胡蔓藤內(nèi)生真菌分離鑒定及抗菌活性研究*

王 嫚 吳智楠 周天賜 李佩琪 劉春梅 周 迪 林 潔**

（1 江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省生物功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇南京 210013 2 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200241）

人們已從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具有各種生物活性的化合物，包括鎮(zhèn)痛藥物阿司匹林、抗癌藥物紫杉醇和長春新堿等，目前，已上市的小分子新藥化學(xué)實(shí)體中有63%源自天然產(chǎn)物。而微生物因其數(shù)量大、種類多，成為藥物研發(fā)的優(yōu)質(zhì)材料。其中從藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌，往往能產(chǎn)生不同于常規(guī)環(huán)境中的生存策略，其代謝或防御系統(tǒng)常常特別發(fā)達(dá)，成為藥物發(fā)現(xiàn)的優(yōu)質(zhì)來源，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型多、結(jié)構(gòu)新穎、活性廣泛的次生代謝產(chǎn)物。我國已發(fā)現(xiàn)3 萬多種高等植物，其中藥用植物11 000 多種，而研究過內(nèi)生真菌的藥用植物僅有21 科44 屬62種2 變種，相對于我國豐富的藥用植物資源，內(nèi)生真菌活性及化學(xué)成分的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此，藥用植物內(nèi)生真菌極具研究價值。

胡蔓藤又名鉤吻，是馬錢科（Loganiaceae）胡蔓藤屬（Gelsemium）植物，因其劇毒性而聞名。該屬植物目前世界上共發(fā)現(xiàn)3 種，分別為分布于美洲國家［1-3］的常綠鉤吻（G.sempervirensArt.）、沼澤茉莉（G.rankiniiSmall.）及主要分布在我國福建、廣西等南部地區(qū)和東南亞地區(qū)的胡蔓藤（G.elegansBenth.）。胡蔓藤植物為常綠木質(zhì)藤本，小枝呈圓柱形，幼時具縱棱；葉片為膜質(zhì)，形狀多為卵形、卵狀長圓形或卵狀披針形；苞片邊緣和花梗除幼時被毛外，全株均無毛；種子呈扁壓狀橢圓形或腎形，邊緣具有不規(guī)則齒裂狀膜質(zhì)翅。胡蔓藤屬植物一般5—11月開花，7月至翌年3月結(jié)果。多生于海拔500～2 000 m 山地路旁灌木叢中或潮濕肥沃的丘陵山坡疏林下［4］。我國胡蔓藤的研究歷史悠久，《本草綱目》中對于胡蔓藤的描述為“主金瘡、乳癰、中惡風(fēng)、咳逆上氣，鬼痊蠱毒”。我國民間因其毒性大，一直以外用為主，能祛風(fēng)、消腫拔毒、殺蟲止癢；而對豬反而有驅(qū)蟲、止喘、鎮(zhèn)靜、催肥和免疫作用，因此，民間稱其“人的毒藥，豬的人參”［5］。20世紀(jì)60年代，在福建閩南地區(qū)有民眾用胡蔓藤燒灰干粉口服治療胃癌和肝癌，均取得一定療效，其藥理活性開始引起關(guān)注。1930年左右，研究人員對胡蔓藤先后進(jìn)行了毒理和藥理學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等研究［1］。藥理活性顯示，胡蔓藤具有免疫、鎮(zhèn)痛、促造血、抗心律失常、抗炎和禽畜復(fù)壯等多種活性，對肝癌細(xì)胞（Bel-7402 和HepG2）、肺癌細(xì)胞（A549）、結(jié)腸癌細(xì)胞（HGC-27）和宮頸癌細(xì)胞（Hela）具有明顯的抑制增殖作用［6］。

調(diào)查統(tǒng)計(jì)表明，至今研究者已從胡蔓藤屬植物中分離出生物堿、萜類和甾體等成分，而該屬植物最為人廣知的主要成分是其中的生物堿。研究者從該屬植物中共分離得到50 余種生物堿，根據(jù)其的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為六大類：薩杷晉堿Sarpagine型、鉤吻素子Koumine 型、胡蔓藤堿乙Humantenine 型、11-去甲氧基鉤吻素乙Gelsedine 型、鉤吻素甲Gelsemine 型、育亨烷Yohimbane 型。這些生物堿在結(jié)構(gòu)上都含有一個吲哚或氧化吲哚母核結(jié)構(gòu)，具有多個手性中心和復(fù)雜的籠狀結(jié)構(gòu)［1，6-7］。

