轉(zhuǎn)氨酶和miR-155變化快，0.75 h時顯著升高，且病理評分與miR-122/miR-155比值相關(guān)，因此miR-122/155比值可作為ATLI的敏感生物標(biāo)志物，有助于抗結(jié)核治療后患者的早期診斷[22]。

(四)鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT) OCT是一種同三聚體線粒體酶，這種進(jìn)化上保守的酶主要在肝臟和小腸中表達(dá)，與尿素代謝有關(guān)，據(jù)報道可以作為肝臟損傷的生物標(biāo)志物[23]。所有受試藥物均能觀察到肝細(xì)胞損傷后OCT的釋放，OCT的釋放動力學(xué)明顯大于ALT，與ALT不同，OCT的最大釋放水平因受試藥物而異，這些獨(dú)特的釋放特性突出了OCT可以提供一種有前途的DILI生物標(biāo)記物的可能性，這不僅有助于提高診斷準(zhǔn)確性，而且有助于更好地了解臨床和藥物開發(fā)環(huán)境中的毒性類型[24]。

(五)嗜酸性粒細(xì)胞參數(shù) 在DILI患者中，在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)升高之前觀察到平均嗜酸性粒細(xì)胞體積(MEV)和大小變異性(MEV-SD)的增加,治療后MEV與ALT呈正相關(guān),ROC曲線分析顯示，與其他參數(shù)相比，MEV和MEV-SD曲線下面積較大,診斷靈敏度和特異度均高于DILI發(fā)生前的其他參數(shù)[25]。

綜上，抗結(jié)核藥物性肝損傷的基因多態(tài)性為ATLI的發(fā)生率和預(yù)測治療效果提供了理論基礎(chǔ)，新型診斷方法有助于完善ATLI的診斷。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)、細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)、溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員1B1(SLCO1B1)、NRF2、KEAP1、MAFF、MAFK基因多態(tài)性、PXR和NF-κB1基因多態(tài)性等均有依據(jù)證實(shí)與ATLI的發(fā)生有關(guān)。白細(xì)胞端粒長度、人白細(xì)胞抗原B和人白細(xì)胞抗原DQB1聯(lián)合5-羥甲基胞嘧啶、MicroRNAs(miRNAs)、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)、嗜酸性粒細(xì)胞VCS參數(shù)等均可作為有價值的生物標(biāo)志物來診斷ATLI，但目前尚未廣泛應(yīng)用于臨床?；蚨鄳B(tài)性及新型檢測方法需要進(jìn)一步探索，為臨床提供更加全面的認(rèn)識。