浙江省主栽水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)

沈浙南 邱結(jié)華 解軍輝 時(shí)煥斌 寇艷君*

（1 中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州311400；2 三峽大學(xué)生命科學(xué)院，武漢430000；#共同第一作者；*通訊作者：kouyanjun@caas.cn）

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae/Piricularia oryzae）引起的真菌性病害，世界各稻區(qū)均有發(fā)生，一般導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重的甚至顆粒無(wú)收[1]。田間稻瘟病菌菌群毒力的多變性導(dǎo)致生產(chǎn)上推廣使用的抗病品種常因發(fā)病嚴(yán)重而淘汰[2]。目前生產(chǎn)上對(duì)稻瘟病的防治主要有化學(xué)防治和抗病育種，培育抗病新品種是最綠色經(jīng)濟(jì)的方法[3]。

近年來(lái)，通過(guò)圖位克隆等手段在水稻中鑒定了100 多個(gè)抗稻瘟病基因，其中36 個(gè)已被克隆[4]。這些水稻抗稻瘟病基因分布在除第3 染色體外的所有染色體上，在第6、11 和12 染色體上存在較多的抗稻瘟病基因簇。目前，大部分克隆的抗稻瘟病基因均有特異的分子檢測(cè)標(biāo)記[5]。這些分子檢測(cè)標(biāo)記的開(kāi)發(fā)為水稻抗病分子育種奠定了良好基礎(chǔ)。育種家結(jié)合分子檢測(cè)標(biāo)記可以快速鑒定水稻品種抗稻瘟病基因型，有效輔助抗病新品種的選育。黃乾龍等[6]利用 Pi2、Pi5、Pi9、Pikh、Pita、Pikm 和Pib 等7 個(gè)抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記對(duì)重慶73 個(gè)水稻骨干品種的抗病基因進(jìn)行鑒定，解析這7 個(gè)抗病基因在水稻抗稻瘟病育種中的作用。陸展華等[7]利用 Pi1、Pi2、Pi9、Pib 和 Pita 等 5 個(gè)主效抗病基因的分子標(biāo)記，結(jié)合葉瘟和穗瘟的抗性鑒定，對(duì)廣東省70 個(gè)主栽品種抗稻瘟病基因的組成進(jìn)行了解析。張文龍等[8]通過(guò)分子標(biāo)記分析了云南省地方水稻品種稻瘟病抗性與抗稻瘟基因型的相關(guān)性，為云南省抗稻瘟病品種的選育提供了重要參考。這些研究表明，分子檢測(cè)標(biāo)記正逐步被育種家使用，為稻瘟病抗性育種提供了重要的輔助工具。

本研究在人工接種稻瘟病抗性鑒定的基礎(chǔ)上，利用 Pi1、Pi5、Pi2、Pi9、Pia、Pizt、Pigm、Pib、Pik 和 Pikh 等 7個(gè)主效抗稻瘟病基因分子檢測(cè)標(biāo)記，對(duì)63 個(gè)浙江省主栽水稻品種的稻瘟病抗性進(jìn)行綜合分析，旨在明確浙江主栽品種的抗病基因型，并初步探討了稻瘟病抗病基因的基因型與稻瘟病抗性之間的相關(guān)性，為浙江省水稻抗稻瘟病品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取浙江省63 個(gè)水稻主栽品種為材料，其中，秈稻類(lèi)型品種24 個(gè)、粳稻類(lèi)型30 個(gè)、秈粳交類(lèi)型9 個(gè)（表1），由中國(guó)水稻研究所黃世文研究員提供。感病對(duì)照品種為麗江新團(tuán)黑谷和CO39，麗江新團(tuán)黑谷由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供，CO39 為本實(shí)驗(yàn)室保存的品種。

1.2 稻瘟病菌的培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將浙江省稻區(qū)分離的9 個(gè)保存菌株（由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）[9]接種至PA 培養(yǎng)基（酵母提取物1 g/L，乳糖2.5 g/L，蔗糖2.5 g/L，酸梅汁40 mL/L，瓊脂粉20 g/L，調(diào)pH 至6.5），置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)活化3 d 左右?；罨瓿珊蠼臃N到燕麥培養(yǎng)基（燕麥40 g/L，番茄汁150 mL/L，瓊脂粉 20 g/L）。在 28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。用滅菌水去除表面的菌絲，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)產(chǎn)孢2 d 后，用含0.2% Tween 20 的蒸餾水洗孢子，配制成5×105個(gè)孢子/mL 的孢子懸浮液用于噴霧接種和注射接種。

