分子育種技術(shù)在水貂毛絨品質(zhì)性狀相關(guān)基因中的應(yīng)用進(jìn)展

劉琳玲，宋姍姍，宋興超，王桂武※，張如，叢波

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；吉林省特種經(jīng)濟(jì)生物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

FAO曾預(yù)測(cè)，21世紀(jì)80%的生物育種將依賴分子育種[1]。當(dāng)前，分子標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection,MAS）是最主要的動(dòng)物分子育種手段，通過(guò)找到與目標(biāo)性狀相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，分析其基因型，進(jìn)而對(duì)該物種相關(guān)性狀進(jìn)行遺傳改良[2]。分子輔助育種可以高效篩查與質(zhì)量性狀相關(guān)的基因組區(qū)域（quantitative trait locus,QTL），采用多態(tài)DNA標(biāo)記繪制遺傳圖譜，如微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism,SNP）[3]，篩查得到的變異位點(diǎn)，將其與個(gè)體質(zhì)量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到的結(jié)果可以加速育種進(jìn)程，使優(yōu)良個(gè)體被快速識(shí)別[4]。

水貂是極其珍貴的毛皮動(dòng)物，被毛顏色是其貂皮價(jià)值最重要的指標(biāo)。宋興超[5]對(duì)黑色、白色和灰色被毛表型的水貂皮膚樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組序列測(cè)定，結(jié)果找到17個(gè)參與水貂被毛色素沉積過(guò)程的差異表達(dá)基因。動(dòng)物毛色主要由真黑色素與褐黑色素的合成比例、數(shù)量及其在毛皮質(zhì)和髓質(zhì)中沉積的種類與數(shù)量不同所決定且由這些基因共同調(diào)控[6]。

水貂皮被稱為“裘皮之王”，其特點(diǎn)是絨毛非常豐厚且輕柔結(jié)實(shí)[7]。目前，對(duì)于水貂毛絨品質(zhì)的性能測(cè)定主要有兩種方式，一種是皮張分等與分級(jí)；另一種是活體打分。皮張的分等與分級(jí)是指送到拍賣行，依據(jù)已定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)分類，根據(jù)皮張外部質(zhì)量和特點(diǎn)歸類?；铙w的性能測(cè)定主要包括體長(zhǎng)、清晰度、光澤度、毛密度、針毛覆蓋率和整體毛絨質(zhì)量。在水貂育種中，與活體毛皮等級(jí)及干皮品質(zhì)相關(guān)的性狀均處于強(qiáng)選擇狀態(tài)[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)這些毛絨品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳力為0.06～0.30[8]。另一項(xiàng)研究報(bào)道了這些相關(guān)性狀的遺傳力為0.15～0.43[9]，由于水貂毛絨品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳選擇力較大，即變異系數(shù)較大，因此可以通過(guò)個(gè)體選育進(jìn)行選擇。在傳統(tǒng)的水貂養(yǎng)殖過(guò)程中，生產(chǎn)群體的親本是根據(jù)毛皮質(zhì)量來(lái)選擇的，而經(jīng)濟(jì)回報(bào)的多少則取決于干皮品質(zhì)的高低[8]。因此，有必要對(duì)活體動(dòng)物的性狀（如體重和體長(zhǎng)）和毛皮品質(zhì)性狀進(jìn)行研究。本研究綜述分子育種技術(shù)在水貂毛絨品質(zhì)性狀相關(guān)基因中的應(yīng)用，以期為進(jìn)一步加快高毛絨品質(zhì)的優(yōu)良水貂品種的選育提供理論依據(jù)。

1 分子育種技術(shù)在水貂毛色性狀相關(guān)基因中的應(yīng)用

動(dòng)物被毛顏色已成為一種重要的育種性狀。1931年首次報(bào)道水貂毛色突變體，其為孟德?tīng)柍Ｈ旧w隱性遺傳，特征毛皮顏色為銀藍(lán)色[10，11]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)與被毛顏色相關(guān)的功能基因，包括黑素皮質(zhì)激素受體-1（melanocortin 1 receptor,MC1R）基因、酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（tyrosinase-related protein 1,TYRP1）基因、刺鼠信號(hào)蛋白（agouti signaling protein,ASIP）基因、黑素親和素（melanophilin,MLPH）基因和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia associtated transcription factor,MITF）基因。

