人乳活性成分—骨橋蛋白研究進展

朱 婧 綜述 汪之頊 陳同辛 審校

1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院北京市營養(yǎng)源研究所（北京 100069）；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系（江蘇南京 211166）；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心免疫科（上海 200127）

母乳可提供嬰兒生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，特別是一些與免疫保護密切相關(guān)的功能成分，包括蛋白質(zhì)類，如乳鐵蛋白（lactoferrin）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）；脂類，如1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride，OPO）、乳源神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides milk origin，gsMO），以及母乳低聚糖（human milk oligosaccaride，HMO）等。OPN是近年來備受關(guān)注的一種高度磷酸化，具有O-糖基化修飾的酸性蛋白質(zhì)。人乳中富含分泌型OPN，是重要的生物活性成分。近年來的研究發(fā)現(xiàn)人乳OPN在生命早期的腸道生長、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用，因此也稱為OPN活性蛋白。OPN與其他人乳活性成分，如OPO、gsMO等構(gòu)成的免疫保護效應(yīng)也逐漸引起學(xué)者關(guān)注。本文就乳汁中OPN 對生命早期嬰幼兒生長發(fā)育和健康作用作一介紹。

1 乳汁中的OPN

OPN曾被稱為骨唾液酸糖蛋白1（bone sialoprotein 1，BSP-1），由位于4 號染色體q 13 的單一拷貝基因SPP 1 編碼，人乳中的OPN 由298 個氨基酸組成。OPN含有以谷氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）為特征的特殊結(jié)構(gòu)序列，RGD序列是促進細胞黏附蛋白質(zhì)的特有結(jié)構(gòu)。人乳OPN 的相對分子質(zhì)量約44 000，其大小取決于其翻譯后的修飾程度[1]。人乳OPN 的翻譯后修飾以高度磷酸化和糖基化修飾為主要特征，包括36個磷酸化位點和5個O-糖基化位點，磷酸化位點占有率在不同泌乳時期存在差異。由于O-聚糖的末端存在唾液酸化，OPN也被稱為唾液酸糖蛋白。研究表明，糖基化可以影響磷酸化，還可以影響OPN的細胞黏附活性[2]。

OPN可由體內(nèi)多種組織細胞合成或分泌，廣泛存在于骨、腎、腦、肌肉等多種組織和細胞中，包括存在于體液中的分泌型OPN和免疫細胞中的細胞內(nèi)OPN。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，乳汁尤其是初乳中分泌型OPN的含量非常高，是重要的人乳活性成分[3]。3 月齡嬰兒血漿和臍帶血漿中OPN的濃度分別為342 ng/mL、263 ng/mL，是成人血漿OPN 濃度（35 ng/mL）的7～10 倍。隨著嬰兒月齡增加，人乳中OPN 的含量呈逐漸下降趨勢[4]。研究發(fā)現(xiàn)，人乳OPN 含量在不同國家和個體間具有較大差異，中國母親人乳中OPN 含量（266.2 mg/L）明顯高于韓國（216.2 mg/L）、日本（185 mg/L）和丹麥（99.7 mg/L）母親；另外，中國母親人乳OPN 占總蛋白的比例（2.7%），也高于韓國（1.8%）、日本（2.4%）和丹麥（1.3%）母親[4]。同一國家不同母親乳汁中OPN含量差異也比較大。導(dǎo)致乳汁中OPN含量差異的原因尚不清楚，可能是種族和環(huán)境（飲食、地理因素等）共同影響所致[4]。

不同物種乳汁中的OPN 含量也存在巨大差異。人乳OPN 平均濃度（138 mg/L），明顯高于牛乳（18 mg/L），以牛乳為基礎(chǔ)的未強化OPN的嬰兒配方粉中的OPN含量也很低[3]。在氨基酸序列、磷酸化和糖基化修飾位點等方面，牛乳和人乳OPN具有許多相似性。牛乳OPN 含有262 個氨基酸，其中182 個氨基酸與人乳OPN 相同（61%），另外還有44 個氨基酸具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。此外，牛乳OPN也同樣具有磷酸化和O-糖基化的翻譯后修飾，且具有相同的RGD序列。不同的是，與人乳OPN相比，牛乳OPN的磷酸化位點和O-糖基化位點較少，分別為28個和3個，但其中25個磷酸化位點以及所有的O-糖基化位點均與人乳OPN相同[1-2]。