1.3 品種稻瘟病抗性鑒定

1.3.1 葉瘟的鑒定

參試水稻品種種子用抗菌素402 浸種2 d 后，放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，完成催芽后播種于育秧盤(pán)內(nèi)，每個(gè)品種播種5~10 粒。待秧苗長(zhǎng)至4 葉期時(shí)進(jìn)行噴霧接種，接種后用PVC 膜密封保持濕度，黑暗培養(yǎng)24 h 后恢復(fù)光照，置于22℃條件下培養(yǎng)7 d 后調(diào)查發(fā)病情況。按國(guó)際水稻研究所（IRRI）0~9 級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（0 級(jí)，無(wú)病；1 級(jí)，抗；3 級(jí)，中抗；5 級(jí)，中感；7級(jí)，感；9 級(jí)，高感）記載葉瘟。

1.3.2 穗頸瘟的鑒定

參考李湘民等穗瘟接種方法[10]，用醫(yī)用注射器將0.5 mL 孢子懸浮液注入稻苞內(nèi)，每穗接1 次。接種20 d后開(kāi)始調(diào)查穗瘟發(fā)病情況，按國(guó)際水稻研究所0~9 級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)同葉瘟）記載穗瘟。

1.4 分子標(biāo)記檢測(cè)

CTAB 法提取水稻品種DNA：首先在2.0 mL 的離心管中，加入剪碎的水稻葉片，加入800 μL 的CTAB提取液，加入鋼珠，放入植物組織破碎儀中60 Hz 研磨60 s，65℃水浴 30 min，每隔 10 min 上下顛倒混合，65℃水浴后取出室溫冷卻，加入等體積的氯仿，12 000 rpm離心10 min，吸取700 μL 的上清液于新的1.5 mL 的離心管中，加入2 倍體積的無(wú)水乙醇，－20℃放置30 min，12 000 rpm 離心10 min，去上清，倒置于吸水紙上，室溫干燥過(guò)夜，加150 μL 去離子水，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴(kuò)增：抗稻瘟病基因分子選擇標(biāo)記引物見(jiàn)表1，引物由杭州有康生物公司合成，PCR 反應(yīng)體系采用20 μL，其中 2×Mix 10 μL、F/R 引物各 1 μL、DNA 模板1 μL，加水 7.5 μL 補(bǔ)齊。PCR 程序?yàn)?95℃/3 min 預(yù)變性，94℃/30 s、55℃/45 s、72℃/30 s，35 個(gè)循環(huán)，后 72℃條件下5 min。

電泳檢測(cè)：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖凝膠電泳，180 V 電泳45 min，伯樂(lè)凝膠成像儀拍照記錄，基因型條帶信息記錄在Excel 中。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.2 和Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析采用SAS 程序corr，遺傳聚類(lèi)采用SAS 程序cluster，采用類(lèi)平均法得到聚類(lèi)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻品種對(duì)稻瘟病的抗性分析

本研究通過(guò)室內(nèi)苗期和田間穗期人工接種，對(duì)浙江省63 個(gè)主栽品種進(jìn)行稻瘟病抗性分析。結(jié)果（表2）顯示，抗葉瘟品種42 個(gè)（占比66.7%）、感葉瘟品種21個(gè)，其中，高抗品種12 個(gè)、抗病品種28 個(gè)及中抗品種2 個(gè)；抗穗瘟病品種32 個(gè)（占比50.8%）、感病品種31個(gè)，其中高抗品種4 個(gè)、抗病品種13 個(gè)及中抗品種15個(gè)。這些結(jié)果顯示，浙江省主栽品種整體對(duì)葉瘟抗性良好，但穗瘟抗性有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.2 水稻品種的抗稻瘟基因型鑒定