MC1R是G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupled receptor,GPCR）家族最小的受體，在色素合成過(guò)程中起開(kāi)關(guān)作用，能與-黑色素細(xì)胞刺激素（-MSH）結(jié)合，最終活化酪氨酸激酶[12，13]，通過(guò)調(diào)控真黑色素與褐黑色素的濃度比例，使動(dòng)物毛色分別表現(xiàn)出黑色、棕色、紅色和黃色[10]。宋興超[5]采用PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序技術(shù)檢測(cè)水貂MC1R基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)SNPs，發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)上游存在1個(gè)缺失突變g.132_135 delAGTG，其突變基因型在金州黑水貂、吉林白水貂、銀藍(lán)水貂和咖啡水貂4種毛色群體中差異極顯著（P＜0.0001）。推測(cè)該位點(diǎn)可能與水貂毛色表型具有相關(guān)性，其中銀藍(lán)水貂中突變雜合體的基因型頻率最高，說(shuō)明該突變位點(diǎn)可能影響銀藍(lán)水貂被毛顏色的主控位點(diǎn)。

TYR蛋白由調(diào)控白化位點(diǎn)（Albino）的酪氨酸酶基因編碼，它在動(dòng)物體黑色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)量和活性直接影響黑色素生成的速度和產(chǎn)量，因此該基因的變異可影響動(dòng)物毛色性狀[14,15]。Anistoroaei等[16]推斷，在TYR基因的外顯子1中發(fā)現(xiàn)一處無(wú)義突變（138TGT→TGA），可能與丹麥水貂白化表型的產(chǎn)生具有相關(guān)性；Benkel等[17]在TYR基因外顯子4中發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNPs，c.1835C＞G位點(diǎn)與喜馬拉雅水貂被毛的大理石花紋形成相關(guān)；Blaszczyk等[18]研究發(fā)現(xiàn)TYR基因外顯子1的一處無(wú)義突變使編碼半胱氨酸的密碼子TGT變?yōu)榻K止子TGA，這一變異與美洲水貂白化相關(guān)。邢思遠(yuǎn)[19]采用Sanger直接測(cè)序法在紅眼白水貂、美國(guó)短毛黑水貂和銀藍(lán)水貂TYR外顯子1中發(fā)現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn)，c.78A＞T顛換與白色水貂毛色差異極顯著（P＜0.001)，TYR基因外顯子1中有1個(gè)SNPs（g.138TA）為無(wú)義突變，與吉林白水貂表型相關(guān)。這幾項(xiàng)研究結(jié)果一致，得出該基因的突變與水貂毛色的白化相關(guān)。宋興超等[20]采用PCRRFLP技術(shù)篩查不同被毛色型水貂T138A位點(diǎn)多態(tài)性并進(jìn)行分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)在5種毛色品種水貂中存在T和A這2個(gè)等位基因，可形成3種基因型：TT、TA和AA。其中吉林白水貂T138A位點(diǎn)AA基因型頻率最高，而在具有黑色被毛金州黑水貂群體中未檢測(cè)到該SNP位點(diǎn)。綜上，TYR基因的138TGT→TGA、c.78A＞T、T138A和外顯子4序列缺失這些變異可作為水貂白色表型育種的遺傳標(biāo)記。