OPN 在臍帶血、嬰兒血漿、乳汁尤其是初乳中的含量非常高，提示OPN對生命早期的生長發(fā)育和健康具有非常重要的意義。人乳中的OPN 以完整或OPN多肽的狀態(tài)混合存在。人乳中天然存在的蛋白酶，如纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、凝血酶和組織蛋白酶D等，可水解OPN 產(chǎn)生不同的OPN 多肽，這些多肽可以與一系列整聯(lián)蛋白結(jié)合發(fā)揮不同功能[1]。牛乳OPN 與人乳OPN 具有相似性，也可在蛋白酶的作用下產(chǎn)生具有整聯(lián)蛋白結(jié)合作用的OPN 多肽[1,5-7]。進入腸道后，OPN 可以部分耐受消化酶、胃酸的分解，完整的OPN 或OPN 多肽進入腸道后被吸收，發(fā)揮生物學(xué)作用[5-7]。目前有關(guān)乳汁OPN相關(guān)研究涉及早期腸道生長、免疫調(diào)節(jié)、髓鞘化等[8]。

2 OPN與腸道增殖和成熟以及腸道微生態(tài)

完整或部分消化的OPN 可與腸上皮細胞細胞膜上的受體結(jié)合，激活細胞信號通路，從而在腸道內(nèi)發(fā)揮多重功能。在對經(jīng)OPN 基因敲除處理后母鼠及其所產(chǎn)仔鼠的研究中，將母鼠及仔鼠隨機分為，OPN基因敲除母鼠照護組、野生型母鼠照護組和OPN 基因敲除母鼠照護同時聯(lián)合牛乳OPN 喂養(yǎng)組（bmOPN），bmOPN 組每天補充牛乳OPN（濃度12 μg/g）；仔鼠喂養(yǎng)10天后取小腸，發(fā)現(xiàn)bmOPN組和野生型母鼠照護組仔鼠的小腸絨毛高度以及隱窩深度均顯著高于OPN 基因敲除母鼠照護組仔鼠，說明OPN 能刺激人隱窩狀上皮細胞的增殖，有助于促進仔鼠小腸黏膜的生長發(fā)育，增加小腸黏膜表面積，且牛乳OPN與鼠乳OPN 對仔鼠有同樣的效應(yīng)[9]。鑒于OPN 結(jié)合位點在不同物種間保守，牛乳OPN對人類嬰兒也可能發(fā)揮其生物活性。

在對牛乳OPN 增強腸道細胞增殖的潛在機制研究中，采用微陣列分析（illumina）顯示，牛乳OPN 可顯著修飾與細胞增殖和免疫功能密切相關(guān)的基因，如MAPK 13、CCNE 1、CdGAP、CXCL 10、IL 6 ST 和NFκB，OPN可通過整合素信號通路調(diào)控小腸基因表達，通過整聯(lián)蛋白受體結(jié)合和增殖來調(diào)節(jié)細胞遷移和細胞趨化性，從而說明OPN對新生兒腸道增殖和成熟的直接作用[9]。還有研究顯示，牛乳OPN可通過腸道上皮細胞（Caco-2）上調(diào)IL-18分泌，從而增強腸上皮細胞（Caco-2）的分化并刺激腸道免疫功能[10]。此外，新生恒河猴分別給予恒河猴乳、普通配方以及添加OPN配方（125 mg/L）喂養(yǎng)3個月，比較各組嬰猴的空腸轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示添加OPN 配方組的空腸轉(zhuǎn)錄組與恒河猴乳組更相似，說明OPN可通過整合素和CD44受體刺激涉及細胞增殖、遷移、存活和信號通路的基因表達[11]。

OPN 在維持腸道黏膜完整中也起著至關(guān)重要的作用。在以葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠模型中，OPN 基因敲除鼠比對照鼠的腸黏膜炎癥活動指數(shù)加重，且腸黏膜中occludin蛋白表達減少，而occludin蛋白是保證細胞間緊密連接的重要成分，是維持腸黏膜完整性的重要因素[12]。動物研究還顯示，OPN可以通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來減輕大腸桿菌黏多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的小鼠腸道炎癥[8-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，OPN還可以改變腸道菌群而影響腸道微生態(tài)。接受牛乳OPN喂養(yǎng)的仔豬腸腔中丙酸、戊酸和異丁酸的相對比例變化明顯[13]。此外，在對早產(chǎn)豬的研究中還發(fā)現(xiàn)，OPN有減低剖宮產(chǎn)早產(chǎn)仔豬的壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生率的趨勢，同時疾病嚴(yán)重度明顯減輕[14]。

3 OPN與免疫發(fā)育

OPN在多種免疫細胞中分泌，比如活化的T細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞，被認為是一種細胞因子樣分泌蛋白。分泌型OPN 和細胞內(nèi)OPN都在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