利用表1 中的特異引物對(duì)63 個(gè)水稻品種進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明，參試的63 個(gè)水稻品種中，檢測(cè)到6個(gè)抗病基因的品種2 個(gè)，檢測(cè)到5 個(gè)抗病基因的品種12 個(gè)，檢測(cè)到4 個(gè)抗病基因的品種20 個(gè)，檢測(cè)到3 個(gè)抗病基因的品種18 個(gè)，只含有1 個(gè)抗病基因的品種1個(gè)，此外，有2 個(gè)品種未檢測(cè)到本研究中的抗病基因（表2）。在63 個(gè)水稻品種中，分布頻率最高的基因是Pizt 和Pib，有45 個(gè)水稻品種鑒定到Pizt 和Pib 基因，有43 個(gè)水稻品種鑒定到Pi2 和Pi5 基因，鑒定到Pikh、Pia、Pi1 及 Pik 的水稻品種分別有 41、37、32 和 30 個(gè)，分布頻率最低的基因是Pigm 和Pi9，均只有2 個(gè)品種鑒定到。這些鑒定結(jié)果說(shuō)明，浙江省主栽品種中Pizt、Pib、Pikh、Pia、Pi1 和 Pik 抗病基因利用頻率高，而 Pigm和Pi9 利用頻率低。

表1 本研究所用到的引物信息

表2 63 個(gè)水稻品種抗稻瘟病基因檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2

2.3 抗稻瘟病基因間的相關(guān)性分析

對(duì)浙江省63 個(gè)主栽品種抗性表型和10 個(gè)抗稻瘟病基因之間的相關(guān)性分析顯示，品種的葉瘟抗性和穗瘟抗性之間相關(guān)系數(shù)為0.255，達(dá)到顯著水平（P=0.046）（表3）。葉瘟抗性與Pi1 和Pib 基因之間的相關(guān)性系數(shù)分別為0.302 和0.610，達(dá)到顯著水平。穗瘟抗性與Pi9、Pi1 及Pia 基因之間相關(guān)性達(dá)到顯著水平，穗瘟抗性與Pib 基因相關(guān)系數(shù)為0.493，達(dá)到極顯著水平（P<0.001）。結(jié)果說(shuō)明浙江省主栽品種中Pi1 和Pib 基因在葉瘟和穗瘟抗性過(guò)程中起著重要作用。

表3 抗性反應(yīng)與抗病基因以及抗病基因之間的相關(guān)性

在 10 個(gè)抗稻瘟基因之間，Pigm 與 Pib、Pizt 與 Pi2、Pizt 與 Pi1、Pi1 與 Pib、Pikh 與 Pib 之間的相關(guān)性極顯著，Pi1 與Pik 相關(guān)性顯著。Pi1 和Pib 多與其他抗病基因的相關(guān)性達(dá)到顯著及以上水平（表3），說(shuō)明Pi1 和Pib 抗病基因與其他基因一起聚合對(duì)水稻抗病育種具有重要作用。

2.4 抗病基因間的遺傳聚類(lèi)分析

對(duì)浙江省63 個(gè)主栽品種的葉瘟指數(shù)、穗瘟指數(shù)和10 個(gè)抗稻瘟基因的聚類(lèi)分析顯示，在分類(lèi)距離為1 時(shí)可以將63 個(gè)水稻品種分出3 大類(lèi)：JD036 和JD048 為一類(lèi)，JD052 和JD062 為一類(lèi)，其余為一類(lèi)，在分類(lèi)距離0.9~1 之間又可以將第三大類(lèi)細(xì)分為三類(lèi)（圖1）。通過(guò)聚類(lèi)分析所分出的類(lèi)群中，同一類(lèi)群中的品種抗性類(lèi)似。這為以后品種改良選擇提供了方向，同類(lèi)中的基因重組有利于水平抗性的提高，類(lèi)群外的基因重組可以提高廣譜抗稻瘟病性。