美洲水貂TYRP1基因由7個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)編碼序列為1.6 kb，編碼537個(gè)氨基酸，形成不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)[21]，該蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)酪氨酸酶的活性，影響黑色素小體結(jié)構(gòu)和黑色素細(xì)胞的增殖與凋亡以及黑色素的合成[22]。Berryere等[23]研究發(fā)現(xiàn)褐色表型是由TYRP1基因的突變產(chǎn)生的。Kenny等[24]研究發(fā)現(xiàn)TYRP1基因的少量突變可導(dǎo)致人類眼皮膚白化病3型。Cirera等[25]發(fā)現(xiàn)TYRP1基因內(nèi)含子2中1個(gè)長(zhǎng)插入片段與美洲水貂帕洛米諾毛色表型存在關(guān)聯(lián)。綜上，一般認(rèn)為T(mén)YRP1基因是影響水貂毛色變淡的主效基因，下一步應(yīng)加大水貂群體數(shù)量，進(jìn)行該基因與水貂毛色相關(guān)變異位點(diǎn)的篩查工作，檢測(cè)到的變異位點(diǎn)可作為水貂毛色選育的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，從而加速新毛色和新品種水貂的培育。

Agouti是真黑色素與褐黑色素合成的開(kāi)關(guān)[26]。Agouti基因位點(diǎn)首次被發(fā)現(xiàn)是由于其對(duì)哺乳動(dòng)物被毛色素類型和時(shí)間沉積的影響[27]，現(xiàn)在已經(jīng)在小鼠的Agouti基因位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了許多突變，其中一些影響皮毛顏色。宋興超等[28]發(fā)現(xiàn)Agouti基因內(nèi)含子2上的SNPs（g.1189CT）的CT基因型與吉林白水貂被毛表型顯著相關(guān)；在內(nèi)含子3中的1個(gè)SNPs（g.252CT）位點(diǎn)CT基因型與珍珠水貂的毛色具有相關(guān)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs和2個(gè)缺失突變位點(diǎn)在不同毛色水貂群體中分別處于緊密連鎖狀態(tài)且可能與水貂淺色被毛表型相關(guān)。因此，水貂Agouti基因g.1189CT和g.252CT這兩個(gè)變異位點(diǎn)可能是影響美洲水貂被毛顏色的分子遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，這為研究美洲水貂毛色的選育奠定了理論依據(jù)。

最新研究針對(duì)兩種群美國(guó)水貂進(jìn)行了全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MLPH基因和MITF基因與銀藍(lán)水貂和黑眼白水貂毛色表型相關(guān)[29]。MLPH編碼黑素親和素參與黑素體運(yùn)輸?shù)腞ab蛋白并且能使黑素體結(jié)合的RAB27A基因和運(yùn)動(dòng)蛋白MYO5A相互作用，MLPH包含N-末端rab27結(jié)合域（RBD）、內(nèi)側(cè)肌O5A結(jié)合域（MBD）和C-末端肌動(dòng)蛋白結(jié)合域（ABD），增強(qiáng)了MLPH與MYO5A12的相互作用且C端域能與微管相關(guān)蛋白EB1[29,30]相互作用。成熟黑素小體在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)行是以RAB27A-MLPH-MYO5A三重復(fù)合體的形式[29]。研究發(fā)現(xiàn)，銀藍(lán)色水貂MLPH基因的外顯子7缺失，導(dǎo)致發(fā)生移碼突變和308位氨基酸變?yōu)榻K止密碼子[29]，該突變使蛋白缺失C端肌動(dòng)蛋白結(jié)合域和外顯子F結(jié)合域（EFBD），且兩者都是MYO5A結(jié)合域的組成部分。之前的研究表明，MBD的EFBD區(qū)域?qū)τ赗AB27A-MLPH-MYO5A三重復(fù)合體的形成是必需的，而MYO5A-MLPH的結(jié)合需要ABD區(qū)域[29]，因此MYO5A的功能缺失干擾了成熟黑素體向富含肌動(dòng)蛋白的黑素細(xì)胞樹(shù)突尖端的運(yùn)輸，導(dǎo)致毛色變淺。大量研究表明MLPH基因與銀藍(lán)色貂毛色具有相關(guān)性[29，30]，采用全基因組測(cè)序方法在MLPH基因剪接供體位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能導(dǎo)致功能喪失的單核苷酸變異GL896909.1:662639 G/A（MLPHC.901+1G＞a），該突變位點(diǎn)與銀藍(lán)水貂表型有關(guān)[29]。另外的研究也證實(shí)相同的結(jié)論，Cirera等[31]研究發(fā)現(xiàn)銀藍(lán)水貂MLPH蛋白的基因組序列中缺少內(nèi)含子7和部分內(nèi)含子8，在cDNA水平上缺少完整的外顯子8，導(dǎo)致其結(jié)合域非常短，造成MYO5A Va結(jié)合域的功能喪失。這一突變使黑素體在黑素細(xì)胞中分布減少，并最終導(dǎo)致淡銀藍(lán)色的被毛。此外，研究證實(shí)了之前關(guān)于水貂遺傳的信息，表明控制銀藍(lán)色的基因座存在不止一個(gè)等位基因[32]。進(jìn)一步采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism,SSCP）技術(shù)對(duì)我國(guó)遼西地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)色與深咖啡色水貂的MLPH基因外顯子進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，但未檢測(cè)到變異位點(diǎn)，分析認(rèn)為該基因在這兩種色型水貂個(gè)體間相對(duì)保守，也可能由于PCR-SSCP在方法上的局限，對(duì)于那些不影響單鏈構(gòu)象的SNPs，試驗(yàn)過(guò)程中也可能被漏掉[33]。綜上，可以針對(duì)MLPH基因進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）、微衛(wèi)星、PCR-SSCP和單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（SNPs）等多種分子標(biāo)記研究，從而找到影響水貂毛色的關(guān)鍵性突變，為培育出彩色水貂提供重要依據(jù)。