早在1998 年就有研究發(fā)現(xiàn)，OPN 注入大鼠真皮質(zhì)，可以誘導(dǎo)巨噬細胞向注射處聚集，且積聚的細胞表面大都高表達OPN受體，且這種局部浸潤作用可被抗OPN中和抗體明顯抑制。2009年研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞表面高度表達的αXβ2整合素（CD11c/CD18）是一種新型OPN 受體，分泌型OPN 與其結(jié)合后可以發(fā)揮調(diào)節(jié)巨噬細胞趨化、黏附、浸潤和吞噬的作用，闡明了OPN 在固有免疫中的重要功能。OPN 還可促進樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的激活、遷移，有利于DCs從外周向次級淋巴器官遷移；OPN誘導(dǎo) DCs表達人白細胞DR抗原（HLA-DR），使得DCs刺激能力增強。此外，OPN還可通過與 CD44和整合素受體的相互作用，調(diào)控 DC細胞從表皮向淋巴結(jié)回流。同時，在1998年就發(fā)現(xiàn)OPN 可能在促進B 細胞增殖和分化以及自身抗體產(chǎn)生中起重要作用。OPN首先刺激產(chǎn)生抗CD3抗體，進而誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生CD40L和IFN-γ，增強T、B細胞之間的作用，在調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)OPN可通過將肥大細胞限制在炎癥部位并抑制IgE誘導(dǎo)的肥大細胞因子釋放來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫[1,7,15]。

臨床隨機對照研究也顯示OPN 對嬰兒免疫的調(diào)節(jié)作用。在一項隨機對照試驗中，納入240 例1～6 月齡配方喂養(yǎng)健康足月兒，隨機分為標(biāo)準(zhǔn)配方組（SF）和添加牛乳OPN 配方組，分別添加OPN 65 mg/L 或130 mg/L（F65，F(xiàn)130，人乳平均OPN濃度的50%和100%），另設(shè)置母乳喂養(yǎng)對照組（BF，80例）；評估各組嬰兒在1、4、6 月齡時的生長發(fā)育、健康狀況及血生化指標(biāo)；結(jié)果顯示，添加牛乳OPN 配方組（F 65，F(xiàn) 130）均具有良好的耐受性，嬰兒體格生長與SF 組無差異；F 130 組與SF 組相比，嬰兒發(fā)熱減少；同時，F(xiàn) 130 組的血漿蘇氨酸及支鏈氨基酸水平低于SF 組及F 65 組，更接近BF 組；F 65 組和F 130 組的促炎細胞因子TNF-α 顯著低于SF 組[16]。進一步研究顯示，F(xiàn) 130 組的外周血T 細胞和單核細胞比例高，更接近BF 組，顯示OPN 在生命早期免疫調(diào)節(jié)方面的效應(yīng)[17]。

4 OPN與神經(jīng)系統(tǒng)

除了對生命早期腸道增殖和成熟、免疫發(fā)育的作用，OPN對生命早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也有重要作用。小鼠研究顯示，OPN通過促進髓鞘形成而在生命早期大腦發(fā)育和行為發(fā)育中發(fā)揮重要作用。將新生小鼠分組后，分別由OPN敲除母鼠（OPN敲除母鼠乳汁中無OPN）及對照母鼠喂養(yǎng)，出生第6天和第8天時，OPN敲除組小鼠大腦OPN水平顯著下降；同時對照組小鼠髓鞘相關(guān)蛋白的表達增加，NG-2 膠質(zhì)細胞向少突膠質(zhì)細胞增殖和分化增強，并伴隨著ERK-1/2和P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的增加；行為測試顯示OPN敲除組小鼠的記憶力和學(xué)習(xí)能力受損[18]。

對仔豬的研究也得出了類似的結(jié)論，將21 只產(chǎn)后第2 天的仔豬隨機分為大豆分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)代乳品喂養(yǎng)的對照組（11 只）、相同飲食強化OPN 的試驗組（10只），喂養(yǎng)至出生34天，并在28～32天時進行認知測試和大腦磁共振成像以評估大腦發(fā)育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組仔豬的認知測試并未表現(xiàn)出明顯差異，但OPN組仔豬的胼胝體、側(cè)腦室、左右內(nèi)囊、左右蒼白球、右海馬和右大腦皮質(zhì)的體積均顯示大于對照組，提示OPN影響仔豬腦結(jié)構(gòu)發(fā)育，并對仔豬的行為有一定的影響[13]。

綜上，OPN 作為重要的母乳活性成分，在生命早期的生長發(fā)育和健康中發(fā)揮重要作用，如促進腸道增殖和成熟、免疫發(fā)育和調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)育等。隨著對人乳活性成分的研究擴展和深入，多種母乳活性成分的聯(lián)合應(yīng)用已成為嬰兒配方食品的主流發(fā)展方向。OPN與母乳中的其他活性成分，如gsMO、OPO等組合，通過不同機制共同作用，幫助嬰幼兒從局部腸道到全身免疫，構(gòu)建立體免疫保護系統(tǒng)。