2.5 抗病基因的頻率分布

不同抗病基因在秈稻和粳稻兩類(lèi)材料中分布存在差異（圖 2）?？共』?Pia、Pik、Pi1、Pi2、Pizt、Pikh、Pi5及Pib 在浙江省主栽品種中分布頻率整體分布較高，而Pigm 和Pi9 分布頻率分布較低。在38 個(gè)粳稻材料中，Pib 的頻率分布最大為 0.76，其次是 Pia、Pik、Pi1、Pi2、Pizt、Pikh、Pi5、Pi9 和 Pigm，分布頻率分別為 0.66、0.55、0.47、0.29、0.26、0.13、0.05 和 0.03。在 25 個(gè)秈稻材料中，分布頻率最大的也是Pib 為0.64，其次是Pi5、Pia、Pikh、Pi1、Pik、Pizt、Pi2 和 Pigm，分布頻率分別為0.60、0.48、0.44、0.36、0.32、0.32 和 0.04。Pi9 在秈稻分布頻率為0。抗病基因Pi5 和Pikh 在秈稻和粳稻中分布頻率差異較大。

3 討論

稻瘟病在水稻的不同生育時(shí)期、不同部位均可以侵染，其中，穗瘟對(duì)水稻產(chǎn)量威脅最大。葉瘟可以作為指標(biāo)之一來(lái)預(yù)測(cè)穗瘟的發(fā)生，對(duì)防治穗瘟發(fā)生具有指導(dǎo)意義。本研究對(duì)63 個(gè)水稻品種的葉瘟和穗瘟進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)葉瘟和穗瘟間存在顯著的相關(guān)性。葉瘟和穗瘟抗性反應(yīng)一致的材料占比達(dá)70%（表2）。張品輝等[17]利用貴州麻江縣10 年葉瘟和穗瘟的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，葉瘟和穗瘟存在極顯著水平的回歸關(guān)系。陳福如等[18]用人工接種研究葉瘟與穗瘟的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，葉瘟和穗瘟的抗性存在一定的正相關(guān)性。這些結(jié)果表明，一定程度上可以用室溫人工鑒定的葉瘟結(jié)果來(lái)預(yù)測(cè)田間穗瘟發(fā)生情況，這為稻瘟病抗性鑒定效率的提高提供了參考。

抗病育種是控制稻瘟病最綠色、經(jīng)濟(jì)和安全的方法，抗病基因的有效利用是抗病育種的關(guān)鍵。了解當(dāng)前浙江省主栽品種中抗病基因的構(gòu)成及與抗性水平的相關(guān)性，可為抗病品種的合理布局及提高抗病育種的可預(yù)見(jiàn)性提供依據(jù)。本研究以63 個(gè)浙江省主栽品種為材料 ， 利 用 Pi1、Pi5、Pi2、Pi9、Pia、Pizt、Pigm、Pib、Pik 和Pikh 等10 個(gè)抗病基因的分子標(biāo)記，分析這些抗病基因在主栽品種中的分布規(guī)律以及其對(duì)葉瘟和穗瘟抗性的貢獻(xiàn)。Pigm 和Pi9 在63 個(gè)材料占比比較少，檢出率只有3.2%，其他抗病基因檢出率都在50.0%左右。Pigm、Pi1 及Pib 與葉瘟抗性存在顯著及以上的正相關(guān)性，Pi9、Pi1、Pib 和Pia 對(duì)穗瘟抗性存在顯著及以上的正相關(guān)性，暗示著使用這些抗病基因進(jìn)行水稻新品種培育將有效降低稻瘟病的發(fā)生。

抗病基因間復(fù)雜的互作關(guān)系使得育種家進(jìn)行多個(gè)抗病基因聚合時(shí)需要注意所聚合基因的主效性和正向性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pigm 與 Pib、Pi2 與 Pi1、Pi2 與 Pib、Pi1 與 Pik、Pi1 與 Pib 以及 Pikh 與 Pib 之間是正向顯著相關(guān)，而Pizt 與Pi2、Pizt 與Pi1 是負(fù)向極顯著相關(guān)，這些結(jié)果為未來(lái)多個(gè)抗病基因聚合提供了重要參考。Pi9對(duì)穗瘟抗性具有重要貢獻(xiàn)，Pigm 對(duì)葉瘟具有重要的貢獻(xiàn)，而Pi9 和Pigm 在本研究63 個(gè)主栽品種中檢出率比較低，說(shuō)明Pigm 和Pi9 基因在浙江省抗性育種中還有利用空間。關(guān)注這2 個(gè)基因的分子選擇育種可能有助于進(jìn)一步提高新品種的抗病性。