2015年Liu 等［8］首次從胡蔓藤內(nèi)生真菌Guignardia mangiferae中發(fā)現(xiàn)3 個倍半萜和1 個聚酮類新結(jié)構(gòu)化合物，與胡蔓藤植物中的多種生物堿的藥理活性類似，均對脂多糖誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞炎性反應(yīng)有強(qiáng)抑制作用（IC50：4.2～15.2 μmol／L）。除此之外，未見其他有關(guān)胡蔓藤內(nèi)生真菌研究的報道。本實(shí)驗(yàn)以藥用植物胡蔓藤為實(shí)驗(yàn)材料，對其內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行種屬鑒定，并系統(tǒng)性地分析了胡蔓藤植物根、莖、葉和花這4 個部位中內(nèi)生真菌的多樣性，并以革蘭氏陽性細(xì)菌代表金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和革蘭氏陰性細(xì)菌代表大腸桿菌Escherichia coli.為指示菌，通過紙片法進(jìn)行抑菌活性測試，該研究豐富了藥用植物胡蔓藤內(nèi)生真菌資源，并為進(jìn)一步開發(fā)利用胡蔓藤內(nèi)生真菌資源提供參考依據(jù)［9-10］。

1 材料

1.1 儀器與試劑

儀器：超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高壓滅菌鍋（南京博惠科學(xué)儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海鴻都電子科技有限公司）、PCR 擴(kuò)增儀（Biorad）、臺式超速離心機(jī)（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）、三恒多用電泳儀（北京市六一儀器廠）。

試劑：75%乙醇、次氯酸鈉溶液、DNA Marker（DL 2000）、50×TAE、電泳緩沖液、2×PCR Master-Mix、引物ITS4 和ITS5、Loading Buffer、核酸染料。

1.2 植物材料 植物樣品采集自廣西的新鮮胡蔓藤植株，選擇其根、莖、葉、花4 個部位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)暨南大學(xué)高昊教授鑒定為胡蔓藤。

1.3 培養(yǎng)基

1）分離純化培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：46.0 g PDA 粉末溶于1 L 蒸餾水中，邊加熱邊攪拌至其完全溶解，混勻后，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

2）抑菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：稱取3.0 g 牛肉膏、10.0 g 蛋白胨、5.0 g NaCl，置于1 L蒸餾水中，并加入20 g 瓊脂粉，攪拌均勻，并將pH 值調(diào)至7.4～7.6，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

3）營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基：稱取18 g 營養(yǎng)肉湯干粉置于1 L 蒸餾水中，攪拌均勻，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

1.4 供試菌種 測試菌株為采購自上海魯微科技有限公司的大腸桿菌（ATCC25922）及金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分離純化內(nèi)生真菌 使用蒸餾水將胡蔓藤植物表面污垢沖洗干凈。將根、莖、葉、花進(jìn)行粗剪。在超凈工作臺中進(jìn)行植物組織表面的消毒（用75%的乙醇浸泡30 s；無菌水漂洗3 次，每次1 min；用次氯酸鈉浸泡1 min；再次用無菌水漂洗3 次，每次1 min），最后用無菌濾紙吸干表面水分備用［11］。為檢測材料表面滅菌的效果是否徹底，將最后一次漂洗組織的無菌水，取適量涂布于PDA 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)基表面無菌落長出，則代表滅菌徹底。將表面徹底滅菌的根、莖、葉、花在超凈工作臺用無菌刀片切割成0.5 cm×0.5 cm 的小塊。用無菌鑷子將其分別平鋪于PDA 固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)至樣品邊緣菌絲長出，之后反復(fù)挑取菌絲，直至最終獲得純種菌株，并將其轉(zhuǎn)接到PDA 斜面，待其長滿斜面，保存至4℃冰箱備用［12-13］。

2.2 內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定 將固體培養(yǎng)基制成平板，以點(diǎn)植法進(jìn)行接種，即用接種針尖挑取菌絲尖端點(diǎn)植于PDA 平板的中心，然后于25～28℃避光培養(yǎng)一定時間（通常為7～10 d）進(jìn)行觀察，大小以菌落的直徑（mm）表示。觀察的要點(diǎn)包括：菌落的顏色、菌落表面的紋飾、菌落的質(zhì)地、菌落的高度、菌落邊緣、是否有滲出物等，并進(jìn)行記錄。取一小段細(xì)致不粗糙且粘性好的膠帶，從菌落表面的中心向邊緣粘，用濃度為75%的乙醇進(jìn)行固定，選擇乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，對其進(jìn)行染色，將粘有菌絲的一面向上，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，參考《真菌鑒別手冊》進(jìn)行鑒別［14］。