MITF基因的黑素細(xì)胞-特異功能異構(gòu)體MITF-M能影響神經(jīng)嵴源性黑素細(xì)胞的發(fā)育，使毛皮顏色發(fā)生白化，研究發(fā)現(xiàn)MITF的基因座與黑眼白水貂的表型具有相關(guān)性[32]。早期的研究并沒(méi)有在黑眼白水貂的MITF基因中篩查到變異位點(diǎn)，但最新研究發(fā)現(xiàn)MITF基因GL896899.1:18635719G/A位點(diǎn)的變異與黑眼白水貂被毛表型相關(guān)[29]。

2 分子育種技術(shù)在水貂針絨毛性狀相關(guān)基因中的應(yīng)用

毛絨品質(zhì)是毛的顏色和純度、毛的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度以及毛的密度等的綜合性狀，水貂的毛絨品質(zhì)由被毛密度、針毛和絨毛長(zhǎng)度、絨毛細(xì)度及針絨毛長(zhǎng)度比等因素決定。被毛密度是影響毛皮品質(zhì)的重要因素，被毛稀疏會(huì)讓毛皮看起來(lái)雜亂、無(wú)光澤[34]。為了得到較好針絨毛長(zhǎng)度的水貂后代，我們應(yīng)選育絨毛豐厚、長(zhǎng)度較長(zhǎng)的水貂親代，在冬毛期注重水貂的飼料營(yíng)養(yǎng)配比[35]。針絨毛長(zhǎng)度比應(yīng)適當(dāng)才可以保證毛皮的外觀和質(zhì)量。Cadieu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，影響水貂毛長(zhǎng)度、粗度和卷曲毛發(fā)變異的主效基因非常少。Thirstrup等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在9個(gè)常染色體上發(fā)現(xiàn)QTL對(duì)水貂毛長(zhǎng)度和毛密度均有影響。已有研究表明，犬的短毛比長(zhǎng)毛占優(yōu)勢(shì)，而長(zhǎng)毛性狀是由FGF5（fibroblast growth factor 5）基因突變引起的[38]。研究FGF5基因的BAC文庫(kù)發(fā)現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記（RAN110），其與被毛長(zhǎng)度性狀無(wú)顯著相關(guān)性。在水貂的11號(hào)染色體上，在RAN110標(biāo)記附近發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與被毛長(zhǎng)度性狀相關(guān)的QTL[39]。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（FGF5）是纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的一員，目前的研究認(rèn)為FGF5主要通過(guò)影響周期性活動(dòng)，控制毛囊從興盛期向休眠期轉(zhuǎn)換，最后影響了被毛的長(zhǎng)度[40]。Jin等[41]使用RNA-seq測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)通過(guò)促進(jìn)FGF5基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控絨山羊毛發(fā)的生長(zhǎng)發(fā)育。梁東[42]針對(duì)FGF5基因在不同品種水貂體組織中的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)FGF5基因mRNA在美國(guó)短毛黑色水貂中表達(dá)量要高于金州黑色標(biāo)準(zhǔn)水貂，并且金州黑色標(biāo)準(zhǔn)水貂較美國(guó)短毛黑水貂針毛長(zhǎng)差異極顯著（P＜0.01）。筆者得出FGF5基因的表達(dá)量與水貂針毛長(zhǎng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在犬的第13號(hào)染色體上有1個(gè)RSPO2（R-spondin2）基因，該基因可影響毛的細(xì)度，RSPO2基因位于水貂4號(hào)染色體上并檢測(cè)到一個(gè)可能影響水貂毛細(xì)度的數(shù)量性狀基因座[39]。下一步研究應(yīng)運(yùn)用PCR-RFLP分子育種技術(shù)篩查水貂FGF5基因和RSPO2基因與毛長(zhǎng)、毛細(xì)度性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)，上述突變位點(diǎn)可作為水貂毛長(zhǎng)性狀選育的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)一步加速水貂的育種工作。