2.3 分子生物學(xué)方法鑒定內(nèi)生真菌 首先進(jìn)行胡蔓藤內(nèi)生真菌的基因組DNA 提取，將其作為PCR 擴(kuò)增模板。真菌DNA 的提取采用CTAB 法（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化銨）［15］。

利用PCR 技術(shù)對所提取的真菌rDNA ITS 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，選用的引物為ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸45 s，30 個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳凝膠置于凝膠成像儀中，在紫外光下觀察條帶位置。將確定擴(kuò)增成功的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司，進(jìn)行測序。所得到的序列進(jìn)入NCBI 數(shù)據(jù)庫，通過BLAST 搜索相似性的序列，并將這些序列相似性高的菌株序列，用 軟 件ClustalX 1.8 進(jìn)行多序列比對分析［9，16］，再將這些相似的序列導(dǎo)入軟件MEGA5.10 中進(jìn)行同源性分析，從而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（算法：Neighbor-Joining，進(jìn)化距離計(jì)算模型：Kimura 2，置信度檢測：bootstrap，自展次數(shù)：1 000 次）［17-18］。

2.4 內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)的計(jì)算 內(nèi)生真菌群落的多樣性分析主要采用Shannon-Weiner 公式：H′=－∑PilnPi，其中Pi代表胡蔓藤中某種內(nèi)生真菌分離得到的數(shù)量占總真菌數(shù)量的百分比［9］。

2.5 內(nèi)生真菌抗菌性篩選 在無菌的操作環(huán)境下，用接菌環(huán)挑取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為測驗(yàn)菌株，接種至營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，放置于搖床中35℃，200 r／min 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5 d。將普通濾紙片用打孔器打成直徑為6 mm 的圓形濾紙片，放置于培養(yǎng)皿中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min 備用［19］。用移液器分別吸取200 μL 菌懸液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻。配制好100 mg／mL 菌提取物的萃取液，分別吸取5 μL液體轉(zhuǎn)接至6 mm 的圓形濾紙片上制成藥敏片自然晾干。用無菌鑷子夾取制備好的藥敏片平貼于含菌平板上，每組3 個重復(fù)，28℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小。選擇100 mg／mL 青霉素鈉與恩諾沙星溶液作為該實(shí)驗(yàn)的陽性對照［20］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果 從新鮮采取胡蔓藤的根、莖、葉和花中分離純化得到60 株菌株，從宏觀菌落形態(tài)及顯微形態(tài)（圖1）鑒定并去重后，獲得30 株不同菌株。對此30 株菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定（表1），共17 個種，來自于7 目、7 科、9 屬。60 株內(nèi)生真菌中，在根中分離得到15 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的25%，鑒定為4 屬、5 個種，分別為木霉屬Trichoderma spirale，節(jié)菱孢屬Arthriniumsp.、Arthrinium saccharicola，枝孢屬Cladosporiumsp.，鏈格孢屬Alternaria alternat。莖中分離得到26株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的43%，鑒定為7 屬、11個種，包括間座殼屬Diaporthe eres，刺盤孢屬Colletotrichum gloeosporioides，節(jié)菱孢屬Arthrinium saccharicola，枝孢屬Cladosporiumsp.，鏈格孢屬Alternaria alternata、Alternaria burnsii、Alternaria brassicicola、Alternariasp.YXM4，平臍蠕孢屬Bipolaris setariae，青霉屬Penicillium citrinum、Penicilliumsp.YL201。葉中分離得到18 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的30%，鑒定為5 屬、7 個種，分別為刺盤孢屬Colletotrichum siamense、Colletotrichum gloeosporioides，小叢殼屬Glomerellasp.R207，節(jié)菱孢屬Arthrinium saccharicola，枝孢屬Cladosporiumsp.，鏈格孢屬Alternaria alternata、Alternariasp.YXM4。花中分離得到1 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的2%，鑒定為間座殼屬Diaporthesp.。鏈格孢屬Alternaria的菌株共有18 株，占總菌株數(shù)的30%，節(jié)菱孢屬Arthrinium有12 株，占總菌株數(shù)的20%，這2 個屬內(nèi)生真菌為胡蔓藤優(yōu)勢屬內(nèi)生真菌。計(jì)算胡蔓藤根、莖、葉、花中內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)分別為1.494、2.266、1.798、0。莖明顯高于根、葉、花。其中，根、莖和葉中均存在的菌株為枝孢屬Cladosporiumsp.、互生鏈格孢Alternaria alternata，僅存在于根中的內(nèi)生真菌為木霉屬Trichoderma spirale，節(jié)菱孢屬Arthriniumsp.、Arthrinium arundinis，僅存在于莖中的內(nèi)生真菌有間座殼屬Diaporthe eres，鏈格孢屬Alternaria burnsii、Alternaria brassicicola，平臍蠕孢屬Bipolaris setariae，青霉屬Penicillium citrinum、Penicilliumsp.YL201，僅在葉中分離得到的內(nèi)生真菌為刺盤孢屬Colletotrichum siamense、小叢殼屬Glomerellasp.R207，僅在花中分離得到的內(nèi)生真菌為間座殼屬Diaporthesp.（表2）。

表1 胡蔓藤內(nèi)生真菌ITS 序列鑒定結(jié)果

表2 胡蔓藤不同部位不同內(nèi)生真菌數(shù)量

圖1 內(nèi)生真菌WM-11 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)圖

3.2 內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果 在鑒定出的17 種胡蔓藤內(nèi)生真菌中，能對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗性的菌株有14 種，占內(nèi)生真菌總數(shù)的82%，能對大腸桿菌產(chǎn)生抗性的菌株有12 種，約占內(nèi)生真菌總數(shù)的71%（表3）?？菇瘘S色葡萄球菌的陽性對照抑菌直徑為（36.57±0.05）mm，抗大腸桿菌的陽性對照抑菌直徑為（33.03±0.37）mm。相比于對照組，胡蔓藤內(nèi)生真菌中，對金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著的有WM-12（Alternaria burnsii）抑菌直徑為（21.53±0.39）mm、WM-3（Colletotrichum siamense）抑菌直徑為（19.43±0.33）mm、WM-14（Alternariasp.YXM4）抑菌直徑為（16.60±0.04）mm。對大腸桿菌抑菌效果顯著的有WM-14（Alternariasp.YXM4）抑菌直徑為（17.83±0.24）mm、WM-3（Colletotrichum siamense）抑菌直徑為（14.03±0.12）mm。對2 種指示菌都有抑制效果的共有11 種，占總菌種數(shù)的65%（表3、圖2）。

表3 胡蔓藤內(nèi)生真菌抗菌活性

圖2 胡蔓藤內(nèi)生真菌抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性對比圖（均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

4 討論

圖3 抑菌效果

本實(shí)驗(yàn)從胡蔓藤根、莖、葉和花中分離純化得到60 株菌種，共17 個種，來自于7 目、7 科、9屬，包括間座殼屬、刺盤孢屬、小叢殼屬、木霉屬、節(jié)菱孢屬、枝孢屬、鏈格孢屬、平臍蠕孢屬和青霉屬，其中，鏈格孢屬與節(jié)菱孢屬為優(yōu)勢屬。在分離得到的胡蔓藤內(nèi)生真菌中，對金黃色葡萄球菌起抗性的菌株有14 種，約占內(nèi)生真菌總數(shù)的82%，對大腸桿菌起抗性的菌株有12 種，約占內(nèi)生真菌總數(shù)的71%，此研究結(jié)果表明來自于新鮮的胡蔓藤植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌活性較強(qiáng)，并且存在許多迫切需要開發(fā)的有價值的化學(xué)成分。在本實(shí)驗(yàn)分離得到的17 種真菌中，間座殼屬、刺盤孢屬、小叢殼屬、節(jié)菱孢屬、枝孢屬、鏈格孢屬、平臍蠕孢屬中多為植物病原菌，而木霉屬的真菌可寄生于多種植物病原菌。胡蔓藤的真菌報道較少，本研究為胡蔓藤內(nèi)生真菌的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。一直以來，胡蔓藤藥理研究多集中在腫瘤細(xì)胞毒活性，對于其抗菌活性未曾報道。通過對來自于胡蔓藤植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌抑菌性探究發(fā)現(xiàn)，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌2 種指示菌均有抑制效果的菌株共有11 種，約占總菌種數(shù)的65%，這些有價值的內(nèi)生真菌屬于廣譜抗菌活性菌種。內(nèi)生真菌在其生活過程中，往往會產(chǎn)生和其宿主類似的化學(xué)成分，這也提示藥用植物胡蔓藤具有抗菌活性的研究價值，值得進(jìn)一步深入研究。