3 小結(jié)與展望

毛絨品質(zhì)是毛皮動(dòng)物的重要生產(chǎn)性狀和主要育種目標(biāo)，也是一種可利用的遺傳標(biāo)記，在確定雜交組合、品種純度和親緣關(guān)系等方面均有一定的用途。另外，水貂皮的絢麗多彩和經(jīng)濟(jì)價(jià)值也存在直接的關(guān)系，可以根據(jù)人們的需要及毛皮市場(chǎng)行情，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)加快彩貂新品種的培育，毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也必將得到進(jìn)一步提高。

分子標(biāo)記輔助育種是篩選與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，是目前應(yīng)用最廣泛的分子育種方法。傳統(tǒng)育種是在表型上進(jìn)行選擇而不關(guān)注基因型的改變，而分子標(biāo)記輔助選擇育種則注重基因型的改變。傳統(tǒng)選育過(guò)程中由于表型較好，但基因型不穩(wěn)定的現(xiàn)象出現(xiàn)，導(dǎo)致后代發(fā)生性狀分離，難以培育優(yōu)良的品系。然而分子輔助選擇育種能夠突破這一限制，可快速穩(wěn)定地獲得優(yōu)良品系[43]。分子標(biāo)記雖然為水貂育種開(kāi)辟了一扇大門(mén)，但能否在育種實(shí)踐中發(fā)揮應(yīng)有的作用，還需要注意以下4個(gè)方面：是否能找到與目的基因性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記；是否能繪制遺傳標(biāo)記多態(tài)性豐富的遺傳圖譜；能否實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析分子標(biāo)記，簡(jiǎn)化試驗(yàn)，大大降低成本；是否能改進(jìn)預(yù)測(cè)育種值的方法。當(dāng)前，分子育種技術(shù)在水貂育種中取得了一定的成果，已經(jīng)篩查到大量的變異位點(diǎn)與水貂經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)，這些位點(diǎn)可作為分子標(biāo)記；利用微衛(wèi)星標(biāo)記、RAMP、PFLP和MAS技術(shù)進(jìn)行水貂遺傳多樣性的研究，為繪制遺傳標(biāo)記多態(tài)性豐富的遺傳圖譜提供理論數(shù)據(jù)；成功通過(guò)BLUP數(shù)字模型方法進(jìn)行水貂育種值預(yù)測(cè)，為下一步育種奠定理論基礎(chǔ)。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記將在水貂育種中占有重要地位。